Análise do volume do nódulo linfático por ultra-alta frequência ultrassom no modelo de camundongos geneticamente modificado braf/pten de melanoma

O melanoma é uma doença muito agressiva que rapidamente se espalha para outros órgãos. Este protocolo descreve a aplicação de imagens de ultrassom de ultra-alta frequência, juntamente com renderização 3D, para monitorar o volume dos linfonodos inguinais no modelo de camundongo Braf/Pten de melanoma metastático.

Tyr::CreER+,^{BrafCA/+,Ptenlox/lox} camundongos geneticamente modificados (camundongos Braf/Pten) são amplamente utilizados como um modelo in vivo de melanoma metastático. Uma vez que um tumor primário tenha sido induzido pelo tratamento de tamoxifen, um aumento da carga metastática é observado dentro de 4-6 semanas após a indução. Este artigo mostra como imagens ultra-altas de frequência ultra-alta-freqüência ultrasound (UHFUS) podem ser exploradas para monitorar o aumento do envolvimento metastático dos linfonodos inguinais medindo o aumento de seu volume.

O sistema UHFUS é usado para digitalizar camundongos anestesiados com uma sonda linear UHFUS (22-55 MHz, resolução axial de 40 μm). As imagens do modo B dos linfonodos inguinais (ambos os lados esquerdo e direito) são adquiridas em uma visão de eixo curto, posicionando os animais em recumbência dorsal. Os registros de ultrassom são adquiridos usando um tamanho de passo de 44 μm em um braço mecânico motorizado. Posteriormente, aquisições bidimensionais (2D) do modo B são importadas para a plataforma de software para pós-processamento de imagens de ultrassom, e os linfonodos inguinais são identificados e segmentados semi-automaticamente nas imagens 2D transversais adquiridas. Finalmente, uma reconstrução total do volume tridimensional (3D) é obtida automaticamente juntamente com a renderização do volume do linfonodo, que também é expressa como uma medição absoluta.

Esta técnica in vivo não invasiva é muito bem tolerada e permite o agendamento de múltiplas sessões de imagem no mesmo animal experimental ao longo de 2 semanas. É, portanto, ideal avaliar o impacto do tratamento farmacológico sobre a doença metastática.

O melanoma é uma forma agressiva de câncer de pele que muitas vezes se espalha para outros locais de pele (metástases subcutâneas), bem como para linfonodos, pulmões, fígado, cérebro e ^ossos1. Na última década, novos medicamentos foram introduzidos na prática clínica e contribuíram para melhorar a expectativa de vida de pacientes com melanoma metastático. No entanto, permanecem limitações, incluindo tempo variável e grau de resposta, efeitos colaterais graves e a insurgência da resistência ^adquirida1. Portanto, é crucial detectar a propagação metastática em seus estágios iniciais, ou seja, quando chega aos linfonodos locais.

Uma biópsia dos linfonodos locais (linfonodos sentinelas) é geralmente realizada para verificar a presença de células de melanoma. No entanto, a imagem de ultrassom está tomando conta como um método não invasivo de detecção de envolvimento metastático, pois supera a avaliação clínica e pode ajudar a evitar uma biópsia ^{desnecessária2,3,4}. Além disso, a imagem de ultrassom parece apropriada para a vigilância de linfonodos, especialmente no caso de idade avançada e/ou comorbidades5,6. As características detectadas pela análise do ultrassom e permitem a diferenciação entre linfonodos normais e metastáticos compreendem aumento de tamanho (volume), mudança de forma de oval para redondo, margem irregular, padrão ecogênico alterado e vascularização ^alterada7.

Tyr::CreER+,^{BrafCA/+,Ptenlox/lox} camundongos geneticamente modificados (camundongos Braf/Pten) foram recentemente disponibilizados para a comunidade científica como um modelo específico de tecido e indutível para melanoma ^{metastático8}. Neste modelo animal, os tumores primários desenvolvem-se muito rapidamente: tornam-se visíveis dentro de 2-3 semanas após a indução da mudança de braf tipo selvagem (wt) para BrafV600E e da perda de Pten, enquanto atingem um volume de 50-100 ^mm3 dentro de 4 semanas. Nas 2 semanas seguintes, o crescimento do tumor primário é acompanhado por um aumento progressivo da carga metastática em outros locais de pele, linfonodos e pulmões.

Os camundongos Braf/Pten têm sido amplamente utilizados para múltiplos propósitos, incluindo a dissecção de vias de sinalização envolvidas na melanomagênese ^9,10, a identificação de células de melanoma de ^{origem11,12,13} e o teste de novas opções terapêuticas em termos de terapia direcionada e ^{imunoterapia8,14,15,16} . Especificamente, usamos camundongos Braf/Pten para demonstrar que listeria monocytogenes atenuada (Lmat) funciona como uma vacina anti-melanoma. Quando administrado sistematicamente no ambiente terapêutico, o Lmat não está associado à toxicidade geral, pois se acumula seletivamente em locais tumorais. Além disso, causa uma notável diminuição da massa primária de melanoma e uma redução da carga metastática nos linfonodos e pulmões. No nível molecular, o Lmat causa morte apoptótica de células de melanoma, o que se deve, pelo menos em parte, a atividades não autônomas de células (recrutamento no local de linfócitos CD4+ e CD8+ T)¹⁶.

Quando os camundongos Braf/Pten são usados para modelagem de melanoma, o crescimento de tumores primários e metástases subcutâneas pode ser monitorado por medidas de pinça. No entanto, o envolvimento de linfonodos e pulmões precisa ser investigado usando uma técnica alternativa, possivelmente uma não invasiva que permite aos pesquisadores seguir o mesmo animal ao longo do tempo. Este artigo descreve o uso de imagens de ultrassom (Figura 1), juntamente com uma análise volumétrica 3D subsequente dos dados obtidos, para o monitoramento longitudinal do aumento do tamanho (volume) de linfonodos inguinais.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano (protocolos animais nº 754/2015-PR e nº 684/2018-PR).

1. Indução de melanoma

NOTA: Tyr de seis semanas de idade::CreER+, BrafCA^/+,Ratos Ptenlox^/lox [B6.Cg-Braftm1Mmcm ^Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] foram usados neste estudo (ver a Tabela de Materiais).

1. Trate os camundongos com 4-hidroxitamoxifen (4-HT) aplicando 3 μL de 5 mM 4-HT em ~1 ^cm2 de pele raspada da parte superior das costas, como descrito anteriormente11,16,17, por 3 dias seguidos.
   NOTA: Isso ativará a enzima Cre e causará uma mudança de wt Braf para Braf600E e a perda de Pten. Estes dois golpes são suficientes para induzir a formação de melanoma.
2. Observe que os tumores primários se desenvolvem no local da pintura da pele em 2-3 semanas e atingem um volume de 50-100 ^mm3 em 4 semanas. Além disso, observe metástases para outros locais da pele, linfonodos e pulmões neste momento (_t0).
3. Use pinças para medir o volume do tumor primário e de metástases subcutâneas, e imagens de ultrassom para medir o volume dos linfonodos inguinais. Repita essas medidas após uma semana (_t1, 5 semanas após a pintura da pele) e após duas semanas (_t2, 6 semanas após a pintura da pele).
4. No último ponto, eutanize os ratos por dose excessiva com sevorane gasosa.
5. Analisar o tumor primário e os linfonodos por inspeção visual e, em seguida, extirá-los para estudos histológicos, conforme relatado ^em16.

2. Procedimento de imagem

1. Coloque o rato em uma câmara de indução para anestesia gasosa e forneça 3% de isoflurane em oxigênio puro até que o animal esteja totalmente anestesiado. Verifique a profundidade da anestesia por falta de resposta ao aperto da pata.
2. Transfira o animal para uma tábua aquecida - uma parte constitutiva da estação de imagem UHFUS - segurando o animal em uma posição supina. Use uma sonda retal lubrificada com geleia de petróleo para medir a temperatura corporal. Ajuste a temperatura da placa para manter a temperatura corporal do camundongo na faixa fisiológica (36 ± 1°C).
3. Umedeça os olhos do rato com pomada veterinária para evitar o ressecamento durante a anestesia. Fornecer gás narcótico (1,5% de isoflurane em oxigênio puro) através da máscara de nariz de um rato. Ajuste a porcentagem de isoflurane para manter a profundidade correta da anestesia.
4. Cubra as patas dianteiras e traseiras com pasta condutora e grave-as nos eletrodos da placa ECG embutidos na placa. Verifique se os parâmetros fisiológicos (frequência cardíaca, sinal de respiração e temperatura corporal do núcleo) são corretamente adquiridos e exibidos.
5. Remova o cabelo de ambas as áreas inguinais aplicando um agente depilatório e cubra-os com um meio de acoplamento acústico.
6. Fixar a sonda linear UHFUS (frequência central de 40 MHz) em um motor 3D especializado embutido na estação de imagem UHFUS, permitindo o movimento automatizado e stepwise da sonda.
7. Oriente corretamente e ajuste a posição da sonda de ultrassom para obter imagens de curto eixo do linfonodo inguinal (esquerda/direita) e coloque a região de interesse na zona focal.
8. Escaneie todo o volume do linfonodo inguinal como uma sequência de imagens do modo B 2D, como descrito ^{anteriormente18}. Adquira imagens em vários níveis do linfonodo por movimento linear do transdutor com tamanhos de passo em uma escala de micrômetro, para gerar dados 3D em termos de loops de cine de respiração e coração automaticamente.
9. Defina a gravação da imagem com os seguintes parâmetros: distância de varredura variando entre 2 e 5 mm (dependendo do tamanho do linfonodo); tamanho passo 44 μm, com um resultado de 46-114 passos de varredura/fatias de linfonodo e um tempo de aquisição de 1-3 min por animal. Armazene digitalmente as imagens adquiridas em formato bruto (DICOM) para mais análises offline.
10. No final da sessão de imagem, descontinua a anestesia gasosa e permita que o animal se recupere na placa de aquecimento em recumbência severa. Cuide do animal até que ele recupere a consciência suficiente para manter a posição propensa.

3. Pós-processamento de imagens de ultrassom

1. Abra o conjunto de dados de imagens DICOM 3D do linfonodo inguinal esquerdo/direito na plataforma de software para pós-processamento de imagens de ultrassom.
2. Segmentação:
   1. Selecione o Método multi-fatia para visualizar os quadros atuais e miniaturas de todos os quadros correspondentes a cada imagem capturada durante a aquisição 3D.
   2. Selecione a miniatura do primeiro quadro para carregá-la na exibição de contorno. Na visão de contorno, clique à esquerda no mouse para soltar pontos ao longo da borda do linfonodo. Uma vez definido o número de pontos desejado (faixa 10-15), clique com o botão direito do mouse para completar o contorno.
   3. Após o primeiro contorno ser concluído, use a exibição da miniatura para selecionar a próxima imagem para contorno. Se necessário, pule várias imagens (média de 3 quadros) entre contornos para reduzir o número de traços manuais necessários para cada volume 3D.
      NOTA: A plataforma de software para pós-processamento de imagens de ultrassom gerará automaticamente contornos entre traços manuais, reduzindo assim o tempo de análise.
   4. Repita este processo até que todo o volume tenha sido delineado. Uma vez concluído, clique em Concluir.
3. Geração do wireframe 3D e medição de volume:
   1. Enquanto estiver no espaço de trabalho da janela do modo 3D , clique no ícone de medição de volume abaixo da área de exibição da imagem para ativar a visualização da superfície.
      NOTA: A visualização de superfície cria uma exibição de compilação que mapeia o volume gerado pelo usuário para a imagem adquirida. A visão da superfície pode ser girada em qualquer posição desejada.
   2. Tome nota da medição de volume listada no canto inferior esquerdo da vista do cubo.
      NOTA: A segmentação e a geração de volume 3D também podem ser obtidas usando softwares e/ou softwares comerciais disponíveis gratuitamente para processamento geral de imagens. A partir da segmentação manual, o software deve fornecer uma descrição matemática e/ou pixel dos contornos do linfonodo. Estes contornos seriam combinados em um espaço 3D para renderizar a superfície externa dos linfonodos. Todas as etapas descritas no procedimento de imagem e no pós-processamento de imagens de ultrassom são resumidas na Figura 2.

Após a pintura da pele de Tyr:::CreER+,^BrafCA/+,Ptenlox^/lox ratos com 4-HT, a atividade cre é induzida, devido à qual há uma mudança no nível genômico de wt Braf para BrafV600E, enquanto Pten é perdido (Figura 3A). Em 2-3 semanas, camundongos desenvolvem tumores primários no local com 100% de penetração. Após quatro semanas a partir do tratamento 4-HT (_t0), os tumores primários atingem um volume de 50-100 ^mm3, e seu crescimento pode ser medido por pinças por mais 2 semanas ((_t1 e _t2; Figura 3B, painéis superiores). Pontos de tempo posteriores não podem ser alcançados porque o tumor se torna tão grande que os camundongos requerem eutanásia.

No que diz respeito à carga metastática, observa-se um aumento gradual da pigmentação nos linfonodos inguinais dentro de 4-6 semanas a partir do tratamento 4-HT (Figura 3B, painéis inferiores). Tal aumento na pigmentação deve-se à presença de depósitos de melanina, como pode ser confirmado pela hematoxilina e mancha de eosina realizadas sem remover a melanina. Por sua vez, os depósitos de melanina são invariavelmente devido à presença de células de melanoma metástase, como confirmado pela coloração imunohistoquímica (IHC) do antígeno melanoma MLANA e do BRAFV600E (Figura 3C).

O acúmulo de células de melanoma pigmentadas dentro de linfonodos inguinais é acompanhado por um aumento progressivo em seu volume, como evidente pela inspeção visual (Figura 3B, painéis inferiores). A imagem de ultrassom oferece a oportunidade única de quantificar esse aumento longitudinalmente, em cada rato experimental, como descrito ^{anteriormente16}. As medidas volumétricas, os resultados de segmentação e a renderização 3D, todas referentes a um caso representativo, são mostradas na Figura 4. O volume de cada linfonodo é obtido por segmentação manual das seções axiais adquiridas durante uma varredura 3D.

Ao final da fase de segmentação, todas as seções apresentam a sobreposição do contorno externo do linfonodo (Figura 4A). Estes contornos são conectados quadro por quadro na fase de renderização, e a superfície externa de todo o linfonodo é projetada no espaço 3D. Como exemplo representativo, a renderização 3D de um linfonodo inguinal direito analisado em _t0, _t1 e _t2 é mostrada na Figura 4B, Figura 4C e Figura 4D, respectivamente. O gráfico na Figura 4E quantifica o aumento do volume exibido pelos linfonodos inguinais esquerdo e direito do mesmo animal ao longo do tempo.

Figura 1: O sistema de imagem de ultrassom usado para monitorar o aumento do volume dos linfonodos inguinais no modelo de camundongos geneticamente modificados braf/Pten de melanoma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resumo passo a passo do procedimento de imagem e pós-processamento de imagens de ultrassom. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Inspeção visual e análises histológicas de linfonodos inguinais no modelo de melanoma metastático braf/pten indutível no camundongo. (A) A enzima Cre causa a troca de wt Braf em Braf600E e a perda de Pten (excisão de exons 4 e 5). Este sistema é específico do melanócito porque a expressão da enzima Cre está sob o controle do promotor da tyrosinase, uma enzima envolvida na síntese de melanina. Portanto, os dois hits oncogênicos estão restritos à linhagem melanocítica. Este sistema também é indutor porque a Cre é expressa como uma proteína de fusão com o receptor de estrogênio e requer pintura da pele com 4-HT para ser translocada para o núcleo, onde pode exercer sua função. (B) O aparecimento de tumores de melanoma primário (imagens superiores) e linfonodos inguinais (imagens inferiores) após 4, 5 e 6 semanas após o tratamento 4-HT (_t0, _t1 e _t2, respectivamente). Nos linfonodos, o aumento do acúmulo e tamanho da melanina é detectado pela inspeção visual. Barras de escala = 0,5 cm (imagens superiores); 0,2 cm (imagens inferiores). (C) Análises histológicas de linfonodos inguinais, 6 semanas após o tratamento 4-HT. (superior esquerdo) Coloração H&E: os depósitos de melanina são removidos incubando fatias com 1% de KOH e 3% _H2O2.  (superior direito) Detecção de melanina realizada pela coloração de H&E sem tratamento de 1% KOH e 3% de _H2O2. (inferior esquerdo) Detecção de MLANA por coloração de imunoperoxidase (substrato de cromosgênio DAB e contra-retenção de hematoxilina). (inferior direito) Detecção brafv600E por coloração imunoperoxidase (substrato de cromosgênico DAB e contra-retenção de hematoxilina). Para todos os painéis, ampliação original: 40x; barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: wks = semanas; wt = tipo selvagem; 4-HT = 4-hidroxitamoxifen; H&E = hematoxilina e eosina; DAB = 3,3'-diaminobenzidina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Medidas, segmentação e renderização 3D do volume dos linfonodos inguinais no modelo de melanoma metastático braf/pten indutível no mouse. (A) Sobreposição dos contornos externos do linfonodo inguinal direito em 4 seções representativas digitalizadas obtidas por segmentação manual. (B-D) Renderização do volume 3D do linfonodo inguinal direito, medido em 4, 5 e 6 semanas após o tratamento 4-HT (_t0, _t1 e _t2 pontos de tempo, respectivamente). O valor numérico do volume também é relatado (em ^mm3). (E) O volume do pontão esquerdo (círculo preto) e do direito (círculo branco) do mesmo animal nos pontos de tempo _t0, _t1 e _t2. Abreviaturas: 3D = tridimensional; 4-HT = 4-hidroxytamoxifen. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os dados obtidos neste estudo atestam a capacidade da ultrassom de monitorar o envolvimento metastático de linfonodos inguinais do modelo de camundongo Braf/Pten de melanoma metastático. Como mostrado ^{anteriormente16}, esta técnica é especialmente útil para avaliar a eficácia do tratamento medicamentoso. Isso porque permite o monitoramento da alteração no volume de linfonodos no mesmo animal ao longo do tempo, comparando as medidas coletadas no _{t1 andt2}  com as coletadas no _t0. Isso, por sua vez, contribui para um aumento da robustez dos resultados obtidos, pois a variabilidade entre camundongos e outros fatores que podem influenciar o tamanho do linfonodo basal são todos contabilizados. Além disso, a imagem de ultrassom permite o cumprimento do princípio 3R, reduzindo o número de animais por grupo experimental.

Em camundongos Braf/Pten, não apenas inguinal, mas também linfonodos braquiais e axilares são locais de propagação metastática. No entanto, é aconselhável focar em linfonodos inguinais porque os outros estão muito próximos ao local do tumor primário, o que geralmente altera sua localização e morfologia durante o desenvolvimento do próprio tumor primário. Alternativamente, linfonodos braquiais e axilares podem se tornar adequados para imagens de ultrassom se um local diferente de indução de tumor for escolhido, como orelhas ou ^patas8. No que diz respeito a outros locais metastáticos, os pulmões não podem ser estudados usando ultrassom, devido à presença de ar no tecido. Teoricamente, apenas metástases pulmonares superficiais que alcançavam a interface pleural poderiam ser visualizadas com essa técnica. Embora a tomografia micro computada/tomografia de emissão de pósitrons (CT/PET) possa ser usada em vez disso, essa abordagem tem várias desvantagens, incluindo altos custos e disponibilidade limitada. Além disso, sendo baseado em radiações ionizantes, o micro CT/PET dificilmente é compatível com medições longitudinais em vários pontos de tempo. Por outro lado, a imagem de ultrassom pode ser facilmente aplicada ao estudo de metástases subcutâneas e permite a medição tanto do volume quanto da ^{vascularização16}.

Se um período de 2 semanas for muito curto para apreciar os efeitos da droga em estudo, um local de indução mais periférico (por exemplo, a ponta da ^cauda9,11) ou um genótipo menos propenso a tumores (Tyr::CreER+,^BrafCA/+, ratos ^Ptenlox/+ em vez de Tyr::CreER+, ^BrafCA/+, ^Ptenlox/lox mice) poderiam ser ^{selecionados9} . Em ambos os casos, espera-se que o crescimento do tumor primário seja muito mais lento, permitindo o monitoramento da metástase por muito mais de 6 semanas após a indução com 4-HT.

Do ponto de vista mais técnico, é importante notar que a segmentação 2D de imagens de ultrassom é o passo mais crítico neste protocolo, pois pode afetar a medição do volume 3D. Felizmente, no modelo animal Braf/Pten, o contraste entre linfonodos e tecidos circundantes é bastante acentuado, de modo que o delineamento das bordas do linfonodo por segmentação manual é relativamente simples. No entanto, o processo de segmentação deve ser facilitado pela alta qualidade das imagens de ultrassom adquiridas pelo sonografista, que, por sua vez, deve ser altamente experiente e focado na aquisição da mesma projeção de ultrassom do linfonodo, mesmo em sessões de varredura realizadas em diferentes pontos de tempo.

A imagem de ultrassom no modo B não pode destacar diretamente as células cancerígenas; em vez disso, permite a inferência de sua presença a partir do aumento do volume de linfonodos inguinais. À luz dessas informações, recomenda-se que as imagens de ultrassom sejam acopladas à coloração adequada do IHC dos linfonodos, para que a presença de células cancerígenas possa ser confirmada a nível molecular. No entanto, um alargamento do linfonodo observado em um camundongo Braf/Pten induzido é tipicamente atribuível à propagação do câncer e não a alguma outra causa, por exemplo, uma infecção contínua. Isso é provável porque os camundongos experimentais usados para ultrassom são criados em condições controladas e são rotineiramente submetidos à triagem sanitária, de modo que a doença seja prontamente detectada e tratada.

Os autores não têm nada a revelar.

Os autores gostariam de agradecer a S. Burchielli (FTGM, Pisa) por sua ajuda com procedimentos animais. Este trabalho foi apoiado pelo ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica financiamento institucional para lp; MFAG #17095 concedido pela AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro ao LP.