Quantificação de proteínas solúveis vegetais e carboidratos digeríveis conteúdo, usando o milho (Zea mays) como um Exemplar

Os protocolos descritos neste documento fornecem uma metodologia clara e acessível para medir proteína solúvel e conteúdo digeríveis (não estruturais) hidrato de carbono em tecidos vegetais. A capacidade de quantificar estes macronutrientes de duas plantas tem implicações significativas para fazer avançar os campos de Fisiologia vegetal, ecologia nutricional, interações planta-herbívoro e ecologia alimentar-web.

Dados elementares são comumente usados para inferir a qualidade da planta como um recurso para herbívoros. No entanto, a omnipresença do carbono em biomoléculas, a presença de compostos contendo nitrogênio de plantas defensivas e variação na espécie-específicas correlações entre nitrogênio e planta proteica todos limitar a precisão dessas inferências. Além disso, pesquisa focada na planta e/ou fisiologia herbívoro exigem um nível de precisão que não é conseguido usando generalizada de correlações. Os métodos apresentados aqui oferecem pesquisadores um protocolo claro e rápido para medir diretamente proteínas solúveis vegetais e carboidratos digeríveis, os macronutrientes de duas plantas mais intimamente ligados ao desempenho fisiológico animal. Os protocolos combinam bem caracterizados ensaios colorimétricos com passos de digestão otimizada de plantas específicas para fornecer resultados precisos e reprodutíveis. Nossas análises de milho de diferente tecidos mostram que estes ensaios têm a sensibilidade para detectar a variação na planta proteína solúvel e conteúdo de carboidrato digerível através de múltiplas escalas espaciais. Estas incluem diferenças entre plantas em crescimento de regiões e variedades ou espécies de plantas, bem como dentro-planta diferenças no tipo de tecido e até mesmo posicional dentro do mesmo tecido. Combinar proteínas solúveis e teor de carboidrato digerível com dados elementares também tem o potencial de proporcionar novas oportunidades em biologia vegetal para conectar a nutrição mineral de plantas com processos fisiológicos de planta. Essas análises também ajudam a gerar os dados de carboidrato digerível preciso estudar ecologia nutricional, interações planta-herbívoro e dinâmica de comida-web, que por sua vez irá melhorar a fisiologia e a pesquisa ecológica e proteína solúvel.

Biomassa vegetal constitui a base de praticamente todos os alimentos terrestres-teias. Plantas adquirem elementos nutritivos do solo através de seus sistemas de raízes e utilizam a luz solar em seus tecidos foliares para sintetizar biomoléculas. Em particular, carbono e nitrogênio são usados para criar os carboidratos, proteínas (compostos de aminoácidos) e lipídios que são necessários para construir a biomassa de planta (Note-se que em plantas fisiologia "macronutrientes" o termo muitas vezes refere-se aos elementos do solo, tais como N, P, K e S, no entanto, ao longo deste trabalho este termo referiremos de biomoléculas, tais como proteínas, hidratos de carbono e lípidos). Quando herbívoros consomem material vegetal, os macronutrientes contidos nos tecidos da planta são discriminados em suas partes constituintes e usados para conduzir os processos fisiológicos do consumidor. Desta forma, macronutrientes de planta tem uma forte influência sobre a fisiologia do consumidor juntamente com implicações importantes para interações ecológicas de maior ordem e comida-web dinâmica.

Por todo o reino animal, a proteína solúvel e carboidratos digeríveis são os macronutrientes mais intimamente ligados à sobrevivência, reprodução e desempenho¹. Além disso, a maioria dos animais regula ativamente sua ingestão destes dois macronutrientes para atender suas demandas fisiológicas^1,2. Isto é particularmente verdadeiro para insetos herbívoros que detectar as concentrações de açúcares e aminoácidos em tecidos vegetais, que por sua vez direciona o comportamento alimentar. Como resultado, planta de proteína solúvel e conteúdo de carboidrato digerível tem desempenhado um papel forte na evolução das interações inseto-planta.

Enquanto dados na planta de proteína solúvel e conteúdo de carboidratos digeríveis são relativamente raros (mas veja^{6,7,8,9,10,11}), há uma preponderância de dados disponíveis sobre conteúdo elementar de planta (carbono, nitrogênio e fósforo). Em grande parte, isso ocorre porque elementos desempenham um papel primordial na nutrição mineral de plantas a^3,4,5. Onde os elementos são medidos, correlações têm sido utilizadas para extrapolar a quantidade de proteína solúvel e carboidratos de fácil digestão, mas cálculos precisos são frequentemente difíceis de obter. Por exemplo, é impossível usar o carbono como um indicador do teor de carboidrato digerível planta porque carbono ubiquitously presente em todos os compostos orgânicos. Existe uma forte relação entre nitrogênio elemental e teor de proteínas solúveis de planta, e factores de conversão de nitrogênio-para-proteína generalizadas são frequentemente utilizados. No entanto, há fortes evidências de que as conversões de nitrogênio-para-proteína são altamente específicas^12,13,14,15, fazendo o uso de conversão generalizada provável imprecisas. Devido a isso, fatores de conversão de nitrogênio para proteína muitas vezes falta precisão, particularmente para a medida em que é necessária para estudos nutricionais em herbívoros. Além disso, a presença de N-contendo planta aleloquímicos, tais como alcaloides e Glicosinolatos que muitas vezes são tóxicos para herbívoros, pode confundir estas conversões.

Aqui, oferecemos dois ensaios químicos para medir a concentração de proteínas solúveis e carboidratos digeríveis em tecidos vegetais. Estes ensaios são apresentados separadamente, mas sugere-se que eles ser usados simultaneamente para analisar as mesmas amostras da planta para realizar uma análise mais abrangente de macronutrientes da planta. Ambos utilizam metodologias semelhantes, consistindo de uma etapa de extração, seguida de quantificação através de absorvância. Preparação de amostra de planta também é idêntica para ambos os protocolos, tornando mais fácil para executar ambas as análises em tandem. O utilitário destes ensaios não derivam de sua novidade, como eles dependem mais velhos, (Bradford, Jones, Dubois) ensaios colorimétricos bem-estabelecida^16,17,18, mas aqui nós organizaram uma clara e fácil de seguir protocolo que combina esses métodos com extração vegetal específico mais obscuras técnicas^17,19 a fim de fazer a aplicação destes ensaios mais acessível para aqueles em domínios relevantes para a planta.

Para ambos os ensaios, a planta macronutrientes primeiro são extraídos fisicamente pelo congelamento, liofilização, o material de planta de moagem. Para o ensaio de proteína solúvel, mais extração química é feita de^17,19 através de várias rodadas de utilização do Vortex e aquecimento de amostras em solução de NaOH. O bem conhecido ensaio de Bradford, utilizando G-250 azul brilhante de Coomassie, é usado para quantificar proteínas solúveis e polipeptídeos entre 3.000-5.000 Daltons^16,17. Este ensaio tem um alcance de deteção entre 1-20 µ g de proteínas totais por microplaca bem ou < 25 µ g/mL, mas não faz não medida ácidos amino livres. A etapa de extração do ensaio do carboidrato digerível é baseada no método de ácido diluído de Smith et al ²⁰ e permite o isolamento de açúcares solúveis, amido e fructosan – mas os carboidratos não estruturais. Um método de quantificação de ácido sulfúrico de fenol é tirado de Dubois et al . ¹⁸ e mede todos os mono-, oligo- e polissacarídeos (bem como derivados metil). Este ensaio é capaz de quantificar os açúcares específicos, mas aqui nós usá-lo como um indicador do teor de carboidrato digerível total (ver Smith et al. ²⁰ para análise mais detalhada). Juntos, estes ensaios medem os dois macronutrientes que são fortemente amarrados para plantar desempenho ecofisiologia e herbívoro, fornecendo dados importantes sobre a qualidade de recurso na base de teias de alimento terrestres. Apresentar estes protocolos promove a geração de datasets de macronutrientes de planta, a fim de obter uma compreensão mais profunda de Fisiologia vegetal, ecologia nutricional herbívoro e interações planta-herbívoro.

1. coleta e processamento de plantas

1. Coletar e processar amostras de planta
   1. Depois de coletar amostras de plantas, congelam amostras mergulhando material vegetal em nitrogênio líquido com fórceps e loja a-80 ° C. Se as amostras de plantas coletadas são grandes demais para congelar, esfriar rapidamente as amostras usando gelo seco e a transferência para um freezer-80 ° C, logo que possível. O conteúdo de macronutrientes de material vegetal pode alterar depois tecidos são separados da planta, por isso é importante congelar amostras de planta logo que possível após a coleta.
      Atenção: Nitrogênio líquido pode causar graves queimaduras quando em contacto com a pele. Por favor, certifique-se de transporte de nitrogênio líquido em recipientes aprovados e usar EPI adequado durante sua manipulação, incluindo cryo-luvas, olho googles, protetor facial, avental e um jaleco.
   2. Lyophilize material de planta usando um Liofilizador para garantir que os tecidos são metabolicamente inativos, enquanto a água está sendo removida. Estabiliza a seco até que a massa da amostra para assegurar que toda a água foi removida.
   3. Uma vez que as amostras estão secas, Triture em um pó fino usando um moedor ou moinho. Armazenar as amostras em um armário de dessecantes até análise.

2. ensaio da proteína solúvel

1. Preparação da amostra
   1. Amostras de cada tecido, cerca de 20 mg cada, pesar em rótulo tubos e tubos de poliestireno microcentrifuga de 1,5 mL. Estas amostras serão posteriormente referidas como amostras desconhecidas. Grave a massa exata de cada amostra, como essa informação será necessário para calcular a % de proteína solúvel em cada amostra desconhecida. Use microcentrifuga tubos com tampas de bloqueio, como tampas sem bloqueio podem abrir durante a etapa de aquecimento subsequente, resultando em perda da solução de amostra.
2. Solubilizar e isolar proteínas da amostra desconhecida
   1. Usando uma micropipeta, adicione 500 µ l de 0.1 M NaOH para cada tubo. Feche as tampas firmemente e proceda à sonicação durante 30 minutos. Pré-aqueça a água quente do banho 90 ° C.
      Atenção: Hidróxido de sódio é uma base forte e pode causar queimaduras quando em contacto com a pele. Apesar de 0.1 M NaOH representa uma baixa concentração, use luvas protetoras para evitar irritação da pele.
   2. Colocar os tubos em um rack no banho de água quente durante 15 minutos.
   3. Centrifugar tubos a 15.000 x g durante 10 minutos. Pipete o sobrenadante para novos tubos de microcentrifuga rotulado, usando uma ponta de pipeta nova para cada amostra. Adicione 300 µ l de 0.1 M NaOH ao tubo contendo o pellet e centrifugar novamente a 15.000 x g durante 10 minutos. Mais uma vez, recolher o líquido sobrenadante e combiná-lo com o sobrenadante da mesma amostra. Este é um potencial ponto de parar, e as amostras podem ser armazenadas a 4 ° C durante a noite se necessário.
3. Precipitar proteínas vegetais
   1. Neutralize o pH da solução sobrenadante adicionando 11 µ l de 5.8 M HCl. confirmar um pH de 7 ~ por mergulhando cada solução de amostra de papel de tornassol.
      Atenção: Ácido clorídrico é um ácido forte e corrosivo que pode causar queimaduras quando em contacto com a pele (aplicação de pele ou por inalação). Por favor, use luvas para evitar irritações na pele durante a manipulação de HCl.
   2. Adicione 90 µ l de 100% o ácido tricloroacético (TCA) a cada tubo e incubar os tubos em gelo por 30 minutos. A precipitação de proteínas vai virar a solução da claro opaco. Se isso não ocorrer após 30 minutos, refrigere os tubos por 1 hora. Este é um potencial ponto de parar, e as amostras podem ser armazenadas a 4 ° C durante a noite se necessário.
      Atenção: Ácido tricloroacético é corrosivo. Por favor use luvas quando manusear para evitar o contacto com a pele e evitar a inalação.
   3. Centrifugar as amostras a 13.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Remova cuidadosamente o TCA sobrenadante por aspiração-lo usando uma linha de vácuo ligada a uma ponta de micropipeta de vidro fino (a mesma dica pode ser usada em amostras). Não perturbe a pelota de proteína, evitando a sucção pesada e mantendo uma distância adequada entre a ponta da pipeta e o pellet.
   4. Lave o pellet rapidamente com 100 µ l de acetona de-20 ° C. Nesta etapa remove qualquer restante TCA a pelota, o que pode interferir com o ensaio de Bradford subsequente; no entanto, a acetona vai começar a dissolver o sedimento de proteína se deixado em contato muito tempo, então a acetona deve ser adicionada depois rapidamente extraído a pelota dentro de 5 segundos.
   5. Permitir que a acetona evaporar colocando tubos em uma coifa ou frigorífico. Em seguida, dissolva a pelota de proteína, adicionando 1 mL de 0.1 M NaOH para cada tubo. Dissolver totalmente a pelota pode exigir várias rodadas de aquecimento em água quente banho, num Vortex e sonicating.
      Nota: Quanto mais tempo os tubos de sentar-se na coifa ou frigorífico e o secador as pelotas obter, o mais difícil será re-solubilizar. Sugere-se secar o sedimento durante 30 minutos, e então verificar a presença de acetona cada 10-15 minutos até que esteja claro que a acetona evaporou-se (sem acetona fumos são detectáveis).
4. Mistura de soluções-padrão, amostra desconhecida soluções diluídas e quantificar o conteúdo de proteína total das amostras desconhecidas usando o ensaio de Bradford.
   1. Imunoglobulina bovina se prepare soluções-padrão G (IgG) de acordo com as concentrações listadas na tabela 1 (liofilizado ou solução-mãe de IgG pode ser misturado com água desionizada para alcançar cada concentração). Normas de armazenamento a 4 ° C. Em uma placa de 96 poços, adicione 160 µ l de cada solução-padrão de IgG em triplicado, começando na posição A1 da placa bem (0 µ g / µ l em A1, A2, A3 posição, 0,0125 µ g / µ l em B1, B2, B3 posições, etc.).
   2. Prepare uma solução de NaOH diluída pela adição de 50 µ l de 0.1 M NaOH a 950 µ l de água destilada. Como um controle negativo em branco, adicione 60 µ l desta solução na placa bem em triplicado (G1, G2, G3 posições).
   3. Prepare diluições de amostras desconhecidas pela adição de 50 µ l de cada solução de amostra a 950 µ l de água destilada em um tubo de microcentrifugadora novo 1,5 mL. Em seguida, adicione 60 µ l de cada amostra diluída a placa bem em triplicado, começando na posição de H1. Uma placa de 96 poços deverá permitir a análise dos 6 padrões, 1 e 25 amostras desconhecidas quando lido em triplicado. Cada placa bem analisada deve conter suas próprias amostras de IgG padrão e em branco.
   4. Adicione 100 µ l de água destilada a todos os poços de amostras em branco e desconhecido. Agora cada um bem deve conter um total de 160 µ l. com uma pipeta multicanal (8 canais), adicionar 40 µ l da proteína de G-250 azul brilhante de Coomassie tingir a cada bem na primeira coluna da placa bem. Misture o corante com as amostras por mergulhar várias vezes. Repita para todas as outras colunas, substituindo pontas de pipetas para evitar contaminação.
      Atenção: G-250 azul brilhante de Coomassie é um irritante e contacto com a pele, olhos, ou os pulmões devem ser evitados. Por favor, use luvas para evitar o contacto com a pele. Se ocorrer contato com a pele, este produto vai manchar.
   5. Use uma agulha para pop as bolhas presentes nos poços, como eles podem interferir com a leitura de Espectrofotômetro de microplacas. Limpe a agulha para evitar contaminações entre poços. Deixe o microplate incubar a temperatura ambiente por 5 minutos.
   6. Usando um Espectrofotômetro de microplacas, gravar os valores de absorvância para cada poço em 595 nm.
   7. Gravar a absorvância média para os três poços em branco e subtrair este valor de cada uma das leituras a amostra padrão e desconhecido. Em seguida, grave a absorvância média para cada amostra padrão e desconhecida.
      Nota: Para calcular a quantidade de proteína presente em cada amostra desconhecida usando a curva-padrão, é mais fácil regredir a absorvância média de cada norma contra as microgramas de proteína presente em cada norma, mas um pode traçar a concentração de proteína (µ µ g/l) de cada norma se desejável. Os seguintes cálculos, no entanto, se referir a uma curva-padrão com base em microgramas, não as concentrações (µ g / µ l).
   8. Traça a absorvância média de cada norma contra a quantidade total de proteínas presentes em cada norma bem (tabela 1). Coloque uma linha de regressão linear para estes dados e usar a equação para calcular a quantidade de proteína (µ g) em cada amostra desconhecida bem baseada a absorvância média (Figura 1a).
      Nota: O coeficiente de correlação (r -valor) desta linha deve ser superior a 0,98 e rotineiramente perto de 0,99. O regressão padrão serão específico para cada prato, daí os poços da amostra desconhecida em cada placa devem ser analisados separadamente.
   9. Uma vez que a quantidade média de proteína é calculada para cada poço de amostra desconhecida, use a seguinte equação para calcular a quantidade total de proteína (µ g) em cada amostra original:
      M_p = (((W._p60) x 1000) / 50) * 1000
      M_p = µ g de proteína na amostra original
      W_p = µ g de proteína na amostra desconhecida bem
      1. Em seguida, use a seguinte equação para determinar a porcentagem de proteína em cada amostra:
         P_p = ((M_p/1000) / m_i) * 100
         P_p = % de proteína na amostra
         M_eu = massa inicial da amostra (mg)
         Nota: Em alguns casos, a amostra pode ultrapassar o limite superior de absorvância. Em caso afirmativo, soluções de amostra podem requerer novas diluição no passo 2.4.3.
         Diluições adicionais devem então ser contabilizadas nos cálculos subsequentes. Algumas marcas de leitor de microplacas também fornecem o software de computador que irá automaticamente calcular a concentração de proteína média de cada amostra desconhecida, com base nos dados da curva padrão.

3. digestão de carboidratos ensaio

1. Preparação da amostra
   1. Pesar amostras de cada tecido, cerca de 20 mg cada, em vidro, tubos de 15 mL com tampas de rosca de borracha revestidas (100 mm de comprimento). Estas amostra será posteriormente referido como amostras desconhecidas. Rotule os tubos com um marcador à prova d'água ou fluidos com fita nas tampas e gravar a massa exata de cada amostra, como essa informação será necessário para calcular a % de carboidratos em cada amostra desconhecida.
2. Extrato de carboidratos digeríveis de cada amostra desconhecida.
   1. Adicione 1 mL de 0.1 M H₂para que₄ a cada tubo e tampas de rosca para tubos firmemente. Coloque em um banho de água a ferver durante 1 hora.
      Atenção: O ácido sulfúrico é muito corrosivo. Por favor, use luvas, googles de olho e um avental ao manusear H₂então₄ e execute esta etapa em uma coifa.
   2. Refresque-se os tubos em banho de água morna. Despeje o conteúdo do tubo rotulado 1,5 mL microcentrifuge tubos (não se preocupe se alguns restos de material da planta em tubos de vidro).
   3. Centrifugar tubos a 15.000 x g durante 10 minutos. Remova o sobrenadante com uma pipeta de micro e lugar para novos tubos de microcentrifuga rotulado 1,5 mL. Os tubos podem ser refrigerados durante a noite neste ponto. Se continuar com o ensaio, consulte a etapa 3.3.2.
3. Mistura de soluções-padrão e quantificar o conteúdo de carboidrato digerível total de amostras desconhecidas.
   1. Prepare a Difco glicose soluções padrão com concentrações listadas na tabela 2. Prepare-se seis tubos de ensaio de vidro com 400 µ l de cada solução-padrão.
   2. Pipetar 15 µ l de cada amostra desconhecida para seu próprio tubo de ensaio e adicionar 385 µ l de água destilada a cada um para um volume total de 400 µ l em cada tubo de ensaio. Em uma coifa, adicionar 400 µ l de fenol 5% para cada tubo de ensaio de amostra padrão e desconhecido, e então rapidamente Pipetar 2 mL de concentrado de H₂SO₄ para cada tubo. Não toque o conteúdo do tubo de ensaio com a ponta da pipeta, basta adicionar à superfície de solução (uma pipeta repetidora funciona melhor para isso).
   3. Deixe os tubos incubar durante 10 minutos e depois cuidadosamente vórtice do tubo para misturar o conteúdo. Incube por um período adicional de 30 minutos.
      Atenção: Fenol e ácido sulfúrico são irritantes corrosivos. Para proteger contra exposição à pele, olhos e inalação, esta etapa deve ser executada em uma coifa química usando o EPI adequado, que inclui: enfrentar o escudo ou olho óculos de proteção, luvas de borracha, avental de laboratório e botas. Mistura de fenol com ácido sulfúrico também resulta em uma reação exotérmica, que resultará em tubos de tornar-se quente.
   4. Pipete 800 µ l da amostra de cada tubo para cada um dos 3 cubetas semi micro de poliestireno 1,5 mL (3 técnicas Replica por amostra). Definir o espectrofotômetro para ler em 490 nm. Calibre a uma célula em branco contendo água destilada antes de ler as normas ou amostras desconhecidas e intermitentemente durante as leituras de amostra. Executar cada cubeta através de um espectrofotômetro e gravar a absorvância. Média do outro lado técnico repetições para cada amostra desconhecida.
      Nota: Em alguns casos, as amostras podem superar o limite superior de absorvância. Se assim for, as amostras devem ser diluídas em etapa 3.2.3. Diluições também devem ser contabilizadas nos cálculos subsequentes.
   5. Calcule a absorbância média para cada norma.
      Nota: Para calcular a quantidade de carboidratos digestíveis totais presentes em cada amostra desconhecida usando a curva-padrão, é mais fácil regredir a absorvância média de cada norma contra as microgramas de glicose D (+) presente em cada padrão, mas pode-se também traça a concentração de glicose D (+) (µ g / µ l) de cada padrão se desejável. Os seguintes cálculos, no entanto, se referir a uma curva-padrão com base em microgramas, não as concentrações (µ g / µ l).
   6. Calcule a curva de calibração plotando a absorvância média contra a quantidade total de glicose D (+) (µ g) em cada solução-padrão. Caber uma linha de regressão linear para estes dados e em seguida, use a seguinte equação para calcular a quantidade total de carboidratos (µ g) em cada amostra desconhecida:
      M_c = (((um_x -b)/m)/(15)) * 1000
      M_c = µ g de hidratos de carbono na amostra
      Um_x = absorvância média da amostra desconhecida
      b = intercepção de y (linha de regressão padrão)
      m = inclinação (linha de regressão padrão)
      O coeficiente de correlação desta linha deve ser superior a 0,98 e rotineiramente perto de 0,99. Em seguida, use a seguinte equação para determinar a porcentagem de carboidratos em cada amostra:
      P_c = ((M_c/1000) / (M_i)) * 100
      P_c = % de carboidratos
      M_eu = massa inicial da amostra (mg)

Para mostrar a utilidade desses métodos, foram analisados a proteína solúvel e o conteúdo de carboidrato digerível de quatro diferente campo e milho doce tecidos que servem como distintos potenciais recursos nutricionais para insetos herbívoros. Coletamos espigas de milho de três regiões agrícolas dos Estados Unidos (Minnesota, Carolina do Norte e Texas), englobando cinco variedades diferentes de milho doce (ou seja, genótipos) e uma variedade de milho de campo como um externo. A tabela 3 mostra um resumo destas amostras de milho e onde foram recolhidos. Todas as variedades foram coletadas na maturidade, mas devido a diferenças de desenvolvimento entre variedades, não eram todos recolhidos no mesmo dia após o plantio. Nós processamos as orelhas em tecidos distintos, rapidamente, separando as cascas (folhas modificadas cercam o cob), e sedas (fibras brilhantes entre a casca e miolo) do ouvido antes de armazenar todos os tecidos a-80 ° C, como indicaram nos métodos. Cada tecido foi então liofilizado. Uma vez seco, separamos os kernels da base e a ponta da orelha por rapar o miolo do terço superior (ponta) e o fundo de um terço (base) da espiga. Em seguida, todos os tecidos foram moídos em um pó fino. Depois analisamos a casca, seda, núcleo de ponta e amostras de tecido de base do kernel para proteínas solúveis e teor de carboidrato digerível de acordo com os procedimentos descritos nos métodos acima. Tendo em conta as restrições sobre a quantidade de tecido disponível, foram analisados um total de 217 amostras da planta para proteínas solúveis e teor de carboidrato digerível.

Proteína solúvel
Fizemos nove placas de amostra através do espectrofotômetro no total, e curvas padrão, gerais tinham altos coeficientes de correlação (r), com valores entre 0.985-1.00. A Figura 1 mostra a curva padrão obtida com a mais alta (A) e menores valores de r (B) para expor a variabilidade observada através de placas. Nós calculado a % de proteína solúvel para todas as amostras usando massa inicial de amostra (tabela 4) e então analisados os dados estatísticos diferenças no teor de proteínas solúveis entre regiões, variedades e tipos de tecido. Os dados foram rank-transformado para atender os pressupostos de normalidade quando necessário.

Observamos diferenças significativas no teor de proteínas solúveis entre regiões (Welch ANOVA; F_{(2, 133,5)} = 4.303, P = 0.015), como um resultado, dados de cada região foram posteriormente analisados separadamente. Amostras de Minnesota, mostradas uma interação significativa entre variedade e tipo de tecido no conteúdo de proteína solúvel (ANOVA de duas vias; F_{(3, 64)} = 16,51, P < 0,001). A maioria dos tecidos tinham proteína solúvel semelhante conteúda em ambas as variedades, exceto miolo de base, onde a variedade de milho doce contido quase 7 vezes a quantidade em comparação com a variedade de milho de campo. Para a variedade de milho de campo (Syngenta/NK-3122A-EZ), cascas e sedas foram semelhantes e tinham o menor teor de proteína solúvel de todos os tecidos. Miolo da ponta da orelha tem o maior teor de proteína solúvel e núcleos da base da orelha estão intermediários (Figura 2a). Para a variedade de milho doce (providência Bicolor), todos os tecidos eram distintos, com as cascas e sedas que contém o menor teor de proteína solúvel e sementes base contidos ~2.5 vezes mais do que sementes de ponta (Figura 2b).

Amostras de Carolina do Norte, também mostrou uma interação significativa entre variedade e tipo de tecido (ANOVA de duas vias; F_{(3, 77)} = 3,33, P < 0,024). A maioria dos tecidos mostraram proteína solúvel semelhante conteúdo através de variedades, exceto sementes de ponta que exibiram um teor mais elevado em não -Bt variedade (Sweet G90 híbrido). Para a Bt cascas de variedade (Seedway Bt 1576) foram o tecido com a mais baixa proteína solúvel conteúdo, seguido de sedas e sementes de ponta, que tinham um conteúdo semelhante. Núcleos de base tinham o maior teor de proteína solúvel, mas não foram estatisticamente diferentes do miolo de ponta (Figura 2C). Na não -Bt variedade (Sweet G90 híbrido), todos os tecidos eram distintos, com exceção de ponta e sementes de base que foram estatisticamente semelhantes. Cascas tinham a mais baixa proteína solúvel conteúda, seguido de sedas e sementes de ponta e a base que tinham o índice mais elevado (Figura 2d).

Amostras de Texas mostrou diferenças significativas no teor de proteínas solúveis entre variedades (ANOVA de duas vias; F_{(1, 76)} = 12,91, P = 0,001) e tecidos (ANOVA de duas vias; F_{(3, 76)} = 21.90, P < 0,001), mas não há interação significativa (ANOVA de duas vias; F_{(3, 76)} = 0.436, P = 0.728). Em geral, a variedade bicolor (Sh2 SS2742 NAT III) mostrou um teor de proteína solúvel média inferior do que a variedade Silver Queen (F1 TRTD (su)). Em ambas as variedades, cascas tinham o menor teor de proteína, seguiram de sedas e então ponta e base de grãos, que ambos da mesma forma tinham alto teor (Figura 2e-f).

Carboidratos digeríveis
Porque todas as amostras foram analisadas de uma vez, só fizemos uma curva padrão. C da Figura 1 mostra que o coeficiente de correlação foi elevado, em 0.998. Podemos calcular o conteúdo de carboidratos digeríveis % para todas as amostras (tabela 5) e então analisados dados estatísticos diferenças no teor de carboidrato digerível entre regiões, variedades e tipos de tecido. Dados foram transformados rank quando necessário para atender os pressupostos de normalidade.

Não havia diferenças significativas entre as regiões (ANOVA; F_{(2, 216)} = 1,47, P = 0.231), mas por uma questão de continuidade com as análises de proteína novamente foram analisados dados de cada região separadamente. Amostras de Minnesota mostrou não há diferenças significativas no conteúdo de carboidratos digeríveis entre variedades (ANOVA de duas vias; F_{(1, 64)} = 0.00014, P = 0.990) ou tipo de tecido (ANOVA de duas vias; F_{(3, 64)} = 0.818, P = 0.489). Houve, também, não há interação significativa entre variedade e tecido (ANOVA de duas vias; F_{(3, 64)} = 2.26, P = 0,092). Figura 2a -b mostra que todos os tecidos exibiram um teor médio de 36,5% (± 0,53).

Amostras de Carolina do Norte, mostramos um efeito significativo do tipo de tecido no conteúdo de carboidratos digeríveis (ANOVA de duas vias; F_{(3, 77)} = 3,99, P = 0.011), mas nenhum efeito da variedade (ANOVA de duas vias; F_{(1, 77)} = 1,06, P = 0,307) ou interação (ANOVA de duas vias; F_{(3, 77)} = 0.465, P = 0.708). Figura 2 c -d mostra que sedas tem o menor teor de carboidrato digerível, seguido por cascas, dica, grãos e sementes de base. Todos os tecidos foram estatisticamente semelhantes excepto sedas e núcleos de base.

Amostras de Texas não mostrou nenhum efeito significativo da variedade (ANOVA de duas vias; F_{(1, 76)} = 0.834, P = 0.364) ou tipo de tecido (ANOVA de duas vias; F_{(3, 76)} = 1,03, P = 0,385), mas mostrou uma interação significativa (ANOVA de duas vias; F_{(3, 76)} = 3.34, P = 0,024). Este efeito foi em grande parte porque a base miolo na variedade bicolor (Sh2 SS2742 NAT III) tinha um carboidrato digerível significativamente maior conteúdo do que aqueles na variedade prata Rainha (F1 TRTD (su)). Figura 2e -f mostra que não havia diferenças no conteúdo de carboidratos digeríveis estatísticas através de tipos de tecido na variedade prata Rainha (F1 TRTD (su)), mas havia uma diferença significativa entre a seda e tecidos de base do kernel para o (variedade bicolor SH2 SS2742 NAT III).

Figura 1. Curvas padrão para ensaios de macronutrientes. (A) a curva padrão para o ensaio de proteína solúvel mostrando a placa com o mais alto coeficiente de correlação (melhor curva). (B) a curva padrão para o ensaio de proteína solúvel mostrando a placa com o mais baixo coeficiente de correlação (pior curva). (C) a curva padrão para o ensaio de carboidrato digerível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Quer dizer % proteína solúvel e teor de carboidrato digerível % para cada tipo de tecido. (A) MN - Bt Syngenta/NK-3122A-EZ (campo de milho), MN (B) - não -Bt providência Bicolor, (C) NC - Seedway Bt 1576, (D) NC - não -Bt doce G90 híbrido, (E) TX - Sh2 SS2742 F1 NAT III Bicolor, (F) TX - rainha prata TRTD F1 (su). Círculos mostram dados brutos, enquanto praças mostram os valores médios. Verde (casca), vermelho (seda), amarelo (kernels de ponta) e roxo (base kernels). As pontilhado-linhas que conectam a origem de cada quadrado de mostram a relação de P:C para cada tecido (a proporção é o declive da linha pontilhada). Cartas mostram resultados post hoc para diferenças de proteína ao longo das diferenças de topo e hidrato de carbono ao longo do lado, com diferentes letras que representam valores significativamente diferentes entre os tecidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. Cálculos de curva padrão para o ensaio de proteína solúvel. A quantidade de proteína em cada norma é calculada tendo a concentração de cada padrão e multiplicando-o pela quantidade de solução padrão em cada poço (160 µ l).

Tabela 2. Cálculo de curva padrão para ensaio de carboidrato digerível. A quantidade de glicose em cada norma é calculada tendo a concentração de cada padrão e multiplicando-o pela quantidade de solução padrão em cada tubo de ensaio (400 µ l).

Tabela 3. Resumo do local de recolha de amostras de milho e variedades. Para cada combinação de região e variedade, foram coletadas 10 orelhas e quatro tecidos foram analisados: casca, sedas, miolo de ponta e núcleos de base.

Tabela 4. Valores de proteína médios para cada tipo de tecido, variedade e região. Significa a porcentagem (em massa seca) é mostradas ± 1 SE.

Tabela 5. Quer dizer valores de carboidrato para cada tipo de tecido, variedade e região. Significa a porcentagem (em massa seca) é mostradas ± 1 SE.

Combinando ensaios colorimétricos bem estabelecidos com protocolos de extração de planta específica eficaz, os ensaios demonstrados aqui fornecem um método razoável e preciso para medição de planta de proteína solúvel e conteúdo de carboidrato digerível. Nossos resultados usando o milho como um exemplo ilustra como estes protocolos podem ser usados para obter medições precisas em diferentes escalas espaciais biologicamente relevantes. Por exemplo, fomos capazes de detectar diferenças na planta de proteína solúvel e conteúdo de carboidrato digerível geográfica regiões, variedades (ou genótipos), tipos de tecido, tecidos nem espacialmente segregados. Ambos os ensaios podem ser feitos usando equipamento de laboratório e reagentes, exigindo apenas habilidades de laboratório básico, comuns e pode analisar um número relativamente grande de amostras (50-75) dentro de um curto espaço de tempo.

Apesar de relativamente fácil de realizar, alguns passos são mais críticos do que outros e se feito incorretamente podem limitar a precisão dos resultados. Por exemplo, é imperativo que materiais vegetais são tratadas adequadamente durante o estágio de amostragem. Tecido de planta mesmo dissecado permanecerá metabolicamente ativo até expostos a uma temperatura letal, e durante este período planta pode alterar o conteúdo de macronutrientes. Como resultado, períodos de tempo entre a planta de amostragem e congelamento (seja por armazenamento líquido N ou congelador) podem aumentar a probabilidade de que o conteúdo de macronutrientes de planta de amostra pode não refletir o conteúdo que estava presente no momento da amostragem.

2.3.3-2.3.5 etapas do protocolo de proteína são particularmente importantes para um resultado positivo, como estas etapas lidam com as proteínas precipitadas. Deve ter cuidado para evitar perder a pelota de proteína quando aspirar o sobrenadante TCA dos tubos de microcentrifuga, porque isso resultará em uma subestimação do teor de proteínas. Também é importante quando lavar o sedimento de proteína com acetona a fazê-lo muito rapidamente. Acetona pode degradar a pelota se deixado em contato por mais de alguns segundos. Sugerimos que limitar o contato entre acetona e a pelota a menos de 5 segundos. Finalmente, quando a pelota de secagem, é importante ter o cuidado de só permitir tempo suficiente para a acetona evaporar. Se o pellet é deixado para secar durante muito tempo, se torna muito difícil Resuspenda em NaOH. Sugerimos a pelota de secagem por 30 minutos e em seguida, verificar a presença de acetona, observando visualmente o líquido no tubo ou detectando cuidadosamente o cheiro da fumaça de acetona. Continue a verificar a pelota cada 10-15 minutos até a acetona evapore.

Como descrito em Bradford 1976¹⁶, as etapas de quantificação, usando a tintura de G-250 azul brilhante de Coomassie permitem alta sensibilidade, com um desvio padrão de proteína de apenas 5 µ g/mL, estabilidade de complexos de alta proteína-tintura e limitada interferência por compostos não proteicos. Este ensaio tem uma escala da deteção entre 1-20 µ g de proteínas totais por microplaca bem (ensaio de baixa concentração) ou um máximo de 25 µ g/mL; no entanto, qualquer concentração que excede o mais alto padrão deve ser diluída e re-analisada para os resultados mais precisos (o protocolo produz um excesso de solução no caso de tais diluições e re-análise é necessário). Há um viés para a tintura ligar preferencialmente a base de aminoácidos, como arginina e resíduos de aminoácidos aromáticos; no entanto, o ensaio de Bradford continua a ser o método mais preciso e fácil de usar para quantificação de proteínas totais em amostras misturadas.

O ensaio de carboidrato digerível é um método simples, rápido e econômico para quantificar a planta sacáridos excluindo os carboidratos estruturais (como a celulose), que são indigestos pela maioria dos herbívoros. Os passos mais problemáticos em ensaios os carboidratos são passos 3.2.1 e 3.3.2-3.3.4. Aqui, é fundamental para manter os tubos na posição vertical e aperte o screwcaps bem quando a ferver, como a introdução de água irá diluir as amostras e afetar a quantificação exata. Também, cuidados devem ser tomados quando se trabalha com fenol e concentraram ácido sulfúrico, como ambos são altamente corrosivos. Note-se que defendemos a absorvância da amostra a 490 nm, que é a absorbância máxima para hexoses, mas não outros açúcares, tais como pentoses e ácidos urônicos, que têm uma absorvância máxima em 480 nm^20,21de gravação. Para misturas de açúcar nas amostras de plantas, 490 nm fornece um comprimento de onda apropriado para quantificar o total de carboidratos conteúdo^22,23,24, mas para uma análise mais detalhada dos diferentes açúcares consulte^{20, 21}. Também deve ser observado que Masuko et al ²³ fornece um método de microplacas simplificada para análise de carboidratos ácido fenol-sulfúrico.

Outro notável método para estimar a planta nutriente conteúdo^25,26,27 é a espectroscopia de infravermelho próximo (NIR). Tecnologia NIRS é amplamente utilizada na agricultura e produção de alimentos. Esta técnica alternativa é não invasivo, não-destrutiva, leva uma fração do tempo envolvido em qualquer método de química úmida e pode ser aplicada em diferentes escalas de uma paisagem até uma parte individual de tecido de planta. Esta técnica mede nutrientes indiretamente e se baseia em medições de precisão química molhada do produto químico de interesse para a calibração de fábrica. Os métodos descritos neste documento, portanto, terá um lugar crítico no futuro das análises dos nutrientes de planta, assegurar que a calibração é baseada na quantificação de macronutrientes solúvel e de fácil digestão e não influenciada por substitutos elementares não-nutritiva.

Os métodos apresentaram para medir proteína solúvel de planta e conteúdo de carboidrato digerível têm implicações significativas para as ciências biológicas e ambientais. Apesar de uma riqueza de informações sobre a composição elementar de tecidos vegetais, informações sobre o conteúdo de macronutrientes de planta está faltando severamente. Tendo em conta as limitações que existem em correlacionar medidas elementares com macronutrientes conteúdo e reconhecendo a forte relação entre a planta de processos ecológicos de ordem superior e conteúdo nutricional, obter acesso a este tipo de dados é essencial para avançando os campos de Fisiologia vegetal, ecologia nutricional, interações planta-herbívoro, comida-web dinâmica^11,28,29,30. É nossa esperança que fornecer uma metodologia clara e acessível para medir proteína solúvel de planta e conteúdo de carboidrato digerível irá incentivar pesquisadores para coletar e incorporar este tipo de dados em pesquisas futuras.

Os autores não têm nada para divulgar.

Graças a todos os nossos colaboradores que têm assistido com coleções de campo de milho doce, incluindo Dominic Reisig e Dan Mott na North Carolina State University e Pat Porter na Texas A & M University em Lubbock, TX. Agradecimentos a Fiona Clissold para ajudar a otimizar os protocolos e para fornecer as edições para este manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte pelo Texas A & M C. Everette Salyer Fellowship (departamento de entomologia) e a biotecnologia risco Grant programa avaliação competitiva concedem n º 2015-33522-24099 do departamento E.U. da agricultura (concedido a gás e STB).