공장 수용 성 단백질과 소화 탄수화물 콘텐츠를 사용 하 여 옥수수 (지 시 메이 스)를 표본으로 측정

여기에 설명 된 프로토콜 수용 성 단백질 및 식물 조직에서 소화 (비 구조) 탄수화물 콘텐츠 측정을 위한 명확 하 고 친근 한 방법론을 제공 합니다. 이 두 공장 macronutrients 계량 수 식물 생리학, 영양 생태학, 식물-초 상호 작용 및 식품 웹 생태 분야 진출을 위한 중요 한 의미를 갖는다.

원소 데이터 일반적으로 herbivores 자원으로 식물 품질을 유추 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 탄소 생체에서의 유비, 포함 하는 질소 식물 방어 화합물 및 질소와 식물 단백질 콘텐츠 모든 종의 수천에서 존재 이러한 추정의 정확도 제한 합니다. 또한, 식물에 초점을 맞춘 연구 및/또는 초 식 동물 생리학 필요 하지 사용 하 여 이루어집니다 정확도의 수준을 일반화 상관 관계. 여기에 제시 된 방법 공장 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물, 동물 생리 적 성능에 가장 밀접 하 게 연결 하는 두 식물 macronutrients 직접 측정을 위한 명확 하 고 빠른 프로토콜 연구를 제공 합니다. 프로토콜은 정확 하 고 재현 가능한 결과 제공 하는 최적화 된 공장 관련 소화 단계 잘 특징이 색도계 분석 실험을 결합 한 제품. 조직 표시 이러한 분석 실험 감도에서 변화를 감지 하는 다른 달콤한 옥수수의 우리의 분석 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 여러 공간 비늘에 걸쳐 공장. 이러한 포함 하는 식물 사이 성장 하는 지역 및 식물 종 또는 품종, 뿐만 아니라 공장 내 조직 종류에 차이 같은 조직 내에서 심지어 위치 차이. 원소 데이터 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 결합도 식물 미네랄 영양 식물 생리 프로세스와 연결할 식물 생물학에 있는 새로운 기회를 제공. 이러한 분석은 또한 수용 성 단백질 및 영양 생태학, 식물-초 상호 작용 및 생리 및 생태 연구에 향상 시킬 것입니다 음식 웹 역동성을 공부 하는 데 필요한 소화 되기 쉬운 탄수화물 데이터 생성 도움이 됩니다.

식물 바이오 매스는 사실상 모든 지상파 음식-웹의 기초를 형성 한다. 식물 뿌리 시스템을 통해 토양에서 영양 요소 확보를 생체 합성 조직 그들의 잎에 햇빛. 특히, 탄소와 질소 탄수화물, 단백질 (아미노산의 구성)를 만드는 데 사용 됩니다 빌드하고 지질 하는 데 필요한 식물 바이오 매스 (주목 해야 한다 그에 식물 생리학 용어 "다량 영양소" 종종 N, 등 토양 요소 참조 그러나 P, K, S,,이 문서를 통해이 기간을 참조 합니다 쓰이므로, 단백질, 탄수화물, 지질 등). Herbivores 소비 공장 설비 재료, 식물 조직에 포함 된 macronutrients 그들의 구성 부분으로 세분화 되며 소비자의 생리 적 프로세스를 구동 하는 데 사용. 이 방법에서는, 식물 macronutrients 높은 순서 생태 상호 작용 및 음식 웹 역동성에 대 한 중요 한 의미와 함께 소비자 생리학에 강한 영향이 있다.

동물의 왕국에 걸쳐 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 macronutrients 생존, 재생산, 그리고 성능¹에 가장 밀접 하 게 묶여 있습니다. 또한, 동물의 대다수는 적극적으로 그들의 생리 적 요구^1,2를 충족 하기 위해 이러한 두 개의 macronutrients의 그들의 섭취를 조절 합니다. 이 사실이 특히 식물 조직, 설탕 및 아미노산의 농도 감지 하는 곤충 herbivores에 대 한 차례로 먹이 행동을 지시 하는. 그 결과, 수용 성 단백질을 식물 그리고 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 식물 곤충 상호 작용의 진화에 강한 역할을 했다.

우세는 동안 공장 수용 성 단백질에 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 데이터 상대적으로 드물다 (^{6,7,,89,10,11}참조), 식물 원소 콘텐츠 (탄소, 질소, 인)에서 사용할 수 있는 데이터입니다. 크게이 요소는 식물 미네랄 영양^3,,45에 기본 역할 때문입니다. 요소, 측정 어디 상관 관계 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물의 양을 추정 하는 데 사용 되었습니다 하지만 정확한 계산 종종 얻기 어렵다. 예를 들어, 탄소는 모든 유기 화합물에 편 존재 하기 때문에 공장 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠의 지표로 서 탄소를 사용 하 여 아니다. 원소 질소 공장 수용 성 단백질 콘텐츠, 사이 강한 관계가 그리고 일반화 된 질소-단백질 변환율은 종종 활용. 그러나, 질소-단백질 변환 높은 종의^12,13,14,15, 하 게 일반화 된 변환의 사용 가능성이 있다는 강력한 증거가 있다 부정확 한. 이 때문에, 질소-단백질 변환 요소는 종종 특히 정도로 herbivores에 영양 연구에 필요한 정밀을 부족 합니다. 또한, N 포함 된 식물 allelochemicals, 미치 죠 및 glucosinolates는 herbivores, 독성 등의 존재는 이러한 변환을 혼동 수 있습니다.

여기, 우리는 수용 성 단백질과 식물 조직에서 소화 되기 쉬운 탄수화물의 농도 측정 하기 위한 두 개의 화학 분석을 제공 합니다. 이 분석 실험, 제시 하지만 그 그들은 동시에 사용할 수 같은 식물 샘플을 분석 하 식물 macronutrients의 보다 포괄적인 분석을 달성 하기 위하여 건의 된다. 둘 다 비슷한 방법론을 정량화 하 여 흡 광도 통해 다음 추출 단계의 구성 된 사용 합니다. 식물 샘플 준비는 또한 쉽게 연동에서 모두 분석을 실행 하려면 두 프로토콜에 대 한 동일 합니다. 이 분석 실험의 유틸리티 할 그들의 참신에서 줄기 하지 그들은,에 의존 (브래드 포드, 존스, 뒤부아) 확고 색도계 분석 실험^16,17,18, 하지만 여기서 우리는 명확 하 고 쉽게 따라 조직 더 애매 한 특정 식물 추출 기술^17,19 이러한 메서드를 결합 하 여 이러한 분석의 응용 식물 관련 필드에 액세스할 수 있도록 하는 프로토콜입니다.

두 분석 실험에 대 한 식물 macronutrients는 동결, lyophilizing, 및 식물 소재를 연 삭 하 여 물리적으로 추출 처음. 수용 성 단백질 분석 결과 대 한 추가 화학 추출^17,19 vortexing 및 난방 NaOH 솔루션에서 샘플의 몇 라운드를 통해 수행 됩니다. Coomassie 화려한 블루 G-250를 활용 하 여 잘 알려진 Bradford 분석 실험 다음 수용 성 단백질과 3000-5000 Daltons^16,17사이 polypeptides를 계량 하는 데 사용 됩니다. 이 분석 결과 1-20 µ g 미 판 당 총 단백질 사이 탐지 범위 잘 또는 < 25 µ g/mL, 하지만 하지 측정 무료 아미노산을 않습니다. 소화 되기 쉬운 탄수화물 분석 결과의 추출 단계 스미스 그 외 여러분 의 희석 산 방법에 따라 ²⁰ 녹는 설탕, 전 분, 그리고 fructosan-하지만 하지 구조 탄수화물의 격리에 대 한 수 있습니다. 페 놀 황산 산 정량화 방법 뒤부아 외 에서 가져온 것입니다. ¹⁸ 모든 모노-, 올리고-고 류 뿐만 아니라 (메 틸 유도체) 측정. 이 분석 결과 특정 설탕을 계량 수 하지만 여기 우리가 총 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 표시기로 사용 (참조 스미스 외. ²⁰ 더 자세한 분석을 위해). 함께,이 분석 실험 공장 환경 생리학 및 초 성능, 지상파 음식-웹의 기지에서 리소스 품질에 중요 한 데이터를 제공 하 강하게 연결 된 두 개의 macronutrients를 측정 합니다. 이러한 프로토콜을 제시 식물 생리학, 초 식 동물의 영양 생태학, 식물-초 상호 작용의 더 철저 한 이해를 얻기 위하여 식물 다량 영양소 데이터 집합 생성을 촉진 합니다.

1. 식물 수집 및 처리

1. 수집 및 공장 샘플 처리
   1. 식물 샘플 수집 후 플래시 동결 샘플 집게와 저장소-80 ° c.에 액체 질소로 공장 설비 재료를 찍기로 식물 샘플을 수집 하는 경우는 너무 커서 플래시 동결, 신속 하 게 최대한 빨리 드라이 아이스 및 전송-80 ° C 냉장고를 사용 하는 샘플을 냉각. 식물 재료의 다량 영양소 콘텐츠 컬렉션 후 즉시 공장 샘플을 동결 하는 것이 중요 하다 그래서 조직 공장에서 분리 된 후 변경할 수 있습니다.
      주의: 액체 질소는 피부 접촉 시 심한 동상을 발생할 수 있습니다. 승인 된 용기에 액체 질소를 수송 하는 곳을 알아내는-장갑, 아이 구글, 얼굴 방패, 앞치마, 그리고 실험실 외 투를 포함 하 여, 처리 하는 동안 적절 한 보호구를 착용 했는지 확인 하십시오.
   2. 공장 설비 재료 물 제거 되 고 하는 동안 조직 metabolically 활성 되지 않습니다 보장 하기 위해 동결 건조 기를 사용 하 여 lyophilize 샘플의 질량까지 드라이 모든 물 제거 되도록 안정화.
   3. 일단 샘플 건조, 분쇄기 또는 밀을 사용 하 여 정밀한 분말에 갈기. Desiccating 캐비닛 분석까지 샘플을 저장 합니다.

2. 수용 성 단백질 분석 결과

1. 샘플 준비
   1. 각 조직, 약 20 m g 각각의 복제 샘플 무게 1.5 mL 폴리스 티 렌 microcentrifuge 튜브 및 튜브 라벨에. 이후 알 수 없는 샘플으로 이러한 샘플을 지칭 합니다. 이 정보 각 불명된 한 견본에서 % 녹는 단백질을 계산 하는 데 필요한 것으로 각 샘플의 정확한 질량을 기록 합니다. 잠금 뚜껑, microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 샘플 솔루션의 손실을 후속 난방 단계 비 잠금 뚜껑 열 수 있습니다.
2. Solubilize 및 알 수 없는 샘플 단백질 분리
   1. 마이크로 pipettor 사용 하 여, 각 튜브를 0.1 M NaOH의 500 µ L를 추가 합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 30 분 동안 sonicate. 뜨거운 물에 예 열 목욕 90 ° c.
      주의: 수산화 나트륨 강력한 기반 이며 피부 접촉 시 화상을 일으킬 수 있습니다. 0.1 M NaOH 낮은 농도 나타내지만, 피부 자극을 피하기 위해 보호 장갑을 착용 하십시오.
   2. 15 분 동안 뜨거운 물 목욕에 있는 선반에 튜브를 배치 합니다.
   3. 10 분간 15000 x g에서 튜브를 원심. 각 샘플에 대 한 새로운 피 펫 팁을 사용 하 여 새 레이블된 microcentrifuge 튜브 표면에 뜨는 액체 플라스틱. 10 분 동안 펠 릿과 다시 15000 x g에서 원심 분리기를 포함 하는 튜브를 0.1 M NaOH의 300 µ L를 추가 합니다. 또, 표면에 뜨는 액체를 수집 하 고 동일한 샘플에서 다른 표면에 뜨는 액체 결합. 정지점, 잠재적인 이며 샘플에 저장 될 수 4 ° C 하룻밤 필요한 경우.
3. 식물 단백질을 침전
   1. 각 샘플 솔루션에 리트머스 종이 담거 서 5.8 M HCl. 확인 ~ 7의 pH의 11 µ L을 추가 하 여 표면에 뜨는 해결책의 pH를 중화.
      주의: 염 산 (피부 응용 프로그램 또는 흡입) 피부 접촉 시 화상 일으킬 수 있는 강한 부식성 산 이다. HCl을 처리 하는 동안 피부 자극을 방지 하기 위해 장갑을 착용 합니다.
   2. 각 관에 100 %trichloroacetic 산 (TCA)의 90 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 튜브를 품 어. 단백질의 강수량은 불투명 클리어에서 솔루션을 돌 것 이다. 이 분 후 발생 하지 않으면, 1 시간 동안 튜브를 냉동. 정지점, 잠재적인 이며 샘플에 저장 될 수 4 ° C 하룻밤 필요한 경우.
      주의: Trichloroacetic 산 부식성입니다. 피부와의 접촉을 방지 하 고 흡입 방지를 처리할 때 장갑을 착용 합니다.
   3. 4 ° c.에서 10 분 동안 13000 x g에서 원심 분리기 샘플 정밀한 유리 제 micropipette 팁 (동일한 팁 샘플에서 사용할 수 있습니다)에 연결 된 진공 라인을 사용 하 여 밖으로 suctioning에 의해 표면에 뜨는 TCA를 조심 스럽게 제거. 무거운 흡입을 피하 및 피 펫 팁과 펠 릿 사이의 적절 한 거리를 유지 하 여 단백질 펠 렛을 방해 하지 마십시오.
   4. -20 ℃ 아세톤의 100 µ L로 신속 하 게 펠 릿을 세척. 이 단계는 후속 Bradford 분석 실험;을 방해할 수 있는 펠 릿에서 모든 나머지 TCA를 제거 합니다. 그러나, 아세톤 아세톤 다음 신속 하 게 추출 된 펠 릿에서 5 초 이내에 추가 되어야 합니다 그래서 너무 오래 접촉에 남아 있는 경우 단백질 펠 릿을 분해 하기 시작 합니다.
   5. 아세톤 증기 두건 또는 냉장고에 튜브를 삽입 하 여 증발을 허용 한다. 다음, 각 튜브를 1 mL의 0.1 M NaOH 추가 하 여 단백질 pellet을 디졸브. 뜨거운 물에 난방의 여러 라운드를 필요할 수 있습니다 완전히 펠 릿을 녹이는 목욕, vortexing, 및 sonicating.
      참고: 더 이상 튜브 증기 두건에서 앉거나 냉장고와는 건조 알 약 얻을, 그들은 다시 solubilize 하는 것이 더 어려운. 그것은 30 분 동안 건조 한 펠 릿을 제안 하 고 아세톤의 존재에 대 한 확인 될 때까지 10-15 분 마다 아세톤 증발 했다 해제 (없음 아세톤 가스는 감지).
4. 표준 솔루션을 혼합 하 고 알 수 없는 샘플 솔루션을 희석 Bradford 분석 실험을 사용 하 여 알 수 없는 샘플의 총 단백질 함량을 계량.
   1. 소 면역 글로불린 G (IgG) 표 1 (동결 건조 된 또는 IgG 재고 솔루션 각 농도 달성 하기 위해 이온된 수와 혼합 수 있습니다)에 나열 된 농도 따라 표준 솔루션을 준비 합니다. 4 ° c.에 표준 저장 96 잘 접시에 잘 플레이트의 A1 위치에서 triplicate 시작에서 각 IgG 표준 솔루션의 160 µ L 추가 (0 µ g / µ L에 A1, A2, A3 위치, B1, B2, b 3에서 µ 0.0125 µ g/L 위치, 등).
   2. 증류수의 950 µ L을 0.1 M NaOH의 50 µ L을 추가 하 여 희석된 NaOH 솔루션을 준비 합니다. 빈 부정적인 제어로 3 (G1, G2, G3 위치) 중에 잘 접시에이 솔루션의 60 µ L를 추가 합니다.
   3. 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 증류수의 950 µ L를 각 샘플 솔루션의 50 µ L을 추가 하 여 알 수 없는 샘플의 희석을 준비 합니다. 그런 다음, H1 위치에서 시작 하는 3 중에 잘 접시에 각 희석된 샘플의 60 µ L를 추가 합니다. 96 잘 접시 6 표준, 1 공백, 및 3 중에서 읽을 때 25 알 수 없는 샘플의 분석에 대 한 허용 해야 합니다. 각 잘 플레이트 분석 자체 IgG 표준 및 빈 샘플을 포함 해야 합니다.
   4. 모든 빈 고 알 수 없는 샘플 우물에 증류수 100 µ L를 추가 합니다. 이제 각 잘 총 160 µ L. 다중 채널 피 펫 (8 채널)를 사용 하 여 포함 한다 Coomassie 화려한 블루 G-250 단백질의 40 µ L 염색 잘 잘 플레이트의 첫 번째 열에 있는 모든 추가. 여러 번 급락 하 여 예제와 함께 염료를 혼합. 피 펫 팁 오염을 피하기 위하여 대체 다른 모든 열에 대해 반복 합니다.
      주의: Coomassie 화려한 블루 G-250 자극 하 고 피부, 눈와 접촉 또는 폐를 피해 야 한다. 피부 접촉을 방지 하기 위해 장갑을 착용 합니다. 발생 하는 피부와 접촉 하는 경우이 제품 얼룩 것입니다.
   5. 미 판 분 광 광도 계 읽기 방해할 수로 우물에 있는 모든 거품을 팝업 하는 바늘을 사용 합니다. 웰 스 사이 오염을 피하기 위하여 바늘을 청소. 5 분 동안 실 온에서 품 어 미 판 하자.
   6. 각 잘 595에서 흡 광도 값을 기록 microplate 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm.
   7. 3 빈 우물에 대 한 평균 흡 광도 기록 하 고 각 표준 및 알 수 없는 샘플 읽기에서이 값을 뺍니다. 그런 다음 각 표준 및 알 수 없는 샘플에 대 한 평균 흡 광도 기록 합니다.
      참고: 표준 곡선을 사용 하 여 각 불명된 한 견본에 있는 단백질의 양을 계산 하는 단백질에 각 표준의 마이크로 그램에 대 한 각 표준의 평균 흡 광도 떠올리게 하는 가장 쉬운 하지만 하나 단백질 농도 (μ를 플롯할 수 있습니다. g / µ L) 바람직한 경우 각 표준의. 그러나 다음 계산,, 마이크로 그램, 아니라 농도 (µ g / µ L)에 따라 표준 곡선을 참조 하십시오.
   8. 각 표준 음 (표 1)에 단백질의 총 금액에 대해 각 표준의 평균 흡 광도 플롯 합니다. 이러한 데이터에 선형 회귀선 적합 하 고 잘 평균 흡 광도 (그림 1a)에 따라 각 알 수 없는 샘플에서 (µ g) 단백질의 양을 계산 하는 방정식을 사용 하 여.
      참고:이 줄의 상관 계수 (r 값) 보다 큰 0.98 정기적으로 0.99 근처 이어야 한다. 표준 회귀 각 접시에 적용 됩니다, 그리고 각 접시에 알 수 없는 샘플 웰 스를 별도로 분석 해야 따라서.
   9. 단백질의 평균 금액은 각 알 수 없는 샘플 잘 계산 됩니다, 일단 다음 방정식을 사용 하 여 각 원래 샘플에서 (µ g) 단백질의 총 금액을 계산 하.
      M_p = (((W_p/60) x 1000) / 50) * 1000
      M_p = 원래 견본에 있는 단백질의 µ g
      W_p 잘 불명된 한 견본에 있는 단백질의 µ g =
      1. 다음, 다음 수식을 사용 하 여 각 샘플에서 단백질의 비율을 결정.
         P_p = ((M_p/1000) /M_i) * 100
         P_p = 샘플에서 % 단백질
         M_나 샘플 (mg)의 초기 질량 =
         참고: 경우에 따라 샘플 위 흡 광도 임계값을 능가 수 있습니다. 그렇다면, 샘플 솔루션 필요할 수 있습니다 추가 희석 단계 2.4.3에서.
         다음 후속 계산에 추가 희석에 대 한 차지 해야 합니다. 일부 microplate 리더 브랜드는 또한 자동으로 표준 곡선 데이터에 따라 각 알 수 없는 샘플의 평균 단백질 농도 계산 하는 컴퓨터 소프트웨어를 제공 합니다.

3. 소화 되기 쉬운 탄수화물 분석 결과

1. 샘플 준비
   1. 각 조직의 약 20mg 각 복제 샘플 무게를 다 십시오, 스크류 캡 고무 줄 (길이 100 m m)와 15 mL 튜브 유리에. 이후 알 수 없는 샘플으로 이러한 샘플을 지칭 합니다. 방수 마커 또는 뚜껑에 테이프 라벨 튜브 라벨 고 기록 각 샘플의 정확한 질량이이 정보 각 불명된 한 견본에 % 탄수화물을 계산 하는 데 필요한 것입니다.
2. 알 수 없는 각 샘플에서 소화 되기 쉬운 탄수화물을 추출 합니다.
   1. ₄ 각 튜브와에 나사 뚜껑을 단단히 튜브 그래서 0.1 M H₂의 1 mL를 추가 합니다. 1 시간 동안 끓는 물 욕조에 배치 합니다.
      주의: 황산은 매우 부식성. 그래서 H₂를 처리할 때 장갑, 아이 구글, 그리고 앞치마 착용₄ 증기 두건에서이 단계를 수행 하 고.
   2. 미지근한 물 욕조에 튜브에서 멋진. 붓고 튜브 내용을 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (일부 식물 소재 남아 유리 튜브에 하는 경우 염려 되지 않음).
   3. 10 분간 15000 x g에서 튜브를 원심. 새 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브 마이크로 pipettor와 장소 표면에 뜨는 액체를 제거 합니다. 관 수 수 냉장 하룻밤이 시점에서. 분석 결과 함께 계속, 단계 3.3.2 참조.
3. 표준 솔루션을 혼합 하 고 알 수 없는 샘플의 총 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 계량.
   1. D(+) 포도 당 농도와 표준 솔루션 표 2에 나열 된 준비. 각 표준 솔루션의 400 µ L로 6 개의 유리 시험관을 준비 합니다.
   2. 자체 테스트 튜브에 알 수 없는 각 샘플의 15 µ L 플라스틱 고 각 시험관에서 400 µ L의 전체 볼륨에 대 한 각 증류수의 385 µ L를 추가 합니다. 증기 두건에서 각 표준 및 알 수 없는 샘플 테스트 튜브에 5% 페 놀의 400 µ L을 추가 하 고 신속 하 게 플라스틱 집중된 H₂의 2 개 mL 등₄ 각 튜브에. 피 펫 팁 테스트 튜브 내용을 터치 하지, 그냥 화면에 추가할 솔루션 (리피터 피 펫이에 대 한 최고의 작품).
   3. 10 분 동안 품 어 관 게 그리고 신중 하 게 소용돌이 내용을 혼합 튜브. 30 분 추가 대 한 품 어.
      주의: 페 놀 및 황산 부식성 irritants 있습니다. 피부, 눈, 그리고 흡입 노출에서 보호를 포함 하는 적절 한 보호구를 사용 하 여 화학 증기 두건에서이 단계를 수행: 얼굴 방패 또는 눈 고글, 고무 장갑, 랩 앞치마, 그리고 부츠. 혼합 페 놀 황산도에서 발열 반응 결과는 뜨겁게 되 고 튜브에서 발생 합니다.
   4. 각 3 폴리스 티 렌 1.5 mL 세미 마이크로 큐 벳 (샘플 당 3 기술 복제)의 각 관에서 샘플의 800 µ L 플라스틱. 490에서 읽을 분 광 광도 계를 설정 nm. 포함 된 증류수 표준 또는 알 수 없는 샘플, 읽기 전에 간헐적으로 샘플 읽기에 걸쳐 빈 베트를 보정. 분 광 광도 계를 통해 각 베트를 실행 하 고는 흡 광도 기록. 기술에 걸쳐 평균 각 알 수 없는 샘플에 대 한 복제합니다.
      참고: 경우에 따라 샘플 위 흡 광도 임계값을 능가 수 있습니다. 그렇다면, 샘플 단계 3.2.3에 희석 한다. 희석도 후속 계산에 대 한 차지 해야 합니다.
   5. 각 표준에 대 한 평균 흡 광도 계산 합니다.
      참고: 표준 곡선을 사용 하 여 각 알 수 없는 샘플에 총 소화 되기 쉬운 탄수화물의 양을 계산 하는 D (+) 포도 당 각 표준에의 마이크로 그램에 대 한 각 표준의 평균 흡 광도 복귀 하기 쉬운 하지만 하나 또한 수 있습니다. 바람직한 경우 각 표준의 D (+) 포도 당 농도 (µ g / µ L)를 플롯 합니다. 그러나 다음 계산,, 마이크로 그램, 아니라 농도 (µ g / µ L)에 따라 표준 곡선을 참조 하십시오.
   6. 각 표준 솔루션에서 D (+) 포도 당 (µ g)의 총 금액에 대 한 평균 흡 광도 그려서 표준 곡선을 계산 합니다. 이러한 데이터에 선형 회귀선 적합 하 고 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 각 알 수 없는 샘플에서 (µ g) 탄수화물의 총 금액을 계산:
      M_c = (((_x -A b)/m)/(15)) * 1000
      M_c 샘플에서 탄수화물의 µ g =
      _X = 알 수 없는 샘플의 평균 흡 광도
      b = y-절편 (표준 회귀 선)
      m = 경사 (표준 회귀 선)
      이 라인의 상관 계수 보다 큰 0.98 정기적으로 0.99 근처 이어야 한다. 다음, 다음 수식을 사용 하 여 각 샘플에서 탄수화물의 비율을 결정.
      P_c = ((M_c/1000) / (M_i)) * 100
      P_c % 탄수화물 =
      M_나 샘플 (mg)의 초기 질량 =

이러한 방법의 유용성을 표시 하려면 우리는 수용 성 단백질 및 4 개의 다른 분야와 곤충 herbivores에 대 한 개별 잠재적인 영양 자원 역할 sweetcorn 조직의 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠를 분석 했다. 우리는 미국 (미네소타, 노스캐롤라이나, 텍사스)에서 3 개의 농업 지역에서 옥수수의 귀를 수집 달콤한 옥수수 (즉, genotypes)의 5 개의 다른 다양성 및 한의 다양 한 필드 옥수수는 outgroup로 포괄. 표 3 옥수수 샘플 및 그들이 수집에 대 한 요약을 보여 줍니다. 모든 품종 완성도, 수집 하지만 품종 간의 발달 차이 그들은 아니었다 심기 후 같은 날에 수집 된 모든. 우리는 신속 하 게 (수정된 잎 둘러싸고 cob) 껍질을 분리 하 여 별개 조직으로 귀를 처리 하 고 방법에 표시 된 모든 조직으로-80 ° C에서 저장 하기 전에 귀에서 실크 (빛나는 섬유 껍질과 커널 사이). 각 조직 했다 다음 동결. 건조 되 면, 우리는 기지의 끝 면도 최고 1 / 3 (팁) 및 아래쪽 1 / 3에서 커널에 의해 귀 (베이스)는 개 암 나무 열매의에서 커널을 분리. 다음으로, 모든 조직 했다 벌금 파우더로 지상. 우리는 다음 껍질, 실크, 팁 커널 및 수용 성 단백질 및 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 위의 방법에 설명 된 절차에 따라 기본 커널 조직 샘플을 분석. 조직의 사용 가능한 금액에 대 한 제약을 감안할 때, 우리는 수용 성 단백질을 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 217 공장 샘플의 총 분석.

수용 성 단백질
우리 총, 분 광 광도 계를 통해 9 샘플 접시를 실행 하 고 전체, 표준 곡선 0.985 1.00 사이의 값을 가진 높은 상관 관계 계수 (r), 했다. 그림 1 로 얻은 접시에 걸쳐 관찰 한 가변성을 전시 높은 (A) 및 (B) r 최소값 표준 곡선을 보여준다. 우리는 초기 샘플 질량 (표 4)를 사용 하 여 모든 샘플에 대 한 % 수용 성 단백질을 계산 하 고 통계 차이 녹는 단백질 콘텐츠 지역, 종류, 그리고 조직 종류에 대 한 데이터를 분석. 데이터는 순위-정상 가정 필요할 때에 맞게 변형 했다.

우리 지역 (웰 치 ANOVA; 수용 성 단백질 함량에 큰 차이가 관찰 F_{(2, 133.5)} = 4.303, P = 0.015), 결과, 각 영역에서 데이터를 이후에 별도로 분석 했다. 수용 성 단백질 콘텐츠 (양방향 ANOVA;에 다양 한 조직 유형과 사이의 중요 한 상호 작용을 보여 미네소타 샘플 F_{(3, 64)} 16.51, P = 0.001 <). 대부분 조직 기본 커널, 옥수수 다양성 거의 7 번 분야 옥수수 다양성에 비해 금액을 포함 하는 곳을 제외 하 고 유사한 수용 성 단백질, 두 품종에 콘텐츠를 했다. 필드 옥수수 다양 한 (Syngenta/NK-3122A-EZ)에 대 한 껍질 및 실크 비슷한 되었고 모든 조직의 가장 낮은 녹는 단백질 콘텐츠 했다. 귀 끝에서 커널 했다 높은 수용 성 단백질 콘텐츠, 그리고이의 기지에서 커널 중간 했다 (그림 2a). 달콤한 옥수수 다양성 (프로비던스 색)에 대 한 모든 조직 껍데기와 실크 낮은 녹는 단백질 콘텐츠 및 ~2.5 번 팁 커널 (그림 2b) 보다 더 많은 포함 하는 기본 커널 포함 된 별개 했다.

노스 캐롤라이나 샘플 또한 다양 한 조직 유형 (양방향 ANOVA; 사이 중요 한 상호 작용을 보여 F_{(3, 77)} 3.33, P = < 0.024). 대부분 조직 유사한 수용 성 단백질 콘텐츠 비-Bt 다양 (달콤한 G90 하이브리드) 높은 콘텐츠를 전시 팁 커널 제외 품종에 걸쳐 나타났다. Bt 에 대 한 다양 한 (Seedway Bt 1576) 껍질 실크와 유사한 콘텐츠를 했다 팁 커널 콘텐츠, 낮은 녹는 단백질으로 조직 했다. 기본 커널 높은 수용 성 단백질 콘텐츠 했지만 팁 커널 (그림 2c)의 통계적으로 차이가 없었다. 비-Bt 다양 (달콤한 G90 하이브리드), 모든 조직 팁 및 통계적으로 유사 했다 기본 커널을 제외한 별개 했다. 껍질 했다 콘텐츠, 낮은 녹는 단백질 실크, 및 팁과 자료 커널 높은 콘텐츠 (그림 2d) 했다.

텍사스 샘플 종류 (양방향 ANOVA; 사이 수용 성 단백질 함량에 큰 차이가 나타났다 F_{(1, 76)} = 12.91, P = 0.001)와 조직 (양방향 ANOVA; F_{(3, 76)} 21.90 P = < 0.001), 하지만 더 중요 한 상호 작용 (양방향 ANOVA; F_{(3, 76)} 0.436, P = 0.728 =). 전반적으로, 색 다양 한 (Sh2 SS2742 NAT III) 실버 퀸 다양 한 보다 낮은 평균 수용 성 단백질 함량을 보여주었다 (TRTD F1 (su)). 두 종류에 걸쳐 껍질 했다 낮은 단백질 함량, 실크, 뒤 다음 팁 고 기본 커널, 둘 다 했다 마찬가지로 높은 콘텐츠 (그림 2e-f).

소화 되기 쉬운 탄수화물
모든 샘플은 한 번에 분석 되었다, 때문에 우리만 한 표준 곡선을 달렸다. 그림 1 c 상관 계수가 0.998에서 높은 것을 보여준다. 우리는 모든 샘플 (표 5)에 대 한 % 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠를 계산 하 고 통계 차이 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 지역, 종류, 그리고 조직 종류에 대 한 데이터를 분석. 데이터 했다 순위-변형 정상 가정에 맞게 필요할 때.

지역 (ANOVA; 사이 중요 한 차이가 있었다 F_{(2, 216)} 1.47, P = = 0.231), 하지만 우리가 다시 별도로 각 지역에서 데이터를 분석 하는 단백질 분석 연속성을 위해서. 미네소타 샘플 종류 (양방향 ANOVA; 사이 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠에서 상당한 차이가 나타났다 F_{(1, 64)} = 0.00014, P = 0.990) 또는 조직 유형 (양방향 ANOVA; F_{(3, 64)} 0.818, P = 0.489 =). 또한 다양 한 조직 (양방향 ANOVA; 사이 아무 중요 한 상호 작용은 F_{(3, 64)} = 2.26, P = 0.092). 그림 2a -b 는 모든 조직 36.5% (± 0.53)의 평균 콘텐츠 전시 보여줍니다.

노스 캐롤라이나 샘플 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 (양방향 ANOVA;에 조직 형식의 중요 한 효과 보였다 F_{(3, 77)} = 3.99, P = 0.011), 다양성 (양방향 ANOVA;의 영향을 주지 않습니다 하지만 F_{(1, 77)} = 1.06, P = 0.307) 또는 상호 (양방향 ANOVA; F_{(3, 77)} 0.465, P = = 0.708). 그림 2 c -d 되었음을 보여줍니다 실크 낮은 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠, 커널, 그리고 기본 커널 팁 다음 껍질. 모든 조직 실크 및 기본 커널을 제외한 통계적으로 유사 했다.

다양 한 (양방향 ANOVA; 더 큰 영향을 보여주었다 텍사스 샘플 F_{(1, 76)} 0.834, P = = 0.364) 또는 조직 유형 (양방향 ANOVA; F_{(3, 76)} 1.03, P = = 0.385), 하지만 (양방향 ANOVA; 중요 한 상호 작용을 표시 했 어 F_{(3, 76)} = 3.34, P = 0.024). 이 효과 크게 때문에 기본 커널 색 다양 한 (Sh2 SS2742 NAT III)에서 상당히 높은 소화 되기 쉬운 탄수화물 보다 실버 퀸 다양 한 콘텐츠 (TRTD F1 (su)). 그림 2e -f 에 있었다는 것에 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 통계 차이가 조직 종류에서 실버 퀸 다양 한 보여준다 (TRTD F1 (su)), 그러나 실크와 다양 한 색 (기본 커널 조직 사이 상당한 차이가 있었다 Sh2 SS2742 NAT III)입니다.

그림 1입니다. 다량 영양소 분석 실험에 대 한 표준 곡선입니다. (A) 가장 높은 상관 계수 (최고의 커브)와 플레이트를 보여주는 수용 성 단백질 분석 결과 대 한 표준 곡선. (B) 낮은 상관 계수 (최악의 곡선)와 플레이트를 보여주는 수용 성 단백질 분석 결과 대 한 표준 곡선. (C) 소화 되기 쉬운 탄수화물 분석 결과 대 한 표준 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 각 조직의 유형에 대 한 % 수용 성 단백질 및 % 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠를 의미. (A) 미네소타- Bt Syngenta/NK-3122A-EZ (옥수수 분야), (B) 미네소타-비-Bt 프로비던스 색, (C) NC-Seedway Bt 1576, (D) NC-비-Bt 달콤한 G90 하이브리드, (E) TX-Sh2 SS2742 F1 NAT III 바이, (F) TX-실버 퀸 TRTD F1 (su). 원은 사각형 평균 값을 표시 하는 동안 원시 데이터를 보여줍니다. 그린 (껍질), 레드 (실크), 노란색 (팁 커널), 그리고 자주색 (기본 커널) 점선-라인 각 사각형에 연결 하는 원점 표시 각 조직에 대 한 P:C 비율 (비율은 점선의 기울기). 편지 조직에 걸쳐 크게 다른 값을 나타내는 다른 편지와 함께, 측면을 따라 위쪽 및 탄수화물 차이 따라 단백질의 차이 대 한 특별 게시 결과 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1. 수용 성 단백질 분석 결과 대 한 표준 곡선 계산. 각 표준에서 단백질의 양은 각 표준의 농도 및 각 잘 (160 µ L)에서 표준 솔루션의 금액에 곱하여 계산 합니다.

표 2입니다. 소화 되기 쉬운 탄수화물 분석 결과 대 한 표준 곡선 계산. 각 표준에 포도의 각 표준의 농도 복용 하 고 각 테스트 튜브 (400 µ L)에서 표준 솔루션의 금액에 곱하여 계산 됩니다.

테이블 3입니다. 옥수수 샘플링 위치와 종류의 요약. 10 귀 각 지역 및 다양 한 조합에 대 한 수집 및 4 개의 조직 분석 했다: 껍질, 실크, 팁 커널 및 기본 커널.

표 4입니다. 각 지역, 다양 한, 및 조직 유형에 대 한 단백질 값 의미. (마른 질량)에 의해 비율 ± 1 표시 됩니다 의미 SE.

표 5입니다. 각 지역, 다양 한, 및 조직 유형에 대 한 탄수화물 값 의미. (마른 질량)에 의해 비율 ± 1 표시 됩니다 의미 SE.

효과적인 식물 관련 추출 프로토콜 확고 색도계 분석 실험을 결합 함으로써 여기 설명 하는 분석 실험 공장 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠를 측정 하기 위한 합리적이 고 정확한 방법을 제공 합니다. 우리의 결과 옥수수를 사용 하 여 모형 다른 생물학으로 관련 공간 스케일에서 정확한 측정을 얻기 위해 이러한 프로토콜을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. 예를 들어 우리 공장 수용 성 단백질과 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 지리적 지역, 종류 (또는 genotypes), 조직 유형, 그리고 심지어 공간 분리 조직 간의 차이 감지할 수 있었다. 모두 분석을 할 수 있는 일반적인 실험실 장비 및 시 약, 요구만 기본적인 실험실 기술를 사용 하 고 짧은 시간 내 샘플 (50-75)의 비교적 큰 숫자를 분석할 수 있습니다.

비록 상대적으로 쉽게 수행 하기 위해, 몇 가지 단계, 다른 사람 보다 더 중요 한 그리고 제대로 수행 하는 경우는 결과의 정확도 제한할 수 있습니다. 예를 들어 식물 재료는 샘플링 단계에서 제대로 처리 하는 것이 필수적입니다. 심지어 해 부 식물 조직 metabolically 치명적인 온도에 노출 될 때까지 활성 상태로 유지 하 고이 기간 공장 중 다량 영양소 콘텐츠를 변경할 수 있습니다. 그 결과, 식물 사이의 긴 기간 샘플링 및 동결 (액체 N 또는 냉동 저장 하 여 중) 샘플 공장 다량 영양소 콘텐츠를 샘플링 시 내용을 반영 하지 않을 수 있습니다 가능성을 높일 수 있습니다.

다음이 단계 처리 침전 된 단백질으로 단백질 프로토콜에서 단계 2.3.3-2.3.5 성공적인 결과 위해 특히 중요 하다. 단백질 펠 릿의 단백질 함량의 싼 귀 착될 것 이다 때문에 이렇게 microcentrifuge 튜브에서 표면에 뜨는 TCA를 진공 청소기로 청소 하는 때 손실 되지 않도록 주의 해야 합니다. 또한 매우 신속 하 게 그렇게 아세톤과 단백질 펠 릿을 세척 할 경우에 중요 하다. 몇 초 동안 접촉에 남아 있는 경우 아세톤 펠 릿을 저하 수 있습니다. 아세톤 및 5 초 미만에 펠 릿 사이 접촉을 제한 하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 펠 릿 건조, 증발에 아세톤에 대 한 충분 한 시간을 허용 하 게 중요 하다. 펠 릿은 왼쪽 면 너무 오랫동안 건조, NaOH에 resuspend를 매우 어려워집니다. 30 분 동안 펠 릿 건조 관에 있는 액체를 시각적으로 관찰 하거나 신중 하 게 아세톤 가스의 냄새를 감지 하 여 다음, 아세톤의 존재에 대 한 확인 하시기 바랍니다. 펠 릿은 아세톤을 증발 때까지 10-15 분 마다 검사를 계속 합니다.

브래드 퍼 드 1976¹⁶에 설명 된 대로 Coomassie 화려한 블루 G-250 염료를 사용 하 여 정량화 단계 5 µ g 단백질/mL, 높은 단백질 염색 복잡 한 안정성, 그리고에 의해 제한 된 간섭의 표준 편차와 높은 감도 대 한 허용 비 단백질 화합물입니다. 이 분석 결과 (낮은 농도 분석 결과) 잘 microplate 당 1-20 µ g 총 단백질 사이 탐지 범위 또는 최대 25 µ g/mL; 그러나, 높은 기준을 초과 하는 농도 희석 하 고 다시 (같은 희석 재 분석은 필요한 경우에 프로토콜 솔루션의 과잉 생산) 가장 정확한 결과 위해 분석 될 해야 합니다. 우선적으로 기본적인 아미노산, 아르기닌, 등 방향족 아미노산 잔류물;를 바인딩할 염료에 대 한 바이어스가 그러나, Bradford 분석 실험 총 단백질 정량화 혼합된 샘플에 대 한 가장 정확 하 고 편리한 방법 남아 있다.

소화 되기 쉬운 탄수화물 분석 결과 대부분 초 식 동물에 의해 소화 되지 않은 (예: 셀 룰 로스), 구조 탄수화물을 제외 하면서 공장 saccharides를 측정 하는, 비용 효과, 빠르고 간단한 방법 이다. 탄수화물 분석 실험에 가장 문제가 있는 단계는 단계 3.2.1 및 3.3.2-3.3.4. 여기, 그것은 튜브를 똑바로 유지 하 고 끓는, 어떤 물 든 지의 소개 샘플을 희석 하 고 정확한 정량화에 영향을 미칠 경우는 screwcaps 강화 중요. 또한, 케어 페 놀을 작업할 때 촬영 해야 합니다 하 고 모두는 높게 부식성 유황 산, 집중. 우리가 옹호 샘플 흡 광도 490 nm, hexoses에 대 한 최대 흡 광도 하지만 하지 다른 설탕, pentoses 등 및 480 nm^20,21에서 최대 흡 광도가지고 uronic 산에 녹음을 주목 한다. 식물 샘플, 490에에서 설탕 혼합물에 대 한 nm 전체 탄수화물 콘텐츠^22,,2324측정에 대 한 적절 한 파장을 제공 하지만 다른 설탕의 더 상세한 분석을 위한^{20, 참조 21}. 그것은 또한 해야 지적 그 Masuko 외. ²³ 페 놀 황산 산 탄수화물 분석에 대 한 효율적인된 microplate 방법을 제공 한다.

또 다른 주목할 만한 식물 영양소 콘텐츠^25,,2627 계산 방법은 근처-적외선 분광학 (적외선)입니다. 적외선 기술 농업에서 널리 이용 되 고 식량 생산. 이 대체 기술은 비 침범 성, 비파괴, 소요 시간 어떤 습식된 화학 방법에 참여의 일부 이며 식물 조직의 개별 조각 아래로 풍경에서 다양 한 스케일에서 적용 될 수 있습니다. 이 기술은 영양소를 직접 측정 하 고 교정에 대 한 관심의 식물 화학의 정확한 젖은 화학 측정에 의존. 여기에 설명 된 방법을 따라서 식물 영양소 분석, 교정은 가용성과 소화 다량 영양소 정량화에 기반 하 고 하지 비 영양 원소 대리 모 알선에 의해 편 파의 미래에 중요 한 장소를 할 것 이다.

공장 용 해 단백질을 측정 하기 위한 방법을 제시 하 고 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 환경 및 생물 과학에 대 한 중요 한 의미를가지고. 다양 한 식물 조직의 원소 구성에 대 한 정보에도 불구 하 고 공장 다량 영양소 콘텐츠에 대 한 정보는 심각 하 게 부족 합니다. 다량 영양소와 원소 조치를 상호 연결에 한계를 주어진 내용과 인정 공장 사이 강한 관계 영양 콘텐츠 및 더 높은 순서 생태 프로세스, 이런이 종류의 데이터를 얻기 위해 필수적 이다 식물 생리학, 영양 생태학, 식물-초 상호 작용, 음식 웹 역동성^11,,2829,30의 분야를 전진. 그것은 우리의 희망 공장 수용 성 단백질 및 소화 되기 쉬운 탄수화물 콘텐츠 측정을 위한 명확 하 고 친근 한 방법론을 제공 수집 하 고 미래의 연구에 이런이 종류의 데이터를 통합 연구원을 격려 할 것 이다.

저자는 공개 없다.

달콤한 옥수수 필드 컬렉션 도움을 우리의 공동 작업자의 모든 감사 러 벅, 텍사스의 도미 닉 Reisig와 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 댄 모트와 텍사스 A & M 대학에서 팻 포터를 포함 합니다. 감사 피오나 Clissold 프로토콜을 최적화 하 고 제공 하는이 원고를 편집. 이 작품 텍사스 A에 의해 부분적으로 지원 되었다 & M C. Everette Salyer 친목 (곤충학과)과 생명 공학 위험 평가 그랜트 프로그램 경쟁 미국 농 무부에서 no. 2015-33522-24099 부여 (가스에 게 수 여 하 고 STB)입니다.