Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ

Aqui, nós mostramos como usar uma proximidade da ligadura do ensaio (PLA) para visualizar MST1/MST2 heterodimerization em células fixas com alta sensibilidade.

Interações da proteína-proteína regulamentados são um princípio orientador para muitos eventos de sinalização, e a detecção de tais eventos é um elemento importante na compreensão de como tais caminhos são organizados e como eles funcionam. Existem muitos métodos para detectar interações da proteína-proteína nas células, mas relativamente poucos podem ser usados para detectar interações entre proteínas endógenas. Um tal método, o ensaio de ligadura de proximidade (PLA), tem várias vantagens para recomendar seu uso. Em comparação com outros métodos comuns de análise de interação da proteína-proteína, PLA tem relativamente elevada sensibilidade e especificidade, pode ser realizada com manipulação mínima da célula e, no protocolo descrito neste documento, requer apenas dois alvos anticorpos derivados de espécies diferentes (por exemplo., rato e coelho) e um reagente especializado: um conjunto de anticorpos secundários que estão covalentemente ligadas ao específico oligonucleotides que, quando trouxe em estreita proximidade um do outro, criar um ampliáveis plataforma para em situ PCR ou amplificação de círculo rolante. Nesta apresentação, mostramos como aplicar a técnica PLA para visualizar alterações na proximidade MST1 e MST2 em células fixas. A técnica descrita neste manuscrito é particularmente aplicável para a análise de estudos de sinalização celular.

Interrupção de sinalização MST1/Hippo tenha sido conectada para transtornos globais do desenvolvimento e carcinogênese¹. Nos mamíferos, ativam as quinases MST1 e MST2 (fosforilar) MOB1 e LATS1/2, o último dos quais depois fosforila e inactivates ativador transcricional co Sim-associado a proteínas (YAP)². Na sua forma ativa (unphosphorylated), YAP tem atividade oncogênica, realçando a transcrição de genes de proliferação celular; Inversamente, quando YAP é inativado por via de hipopótamo, é suprimida a proliferação celular e apoptose promovida³. Em tecidos, MST1 e MST2 existem principalmente como homodimers ativo, mas estímulos oncogênicos podem aumentar os níveis de MST1/MST2 heterodímeros, e tais heterodímeros são inativos⁴. No entanto, como heterodimerization MST1/MST2 é regulada continua a ser mal compreendido. Homo - e heterodímeros são mediadas através de interações entre regiões de bobina coiled do C-terminal do MST1 e MST2 conhecida como SARAH domínios⁵. Usando um em situ PLA demonstrado neste artigo, vamos mostrar a presença de MST1/MST2 heterodímeros nas células células de Schwann humanas (HSC) e rim embrionário humano (HEK-293). PLA tem uma vantagem sobre outros métodos de deteção de interação da proteína/proteína porque permite a detecção de interações proteína-proteína endógena, que pode ser identificado e quantificado sem a necessidade de expressão do transgene ou o uso do Tag do Resumo ⁶.

Sinalização de vias de transdução em grande parte são controladas pela Associação condicional de proteínas de componente. Por exemplo, estimulação da quinase de tirosina do receptor a maioria leva a sua homo ou hetero-dimerização e subsequente associação com proteínas de sinalização intracelulares adicionais, que eles mesmos formar mais complexos. O objetivo do método PLA é Visualizar a proximidade entre as proteínas nas células, desde que as proteínas são menos de 30-40 nm separados. Proximidade de proteína é geralmente detectada pelo primeiro incubar as células com anticorpos primários adequados levantados em diferentes espécies (EG., coelho e rato) contra cada proteína de interação, então a adição de anticorpos secundários espécie-específicos, sondas de DNA previamente acoplado à curta. Se as sondas de DNA estão nas proximidades, um oligonucleotide vinculação específica do DNA pode vincular simultaneamente tanto destas sondas, formando uma plataforma para a amplificação por em situ PCR ou por mecanismo de círculo de rolamento. Etiquetas fluorescentes adicionadas para a reação de amplificação permitem a visualização das proteínas de interação, que aparecem como pontos fluorescentes que podem ser facilmente quantificados e localizados em regiões específicas na célula^{7,8, 9 , 10}.

1. preparação de soluções

1. Preparar a solução fixador: paraformaldeído 4% (PFA) em PBS 1x. Para 10 mL, 2,5 mL de 16% de tomar PFA e adicione 7,5 mL de 1X PBS.
   Riscos: PFA é cancerígeno em doses baixas. Fumos e contacto com a pele são perigosos. Loja a-20 ° C.
2. Preparar a solução de permeabilização: 0,1% Triton X-100 em 1X PBS. Para 100 mL de solução, adicione 100 µ l de Triton X-100 em 100 mL de 1X PBS. Armazenar em temperatura ambiente (RT).
3. Preparar o tampão de lavagem: 1 x TBST. Para 1L, tome 100 mL de 10 x TBS, 890 mL de dH₂O e 10 mL de Tween 20 (10%).
4. Prepare a solução de bloqueio como fornecido pelo kit. Como alternativa, use 1 solução de 1X PBS contendo 2% de BSA.
5. Prepare o diluente de anticorpo como fornecido pelo kit. Como alternativa, use a solução de PBS 1x 1 contendo 1% de BSA.

2. chapeamento de células

Nota: Neste estudo, utilizamos células de Schwann humanas imortalizado (iHSC) e células embrionárias humanas rim 293 (HEK 293); no entanto, esse método pode ser usado para muitos tipos de células aderentes.

1. Cultura HEK 293 em DMEM suplementado com 10% FBS, 0,2% de glicose, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina G e estreptomicina 100 µ g/mL em placas de cultura de tecidos tratados a 37 ° C em 5% CO₂. Manter iHSC em 10% FBS/DMEM suplementado com caneta/Strep e 2 µM forskolina. Teste rotineiramente as células para o micoplasma. Realizou-se sem autenticação de linha celular.
2. Revestir um slide 16-bem câmara com 50 µ l de 10 µ g/mL natural rato laminina ou 0,01% poli-L-lysine solução e incube por 30 min a 37 ° C em 5% CO₂. Dividir células usando a 0,04% do trypsin-EDTA.
3. Placa iHSC e HEK-293 em 100 µ l de meio da confluência de 80% (15.000-25.000 células/poço).
4. Incube as celulas por 12-24 horas a 37 ° C em um umidificado, 5% CO₂ incubadora.

3. fixação e permeabilização

1. Retire o meio dos poços e lave com 100 µ l de 1X PBS. Aspire com uma micropipeta para minimizar o risco de retirar a amostra.
2. Consertar as células pela adição de 50 µ l de 4% PFA por bem e incubar durante 10 minutos a RT, sem agitação. As células são sensíveis ao desprendimento, para evitar pipetagem de soluções diretamente sobre as células.
3. Lavar as células com 0,05% TBST três vezes por 5 min cada. Aspire com uma micropipeta para minimizar o risco de retirar a amostra.
4. Tratar as células com solução de permeabilização (0,1% Triton x-100 em 1X PBS) por 10 min sem agitação no RT
5. Lavam-se células com TBST por 5 min com agitação por três vezes.

4. bloqueio

1. Toque fora da TBST (muito gentilmente com uma micropipeta). Visualize o slide em um microscópio para ver se as células permanecem ligadas.
2. Adicione uma gota (50-60 µ l) de 1 x solução de bloqueio para cada amostra.
3. Pré-aquecer uma câmara de umidade (caixa vazia de ponta com água) a 37 ° C e a incubar na mesma para 1 h a 37 ° C.

5. anticorpos

1. Diluir os anticorpos primários (1: 100) no diluente anticorpo (ver Tabela de materiais). Prepare a solução de anticorpo 40 µ l por bem.
2. Remova a solução de bloqueio das lâminas de batendo o líquido. Não permita que as células secar.
3. Vórtice e adicionar 40 µ l das soluções de anticorpo para cada poço.
4. Incube 1 h a 37 ° C em uma câmara de umidade pré-aquecido.

6. a proximidade da ligadura do ensaio sondas

Nota: PLA sondas são fornecidas como parte de um kit (veja a Tabela de materiais). A escolha de sondas vai depender da espécie de anticorpos primários usados para detectar as proteínas de interesse.

1. Diluir as duas sondas PLA (anti-rato subtração e adição de anti-coelho) 1:5 em diluente o anticorpo. Para cada amostra, prepare-se 40 µ l de sonda PLA. Incubar a mistura por 20 min no RT
2. Toque fora a solução de anticorpo primário de slides. Lavar as lâminas duas vezes por 5 min cada com amortecedor da lavagem no RT
3. Suavemente, toque do tampão de lavagem das lâminas de e adicionar a solução diluente de sonda PLA poços (40 µ l/poço).
4. Incubar os slides em uma câmara de umidade pré-aquecido por 1h a 37 ° C.

7. ligadura

Nota: A em situ deteção reagentes vermelho, Ligase e ligadura da solução são fornecidos como parte de um kit (veja a Tabela de materiais).

1. Use o em situ deteção reagentes vermelho.
2. Imediatamente antes da utilização, vórtice e diluir os volumes necessários do 5 x estoque de ligadura 1:5 em elevado grau de pureza da água.
   Obs.: Não armazene reagentes diluídos.
3. Toque fora a solução de sonda PLA de slides. Lavar as lâminas em 1x tampão de lavagem duas vezes durante 5 min cada à RT
4. Imediatamente antes da adição de amostras, vórtice e adicionar Ligase para a solução de ligadura em 01:40 diluição e vórtice novamente.
5. Toque fora o tampão de lavagem das lâminas de... e adicione a solução de ligadura/Ligase a cada poço (40 µ l/poço).
6. Incubar os slides em uma câmara de umidade pré-aquecido por 30 min a 37 ° C.

8. amplificação

Nota: O estoque de amplificação é fornecido como parte de um kit (veja a Tabela de materiais). Os reagentes são sensíveis à luz; assim, Evite expor os slides à luz.

1. Vórtice e diluir os volumes necessários do 5 x estoque de amplificação 1:5 em água de alta pureza e misture.
2. Toque fora a solução de ligadura/Ligase de slides. Lavar as lâminas em 1x tampão de lavagem, duas vezes por 2 min cada no RT
3. Vórtice e adicionar o polymerase para a solução de amplificação no 1:80 diluição e vórtice novamente.
4. Toque do tampão de lavagem das lâminas de e adicionar a solução de amplificação/polimerase para cada poço (40 µ l/poço). Incubar os slides em uma câmara de umidade pré-aquecido para 100 min a 37 ° C.

9. preparação para a imagem latente

Nota: Estas são reagentes sensíveis luz. Manter os slides, protegidos da luz.

1. Toque fora a solução de amplificação-Polymerase de slides e lavar duas vezes por 10 min cada em 1x tampão de lavagem em RT
2. Remova as câmaras e silicone em torno dos poços de slide completamente. Raspe os bits restantes de silicone com uma navalha. Desenhar uma grade no slide separando cada um bem.
3. Adicione ~ 40 µ l do meio de montagem com DAPI. Tenha cuidado para evitar aprisionando bolhas de ar sob a lamínula. As bordas da lamínula podem ser seladas com verniz.
4. Aguardar pelo menos 20 min antes de executar a análise de imagem usando um microscópio confocal.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
5. Depois da imagem latente, armazene os slides a-20 º C no escuro.

Usamos o ensaio PLA para testar a interação entre MST1 e MST2 em HEK-293 e iHSC. As células foram fixadas, permeabilizadas e manchadas com vários anticorpos, seguidos de amplificação em situ de acordo com o protocolo PLA (Figura 1). Para documentar o nível de heterodimerization MST1/MST2, células estavam manchadas com anticorpos MST1 e MST2 (figura 1Ae 1C, 1G). Como um controle positivo, também usamos ERK e anticorpos regalia que deverão estar nas proximidades em células com ativado ERK (figura 1B e 1F). Células falta MST1 e MST2 não mostram nenhum sinal PLA (Figura 1). Células coradas com apenas um dos dois anticorpos da mesma forma não mostram nenhum sinal PLA (Figura 1). Estes resultados sugerem que as células HEK-293 e iHSC células contêm MST1/MST2 heterodímeros, consistentes com as conclusões anteriores de nosso laboratório⁴. Como um controle negativo adicional nós incubadas células com anticorpos primários ERK e MST2 para mostrar a especificidade dos sinais (Figura 1 e 1 H).

Para confirmar os níveis de expressão MST1 e MST2, extrai do WT e MST1/MST2 células HEK-293 de nocaute, respectivamente, foram analisadas por immunoblot com os anticorpos indicados (Figura 1I).

Figura 1 : Dados do representante PLA. (A-H) Células foram fixadas e coradas com os anticorpos indicados seguidos o procedimento PLA. Azul: DAPI, vermelho: sinal PLA. Fotomicrografias foram obtidas com um microscópio confocal Leica SP5. (I) Immunoblot para MST1 e MST2. Barra de escala é 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Achamos útil usar lâminas de câmara para esta experiência, como é muito conveniente realizar o experimento com várias linhas de célula (14-16) e não há nenhuma necessidade de mudar a amostra de cada vez durante a análise de microscopia. Algumas complicações podem surgir, tais como um aumento do risco de contaminação cruzada com os anticorpos. Portanto, sugerimos lavar cada poço individualmente em vez de usar uma jarra de Coplin, apesar da maior duração do experimento. Além disso, a remoção da inserção do silicone é um assunto delicado e deve ser feita com cuidado e paciência. Mesmo com técnica meticulosa, às vezes é possível ver pequenas quantidades de detritos do silicone, após a remoção da inserção. Por esta razão, deve-se eliminar a inserção do silicone escrupulosamente, usando uma lâmina de barbear, se necessário, como demais os silicone pode alterar a distância confocal durante a microscopia. Também pode ser útil desenhar linhas como fronteiras de poços após remover a pastilha de silício para ajudar a encontrar células sob o microscópio.

É imperativo usar não-Cruz reativa os anticorpos primários que cada um reconhece apenas um membro do heterodímero (por exemplo, o MST1 anticorpos devem não também reconhece MST2 e vice-versa). Além disso, é importante lembrar usar pontas diferentes para evitar a contaminação cruzada dos anticorpos primários e PLA das sondas, para evitar tocar no fundo do poço e evitar pipetagem diretamente sobre as amostras. Descobrimos que, para iHSC, é melhor casaco câmara slides com solução de 0,01% de poli-L-lisina, e é melhor casaco com laminina de 10 µ g/mL de rato para HEK-293.

Como com qualquer procedimento, existem algumas limitações deste método. O ensaio PLA, enquanto um método poderoso para todos os motivos listados acima, é limitado pela especificidade e sensibilidade dos anticorpos. Além disso, as concentrações de anticorpos e as condições de cultura celular devem ser afinadas antes de experimentos de laboratório são criados para reduzir os custos dos ensaios. A este respeito, uma alternativa para reduzir o custo dos ensaios usar prato sem revestimento 35mm vidro-fundo em vez de slides de câmara.

Uma vantagem do ensaio é que a intensidade e o número de pontos fluorescentes pode ser quantificado usando vários programas de software de computador, como o software Blob-localizador, a ferramenta de imagem Duolink e th Olink Bioscience.

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecemos todo laboratório Chernoff para contribuir para a otimização e validação do presente protocolo, em particular Maria Radu e Galina Semenova. Agradecemos também Andrey Efimov da célula Imaging facilidade no Fox Chase Cancer Center. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do NIH (R01 CA148805) para JC.