Method Article
هنا، نحن تظهر كيفية استخدام مقايسة ربط قرب (جيش التحرير الشعبي) لتصور هيتيروديميريزيشن MST1/MST2 في الخلايا الثابتة مع حساسية عالية.
تفاعلات البروتين البروتين ينظم مبدأ توجيهيا لإحداث إشارات كثيرة، والكشف عن مثل هذه الأحداث عنصر هام في فهم كيفية تنظيم هذه المسارات وكيفية عملها. هناك العديد من الطرق للكشف عن تفاعلات البروتين البروتين في الخلايا، ولكن عدد قليل نسبيا يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات بين البروتينات الذاتية. أحد هذه الأساليب، مقايسة ربط قرب (جيش التحرير الشعبي)، له العديد من المزايا التوصية باستخدامها. مقارنة بالأساليب الأخرى الشائعة لتحليل التفاعل البروتين-بروتين، جيش التحرير الشعبي الصيني لديه حساسية عالية نسبيا وخصوصية، يمكن أن يؤديها بالتلاعب بالخلية الحد الأدنى، وفي البروتوكول الموضحة هنا، يتطلب اثنين فقط محددة الهدف الأجسام المضادة المستمدة من مختلف الأنواع (مثلاً.، من الماوس والارنب) وكاشف المتخصصة واحد: مجموعة من الأجسام المضادة الثانوية التي هي النوكليوتيد مرتبط تساهميا محددة، عندما جلبت على مقربة من بعضها البعض، إنشاء منهاج أمبليفيابل في الموقع PCR أو المتداول دائرة التضخيم. في هذا العرض التقديمي، نعرض كيفية تطبيق تقنية جيش التحرير الشعبي الصيني تصور التغييرات في قرب MST1 و MST2 في الخلايا الثابتة. الأسلوب الموصوفة في هذه المخطوطة ينطبق خاصة لتحليل الخلايا مما يشير إلى دراسات.
تم ربط تعطل إشارات MST1/فرس النهر إلى اضطرابات النمو والتسرطن1. في الثدييات، وتنشيط مؤنزم MST1 و MST2 (فوسفوريلاتي) MOB1 و LATS1/2، هذه الأخيرة التي ثم فوسفوريلاتيس ويحللها المنشط المشارك النسخي البروتين المرتبط بنعم (ياب)2. في شكله النشط (أونفوسفوريلاتيد)، وقد ياب النمطان النشاط، تعزيز النسخ من خلية انتشار الجينات؛ على العكس من ذلك، عندما يتم إلغاء تنشيطه ياب بالمسار فرس النهر، ويتم منع انتشار الخلايا وشجعت المبرمج3. في الأنسجة، MST1 و MST2 موجودة أساسا ك homodimers النشطة، ولكن النمطان المحفزات يمكن أن تزيد من مستويات heterodimers MST1/MST2، وهذه هيتيروديميرس هي غير نشط4. ولكن كيف ينظم هيتيروديميريزيشن MST1/MST2 ما زالت غير مفهومة. كل إنسان-وهيتيروديميرس بالوساطة عن طريق التفاعلات بين مناطق لفائف ملفوف ج-الطرفية MST1 و MST2 المعروفة باسم سارة المجالات5. استخدام في الموقع أثبت جيش التحرير الشعبي الصيني في هذه المقالة، نحن إظهار وجود heterodimers MST1/MST2 في الخلايا خلايا شوان البشرية (HSC) و "الكلي الجنينية البشرية" (HEK-293). جيش التحرير الشعبي الصيني لديه ميزة على أخرى أساليب الكشف عن التفاعل البروتين/البروتين لأنه يسمح بالكشف عن تفاعلات البروتين البروتين الذاتية، التي يمكن تحديدها وقياسها كمياً دون الحاجة للتعبير التحوير أو استخدام العلامات حانمه 6.
إرسال الإشارات تنبيغ مسارات هي تسيطر إلى حد كبير في الرابطة الشرطية من البروتينات المكون. على سبيل المثال، يؤدي تنشيط مستقبلات معظم تيروسين مؤنزم ثنائي هومو أو المتغايرة ورابطة اللاحقة مع إضافية البروتينات الإشارات داخل الخلايا، وهي نفسها شكل مجمعات أخرى. وغرض أسلوب جيش التحرير الشعبي الصيني تصور التقارب بين البروتينات في الخلايا، شريطة أن البروتينات أقل من 30-40 نانومتر وبصرف النظر. عادة ما يتم الكشف عن قرب البروتين بأول حضانة الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة التي أثيرت في الأنواع المختلفة (على سبيل المثال. وارنب وفار) ضد كل من البروتين المتفاعلة، ثم إضافة الأجسام المضادة الثانوية إبلاغها، يسبر الحمض النووي قبل المقرونة بالقصير. إذا المسابير الحمض النووي على مقربة، في نفس الوقت ربط اليغنوكليوتيد الحمض النووي محددة تربط بين كلا من هذه التحقيقات، تشكل منبرا للتضخيم في الموقع PCR أو المتداول إليه دائرة. تسمح العلامات الفلورية إضافة إلى رد فعل التضخيم التصور البروتينات المتفاعلة، والتي تظهر كنيون النقاط التي يمكن قياسها كمياً والمترجمة إلى مناطق معينة في الخلية7،8، سهولة 9 , 10.
1-إعداد الحلول
2-طلاء الخلايا
ملاحظة: في هذه الدراسة، استخدمنا "خلايا شوان" مخلدة البشرية (إيهسك) والخلايا البشرية 293 الكلي الجنينية (HEK 293)؛ ومع ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لأنواع عديدة من الخلايا ملتصقة.
3-التثبيت وبيرميبيليزيشن
4-حظر
5-الابتدائي الأجسام المضادة
6-القرب من ربط المقايسة المسابر
ملاحظة: يتم توفير تحقيقات جيش التحرير الشعبي الصيني كجزء من مجموعة (انظر الجدول للمواد). اختيار المسابر سيعتمد على هذه الأنواع من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة للكشف عن البروتينات ذات الاهتمام.
7-ربط
ملاحظة: في الموقع "كشف الكواشف الأحمر" ليجاسى وربط حل تقدم كجزء من مجموعة (انظر الجدول للمواد).
8-التضخيم
ملاحظة: يتم توفير المخزون التضخيم كجزء من مجموعة (انظر الجدول للمواد). الكواشف حساسة للضوء؛ وبالتالي تجنب تعريض الشرائح للضوء.
9-التحضير للتصوير
ملاحظة: هذه هي الكواشف الحساسة الخفيفة. الاحتفاظ بالشرائح محمية من الضوء.
قمنا باستخدام مقايسة جيش التحرير الشعبي الصيني لاختبار التفاعل بين MST1 و MST2 في HEK-293 وإيهسك. الخلايا الثابتة، بيرميبيليزيد، وملطخة بالأجسام المضادة المختلفة، تليها التضخيم في الموقع وفقا للبروتوكول بجيش التحرير الشعبي الصيني (الشكل 1). لتوثيق مستوى هيتيروديميريزيشن MST1/MST2، كانت ملطخة خلايا أجسام MST1 و MST2 (الشكل 1A، ج 1، و 1 ز). كعنصر إيجابي، كنا أيضا إيرك وتغطرس من الأجسام المضادة التي من المتوقع أن تكون على مقربة في الخلايا مع تنشيط إيرك (الشكل 1B و 1F). إظهار الخلايا التي تفتقر إلى MST1 و MST2 لا إشارة جيش التحرير الشعبي الصيني (الشكل 1). وبالمثل تظهر الخلايا ملطخة بواحد فقط من الأجسام المضادة اثنين لا توجد إشارة جيش التحرير الشعبي الصيني (الشكل 1). هذه النتائج تشير إلى أن HEK-293 الخلايا والخلايا إيسك تحتوي على heterodimers MST1/MST2، يتسق مع النتائج السابقة من لدينا مختبر4. كعنصر تحكم سلبية إضافية نحن المحتضنة الخلايا مع الأجسام الأولية إيرك و MST2 لإظهار خصوصية إشارات (الشكل 1 وح 1).
للتأكد من مستويات التعبير MST1 و MST2، مقتطفات من وزن وخروج المغلوب MST1/MST2 HEK-293 الخلايا، على التوالي، وقام بتحليل إيمونوبلوت مع الأجسام المضادة المشار إليها (رقم 1I).
الشكل 1 : بيانات ممثل جيش التحرير الشعبي الصيني. (أ-ح) الخلايا الثابتة والملون مع الأجسام المضادة المشار إليه متبوعاً بإجراءات جيش التحرير الشعبي الصيني. الأزرق: DAPI، أحمر: إشارة جيش التحرير الشعبي الصيني. وتم الحصول على photomicrographs مع حزمة الخدمة SP5 إيكا مجهر [كنفوكل]. (ط) Immunoblot MST1 و MST2. شريط مقياس هو 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وجدنا أنه من المفيد استخدام الشرائح الزجاجية الدائرة لهذه التجربة، كما أنها مريحة جداً لإجراء التجربة مع العديد من خطوط الخلايا (14-16)، وليس هناك حاجة تغيير النموذج كل مرة أثناء التحليل المجهري. قد تنشأ مضاعفات قليلة، مثل خطر متزايد للتلوث عبر مع الأجسام المضادة. ولذلك، فإننا نقترح الغسيل كل بئر على حدة بدلاً من استخدام جرة كوبلين، على الرغم من زيادة مدة التجربة. وبالإضافة إلى ذلك، إزالة السيليكون إدراج قضية حساسة ويجب أن يتم بعناية وصبر. حتى مع تقنية دقيقة، ومن الممكن في بعض الأحيان لمعرفة كميات صغيرة من السيليكون الحطام بعد إزالة الإدراج. لهذا السبب، واحدة يجب إزالة إدراج سيليكون دقة، استخدام ريزربليد إذا لزم الأمر، كما يمكن أن يغير كثيرا من السيليكون أونريموفيد المسافة [كنفوكل] أثناء الفحص المجهري. يمكن أيضا أن تكون مفيدة لرسم خطوط الحدود للآبار بعد إزالة إدراج السيليكون المساعدة في العثور على الخلايا تحت المجهر.
لا بد من استخدام الأجسام الأولية رد الفعل غير الصليب أن تعترف كل عضو واحد فقط هيتيروديمير (مثلاً MST1 الأجسام المضادة ينبغي أيضا يتعرف MST2 و العكس بالعكس). أيضا، من المهم أن نتذكر أن استخدام نصائح مختلفة لتجنب التلوث عبر الأجسام الأولية وتحقيقات جيش التحرير الشعبي الصيني، لتجنب لمس أسفل البئر وتجنب بيبيتينج مباشرة عبر عينات. وجدنا أن إيسك، من معطف الدائرة الشرائح مع 0.01 ٪ بولي-L-يسين الحل الأفضل، ولأجل HEK-293 من الأفضل أن معطف مع الماوس 10 ميكروغرام/مل لامينين.
كما هو الحال مع أي إجراء، هناك بعض القيود المفروضة على هذا الأسلوب. والرزن جيش التحرير الشعبي الصيني، بينما وسيلة قوية لجميع الأسباب المذكورة أعلاه، محدود بخصوصية وحساسية من الأجسام المضادة. وعلاوة على ذلك، تركيزات الأجسام المضادة وشروط الثقافة خلية ينبغي أن يكون ضبطها بدقة قبل أن يتم إعداد التجارب المختبرية الحد من تكاليف فحوصات. في هذا الصدد، بديل لخفض تكلفة فحوصات استخدام الطبق أسفل الزجاج غير المصقول 35 ملم بدلاً من الشرائح الدائرة.
ميزة التحليل هو أن الكثافة وعدد النقاط الفلورسنت يمكن قياسها كمياً باستخدام مختلف البرامج من الكمبيوتر مثل البرنامج الباحث عن النقطة و "أداة الصورة دولينك" وال أولينك العلوم البيولوجية.
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
ونحن نشكر المختبر تشيرنوف كامل للمساهمة في التحسين والتحقق من هذا البروتوكول، لا سيما رادو ماريا وغالينا سيمينوفا. ونشكر أيضا أندري افيموف مرفق التصوير الخلية في مركز فوكس تشيس للسرطان. وأيد هذا العمل بمنحه من المعاهد الوطنية للصحة (R01 CA148805) إلى جيمي كارتر.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ISSN 2578-2037
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved
We use cookies to enhance your experience on our website.
By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.