その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

ここでは、近接結紮の試金 (PLA) を使用して感度が高い固定細胞における MST1/MST2 heterodimerization を視覚化する方法を示します。

規制の蛋白質蛋白質の相互作用は多くのシグナル伝達イベントの基本理念と、このようなイベントの検出はそのような経路の編成方法と動作を理解する上で重要な要素。細胞のタンパク質-タンパク質相互作用を検出する多くの方法がありますが、比較的少数は内因性のタンパク質間相互作用を検出する使用できます。そのようなメソッドは、近接結紮アッセイ (PLA) には、その使用をお勧めするいくつか利点があります。タンパク質-タンパク質相互作用解析の他の一般的な方法と比較して、PLA は、比較的高い感度と特異性、最小限の細胞操作と、本明細書に記載されているプロトコルに実行できます、ターゲット固有の唯一の 2 つが必要です。種に由来する抗体 (e.g, マウスおよびウサギから) と 1 つの特殊な試薬: 共有リンク特定のオリゴヌクレオチドは、二次抗体のセット、互いの近くになったときに作成、。in situ PCR やローリング サークル増幅の増幅プラットフォーム。このプレゼンテーションでは、固定細胞における MST1 と MST2 近接の変化を視覚化する PLA 手法を適用する方法を示します。本稿で説明する手法は、細胞のシグナル伝達研究の分析に特に当てはまります。

MST1/カバ シグナリングパスの中断は、発達障害や発癌¹に接続されています。哺乳類で MST2 と MST1 キナーゼをアクティブ化 (リン酸化) MOB1 と LATS1/2、後者の場合、廃止し、転写コアクチベーターはい関連タンパク質 (ヤップ)²を不活性化します。アクティブ (ペプタイド) 形式でヤップは発癌性活動は、細胞増殖の遺伝子のトランスクリプションを高める逆に、ヤップはカバ経路による不活化、細胞増殖の抑制し、アポトーシス促進³。体内では、MST1 と MST2 アクティブな homodimers として主に存在しますが、発癌刺激 MST1/MST2 ヘテロのレベルを増やすことができます、このようなヘテロ非アクティブ⁴。ただし、MST1/MST2 heterodimerization の規制方法の不十分な理解ままです。両方ホモ ・ ヘテロが仲介経由MST1 の C ターミナル コイルド コイル領域と相互 MST2 サラ ドメイン⁵として知られています。を使用して、その場でPLA は人間シュワン細胞 (HSC) と人間の萌芽期の腎臓の細胞 (HEK 293) に MST1/MST2 ヘテロの存在を示すこの資料で説明します。PLA は、他のタンパク質・ タンパク質相互作用検出方法上の利点を識別して定量化導入遺伝子発現の必要性または epitope の札の使用なしで内因性のタンパク質の相互作用を検出できるので⁶。

シグナル伝達経路はタンパク質の条件付きの協会によって主制御されます。たとえば、ほとんど受容体チロシンキナーゼの刺激は、ホモまたはヘテロ二量化し追加の細胞内シグナル伝達タンパク質は、自身と後続の協会、さらに錯形成をつながる.PLA 法の目的は、蛋白質がより小さい 30-40 nm 離れて細胞、タンパク質間の距離を可視化することです。タンパク質近接は通常種で発生した適切な一次抗体と細胞を培養して、検出 (e.g、ウサギおよびマウス) 各相互作用の蛋白質に対する種特異的な二次抗体を追加する。短い事前結合 DNA プローブします。DNA プローブは近接、特定リンク DNA のオリゴヌクレオチドの in situ PCR またはローリング サークル メカニズムによって増幅するためのプラットフォームを形成、これらのプローブの両方を同時にバインドできます。増幅反応に追加された蛍光タグにより容易に定量化およびセル^7,8,内の特定の領域にローカライズできる蛍光ドットとして表示される相互作用の蛋白質の可視化^9,10。

1. 溶液の調製

1. 固定液の準備: 1 × PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA)。10 mL の 16% の 2.5 mL を取る PFA 7.5 mL の 1x PBS を追加。
   の危険性:PFA は、低用量で発がん性があります。ガスや皮膚への接触は危険です。-20 ° C にてストア
2. 透過ソリューションを準備: 0.1 %1 × PBS でトリトン X-100。溶液 100 mL、100 mL の 1x PBS にトリトン X-100 の 100 μ L を追加します。常温 (RT) を格納します。
3. 1 x TBST 洗浄バッファーを準備します。。1 L 用 10 x TBS 100 mL、dH₂O, 890 mL と 10 mL の Tween 20 (10%) を取る。
4. キットによって提供されたブロッキング液を準備します。また、1 x PBS 溶液 2 %bsa を使用します。
5. キットによって提供された抗体希釈液を準備します。また、1 x PBS 溶液 1 %bsa を使用します。

2. 細胞のめっき

注:本研究で我々 は不死化ヒト シュワン細胞 (iHSC) と人間の萌芽期の腎臓 293 の細胞 (HEK 293); を使用ただし、付着性のセルの多くの種類のこのメソッドを使用することができます。

1. 文化 10 %dmem の HEK 293 FBS、0.2% グルコース、2 mM L グルタミン、100 U/mL ペニシリン G、100 μ g/mL 5% CO₂の 37 ° C で培養処理板のストレプトマイシン。FBS/DMEM 補完ペン/連鎖球菌と 2 μ M フォルスコリン 10% で iHSC を維持します。マイコ プラズマの細胞を定期的にテストします。セルの行の認証は行われませんでした。
2. 10 μ G/ml 自然マウス ラミニン, 0.01% ポリ L リジン溶液 50 μ L で 16 ウェル チェンバー スライドをコートし、5% CO₂の 37 ° C で 30 分間インキュベートします。0.04% トリプシン-EDTA を使用してセルを分割します。
3. プレート iHSC と 80% 合流 (15,000-25,000 細胞/ウェル) に媒体の 100 μ L の HEK 293。
4. 12 細胞をインキュベート-24 時間加湿、37 ° C で 5% CO₂インキュベーター。

3. 固定・透過

1. 井戸からメディアを取り出して、1 x pbs 100 μ L で洗います。サンプルを削除する危険性を最小限に抑えるためにマイクロ ピペットで吸い出しなさい。
2. 4 %pfa あたりも、撹拌せず常温では、10 分間インキュベートの 50 μ L を追加することによって、セルを修正します。細胞が剥離に敏感、セルに直接ソリューションをピペッティングをしないように。
3. 0.05% 血球を洗浄 3 回各 5 分の TBST。サンプルを削除する危険性を最小限に抑えるためにマイクロ ピペットで吸い出しなさい。
4. 10 分間室温撹拌せず透過ソリューション (1x PBS で 0.1% トリトン x-100) とセルを扱う
5. 3 回の撹拌で各 5 分 tbst 細胞を洗います。

4 ブロック

1. (マイクロ ピペット) で非常に軽く TBST オフをタップします。セルのまま接続されているかどうかを参照してくださいするには顕微鏡でスライドを視覚化します。
2. 各サンプルに x ブロック ソリューション 1 の一滴 (50-60 μ L) を追加します。
3. 予熱して 37 ° c 湿度チャンバー (水と空のヒント ボックス) と 37 ° C で 1 時間のスライドを孵化させなさい

5. 一次抗体

1. 一次抗体 (1: 100) 抗体希釈剤で希釈 (材料の表を参照してください)。ウェルあたり 40 μ L 抗体溶液を準備します。
2. スライドから液体をオフをタップしてブロック ソリューションを削除します。細胞を乾燥させるようにしてください。
3. 渦、各ウェルに抗体溶液の 40 μ L を追加。
4. 予熱した湿度チャンバーで 37 ° C で 1 時間インキュベートします。

6. 近接結紮測定プローブ

注: PLA プローブは、キットの一部として提供されます (材料の表を参照してください)。プローブの選択は興味の蛋白質を検出するために使用する一次抗体の種によって決まります。

1. 2 つの PLA プローブ (抗マウス マイナスとプラス抗家兎) を希釈抗体希釈で 1:5。各サンプルは、PLA プローブの 40 μ L を準備します。室温に 20 分間混合物を孵化させなさい
2. スライドから一次抗体溶液をタップします。室温 2 回洗浄バッファーで各 5 分用のスライドを洗う
3. 軽くスライドから洗浄バッファーのタップし、井戸 (40 μ L/ウェル) に希釈の PLA プローブ ソリューションを追加します。
4. 37 ° C で 1 時間予熱した湿度チャンバー内でスライドを孵化させなさい

7. 結紮

注:の in situ検出試薬赤、リガーゼと結紮ソリューション キットの一部として提供されます (材料の表を参照してください)。

1. その場で検出試薬赤を使用します。
2. 直前に使用、渦および希釈 1:5 の高純度水結紮株式 x 5 の必要なボリューム。
   注: は、希釈した試薬を保管しないでください。
3. オフにスライドから PLA プローブ ソリューションをタップします。室温、5 分のために二度洗浄バッファー x 1 のスライドを洗う
4. サンプルでは、加算の前にすぐに渦 1:40 にリガーゼを結紮ソリューションに追加および希釈と渦をもう一度。
5. スライドから洗浄バッファーをオフにタップし、結紮/リガーゼ ソリューションを各ウェル (40 μ L/ウェル) に追加します。
6. 37 ° C で 30 分間予熱した湿度チャンバー内でスライドを孵化させなさい

8. 増幅

注: 増幅在庫キットの一部として提供が (材料の表を参照してください)。試薬は光に敏感です。光にスライドを公開することを回避します。

1. 渦と増幅株式高純度水の 1:5 x 5 の必要なボリュームを希釈し、ミックスします。
2. オフにスライドから結紮/リガーゼ ソリューションをタップします。室温、2 分のために二度洗浄バッファー × 1 でスライドを洗う
3. 渦、再び 1/80 希釈と渦で増幅ソリューションにポリメラーゼを追加。
4. 洗浄バッファーをオフにスライドからタップし、増幅/ポリメラーゼ ソリューションを各ウェル (40 μ L/ウェル) に追加します。37 ° C で 100 分間予熱した湿度チャンバー内でスライドを孵化させなさい

9. イメージングのための準備

注:これらは光の敏感な試薬です。スライドを光から保護をしてください。

1. スライドから増幅ポリメラーゼ ソリューションをオフにタップし、洗浄 10 分 2 回の x 室温洗浄バッファーごとに 1
2. 完全にチャンバーと井戸のまわりでシリコーンをスライドから削除します。かみそりでシリコンの残りのビットをオフにこすり。それぞれが分離スライドにグリッドを描くも。
3. DAPI でメディアをマウントの ~ 40 μ L を追加します。カバー スリップの下で気泡を引っかけないように注意してください。カバー スリップの端は、マニキュアで密封することができます。
4. 共焦点顕微鏡を用いた画像解析を実行する前に、少なくとも 20 分待ちます。
   注:プロトコルはここで一時停止することができます。
5. イメージング後に、、暗闇の中で-20 ° C でスライドを保存します。

HEK 293 の iHSC MST1 と MST2 の相互作用をテストするのに PLA の試金を使用しました。セルが固定、グリセリン、および PLA プロトコル (図 1) によるとその場で増幅後、種々 の抗体で染色します。MST1/MST2 heterodimerization のレベルを文書化するには、細胞は MST1 MST2 抗体 (図 1 a、1 C、1 G) で染色しました。肯定的な制御としてまた、ERK を使用し、特典の抗体と細胞に近接する予想されるアクティブ化 ERK (図 1 bおよび1 階)。MST1 と MST2 に欠けているセルは PLA 信号 (図 1) を示さない。細胞の 2 つの抗体の 1 つだけのステンド グラスは、同様に、PLA 信号 (図 1) を示さない。HEK 293 細胞と iHSC 細胞を含む MST1/MST2 ヘテロ、私たちの研究室の⁴から前の調査結果と矛盾が示唆されました。追加の否定的な制御信号 (図 1と 1 H) の特異性を示す ERK と MST2 一次抗体と細胞を培養しました。

MST1 と MST2 の表現のレベルを確認する WT から抽出し、MST1/MST2 ノックアウト HEK 293 細胞はそれぞれ、示された抗体 (図 1I) とイムノブロットによって分析されました。

図 1:代表者 PLA データ。(A ~ H)セルは固定され、PLA 手順続いて示された抗体で染色します。青: DAPI、赤: PLA 信号。ライカ SP5 の共焦点顕微鏡と顕微鏡写真が得られました。(I) MST1 と MST2 イムノブロット。スケール バーは、10 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。

(14-16) 培養細胞での実験を実行する非常に便利だし、サンプルの顕微鏡分析中にすべての時間を変更する必要はありません、この実験用チャンバー スライド ガラスを使用すると便利だとわかった。抗体との交差汚染のリスクの増大など、いくつかの合併症が発生します。したがって、各ウェルを洗浄することをお勧め、実験の期間の増加にもかかわらずの Coplin jar を使用する代わりに個別に。さらに、シリコン挿入の除去、繊細な仕事であり、注意と忍耐で行う必要があります。細心の技術とも挿入を除去した後少量のシリコンの残骸を見ることが可能ことがあります。このため、1 つ削除する必要があるシリコン挿入綿密、あまり外しシリコーンは顕微鏡の中に共焦点距離を変えることができるよう必要に応じて、黒人を使用しています。顕微鏡下で細胞を見つけるためにシリコン カバーの取り外し後井戸の境界線として線を描画することもできます。

非交差反応性一次抗体それぞれが、ヘテロダイマーの 1 つだけメンバーを認識することが不可欠です (例えば、 MST1 抗体必要がありますも認識 MST2 と逆)。また、一次抗体と PLA プローブ、井戸の底に触れることを避けるために、サンプルの上に直接ピペッティングを避けるためのクロス汚染を避けるために別のヒントを使用してくださいすることが重要です。わかった、iHSC、それが 0.01% ポリ L リジン溶液でコート チャンバー スライド方、HEK 293 のマウス 10 μ G/ml ラミニン コートをお勧めします。

任意のプロシージャと同様、このメソッドのいくつかの制限があります。すべての理由のための強力なメソッドは、上記 PLA アッセイ特異性と抗体の感度によって限界があります。さらに、抗体濃度と培養条件が細かく前に調整実験法のコストを削減する設定されます。その点で、試金のコストを削減する代わりに、商工会議所のスライドではなくコーティングされていない 35 mm ガラス底皿を使用します。

アッセイの利点は、その強度と Blob ファインダーのソフトウェア、Duolink イメージ ツール、th などの様々 なコンピューター ソフトを使って蛍光ドットの数を定量化することができます Olink 生命科学。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

最適化と特定のマリア ラドゥとガリーナ Semenova で、このプロトコルの検証に貢献する検査室全体のチャーノフに感謝いたします。また、フォックスチェイスがんセンターの細胞イメージング施設のアンドレイ エフィーモフを感謝いたします。この作品は、JC に NIH (R01 CA148805) からの助成金によって支えられました。