Um modelo murino de nervo ciático na Vivo de invasão Perineural

Descrevemos no vivo modelo murino de invasão perineural injetando células de câncer pancreático syngeneic no nervo ciático. O modelo permite a quantificação da extensão da invasão do nervo e apoia a investigação dos mecanismos celulares e moleculares de invasão perineural.

As células cancerosas invadem os nervos através de um processo denominado invasão perineural (PNI), na qual câncer células proliferaram em migram no microambiente do nervo. Este tipo de invasão é exibido por uma variedade de tipos de câncer e muito frequentemente é encontrado no cancer pancreatic. O tamanho microscópico das fibras nervosas dentro de pâncreas de rato processa o estudo de PNI difícil em modelos murino ortotópico. Aqui, descrevemos um modelo heterotópica na vivo do PNI, onde nós injetamos a linhagem de células de câncer pancreático syngeneic Panc02-H7 em nervo ciático murino. Neste modelo, os nervos ciático de ratos anestesiados são expostos e injetados com células cancerosas. As células cancerosas invadem nos nervos proximalmente em direção a medula espinhal, do ponto de injeção. Os nervos ciático invadiram então são extraídos e processados com OCT para secionar congelado. H & E e mancha da imunofluorescência dessas seções permitem a quantificação de ambos o grau de invasão e alterações na expressão da proteína. Este modelo pode ser aplicado a uma variedade de estudos sobre o PNI, dada a sua versatilidade. Usar ratos com modificações genéticas diferentes e/ou diferentes tipos de células cancerosas permite para investigação dos mecanismos celulares e moleculares do PNI e para tipos diferentes de câncer. Além disso, os efeitos de agentes terapêuticos na invasão do nervo podem ser estudados através da aplicação de tratamento para estes ratos.

Os nervos formam um microambiente do tumor específico que estimula o câncer crescimento e migração^1,2,3. Invasão perineural (PNI) é o processo através do qual câncer células invadem em e ao redor dos nervos. Pode ser considerado como uma única rota de metástase desde a invasão do câncer estende longe dos locais de origem, ao longo de nervos. PNI é encontrado em vários tipos de câncer, incluindo pâncreas, próstata, cabeça & pescoço, salivar, cervical e cancros colo-rectais com uma incidência variando de 22% a 100%^1,2. PNI está associado com dor e se correlaciona com o prognóstico pobre e pior sobrevivência taxas^1,2.

Desenvolvimento de modelos de invasão perineural é essencial para elucidar os mecanismos celulares e moleculares deste processo e para testar agentes terapêuticos candidato para diminuir o PNI. Métodos in vitro de estudar as interações entre cânceres e nervos incluem a co-cultura de células de câncer com nervo explantes⁴, com raízes dorsais gânglios^5,6,7ou com células específicas do nervo microambiente como Schwann células⁷. Abordagens na vivo , no entanto, são mais fisiologicamente relevantes, incluem o uso de modelos de rato de câncer no qual câncer foi induzido ou transplantado e têm a vantagem de contabilidade para o microambiente todo nervo. Em ortotópico modelos de câncer pancreático ou da próstata, PNI tem sido relatado^8,9,10 e a incidência de PNI pode ser gravada, mas por causa do pequeno tamanho dos nervos nesses órgãos, é difícil ver a lata inteira e, por conseguinte, para quantificar a extensão do PNI. O modelo que nós descrevemos aqui é um modelo em vivo do PNI no qual câncer células são injetadas para o nervo ciático de ratos através de um procedimento cirúrgico simples¹¹. O transplante heterotópico invade dentro do nervo em direção a medula espinhal. O comprimento da invasão nervo do local da injeção da medula espinhal pode ser medido, bem como o volume do câncer dentro do nervo. Importante, o nervo invadiram também pode ser coletado para uma variedade de ensaios, incluindo análises microscópicas e moleculares. Uma variedade de células de câncer pode ser testada, e os ratos de anfitrião que tenham sido geneticamente modificados ou tratados com compostos específicos podem ser usados também. Este ensaio poderoso permite que as células cancerosas e o microambiente de acolhimento ser modificado para a investigação sobre os mecanismos de PNI.

Todos os procedimentos com animais sujeitos foram aprovados pelo Comitê de uso no Memorial Sloan Kettering Cancer Center e institucional Cuidado Animal.

1. preparação das pilhas de Cancer

1. Colheita sub Panc02-H7 confluentes com tripsina 0,25% por 5 min a 37 ° C. Colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mL.
   Nota: As células são cultivadas em frasco de T-225, que contém cerca de 12 x 10⁶ células por balão na confluência de 80% e tripsina de 4 mL / frasco é usado.
2. Centrifugar as células no x 900 g a 4° C por 5 min. Lave as células por resuspending a célula de pelotas em 1 mL de PBS (pipetando acima e para baixo duas vezes) e a suspensão de transferência para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL no gelo.
3. Centrifugar as células novamente no x 900 g a 4° C por 5 min e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Manter as células peletizadas no gelo até injeção.

2. preparação dos ratos e cirurgia

Nota: camundongos C57BL/6J de 8 semanas de idade, masculinos e femininos são usados neste estudo. As condições de cirurgia segue as regras IACUC da nossa instituição. Os instrumentos são esterilizados, a superfície de trabalho cirúrgico é desinfectada, o animal é desinfectado e o cirurgião usa luvas estéreis.

1. No dia antes da cirurgia, anestesia o mouse usando 2% de isoflurano e em seguida, retire a pele ao longo do comprimento do fêmur do lado dorsal com uma navalha fina ou um agente de remoção química do cabelo.
2. No dia da cirurgia, anestesia os ratos usando 2% isofluorano em uma câmara de indução. Confirme o anesthetization por um estímulo de pitada de dedo do pé e uma falta de resposta.
3. Aplica o vet pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia.
4. Coloque o mouse anestesiado de lado ventral e aperte suavemente cada membro com fita hipoalergênica para criar suave tensão no membro a ser injetado. Anestesia é mantida utilizando isoflurano entregado através de um vaporizador de precisão e cone de nariz.
5. Limpe o local da injeção com Betadine, então novamente com álcool a 70%. Repita este processo mais duas vezes. Certifique-se de que nenhum cabelo solto permanece no campo cirúrgico.
6. Faça uma incisão de 1 cm com uma tesoura pequena aproximadamente 2mm abaixo e paralelo ao fêmur. Retrai a pele com pinças lateralmente para expor os músculos por baixo.
7. O nervo ciático é executado profundo para os músculos glúteos e bíceps femoral. Separar estes dois músculos ao longo de um plano fascial com tesouras pequenas e expor o nervo ciático, por baixo. Livre o nervo dos músculos ao redor usando dissecção romba.
8. Retire 3 μL de células de câncer (cerca de 50.000 células) a pelota em uma seringa de 10 μL.
   Nota: Como alternativa, desenhe 3 μL de PBS como um controle.
9. Coloque uma espátula de metal pequena debaixo do nervo no ponto de injeção para apoio. Sob visualização com um microscópio de dissecação, insira a agulha no nervo contra o metal base, mantendo a agulha como paralela ao nervo como possível mediante a inserção. Tenha cuidado para não perfurar através da parte traseira do nervo. Minimize a manipulação do nervo, tanto quanto possível em todo este processo.
10. Injetar lentamente no nervo mais 5 s. Uma formação de um bulbo na área de injeção indica uma boa injeção. Então, deixe a agulha no lugar por 3 s antes de retirar a agulha suavemente. Mantendo a agulha no lugar por 3 s minimiza recuo das células do nervo.
    Nota: A injeção pode ser realizada para o nervo distal ou da medula espinhal. É importante manter a coerência dentro de um conjunto de experiências. Se as células derramar lá fora, o animal não deve ser incluído na análise do experimento. Com experiência, esses eventos são muito raros.
11. Retorne o nervo para sua posição original. Cubra a lata com os músculos sobrejacentes. Tratar os ratos com analgesia adequada e em seguida, feche a pele com suturas de Nylon 5-0.
12. Coloque o mouse sozinho em uma gaiola limpa em observação durante a recuperação, até que totalmente desperta do anestesia.
    Nota: Demora de 5-15 min para o animal recuperar a plena consciência. O animal não for deixado desacompanhado até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. O animal não é retornado para a companhia de outros animais até que se recuperou totalmente. Posteriormente, avalie a recuperação de pelo menos uma vez a cada 24h por 72 h.

3. o nervo ciático extração

1. No passado dia 7 #, eutanásia os ratos com CO₂. Coloque o mouse de lado ventral e estabilizar os membros distais usando pinos.
2. Retire a pele do lado dorsal do membro injetado e tronco.
3. Usando a dissecção romba, expor o nervo ciático profundo aos músculos.
4. Os cursos do nervo entre o ílio e Sacro. Para ter acesso ao nervo na região da medula espinhal, separe os dois ossos. Primeiro, insira uma tesoura fechada na área estreita, onde se localiza o nervo ciático e então abrir a tesoura, mantendo o mouse. Ser delicado e manter a integridade do nervo ciático durante a dissecção.
5. Cuidadosamente, disse o nervo ciático distalmente à extremidade do fêmur e proximal da medula espinhal.
6. Nota: Invadiu os nervos são extremamente frágeis e propensos à quebra sob tensão ou manipulação enérgica.
7. Colheita do nervo por um primeiro corte sua extremidade distal. Com cuidado, levante o nervo enquanto libertando-o do tecido adjacente. Cortou o nervo na extremidade proximal, tão próximo quanto possível para sua saída da coluna vertebral.
8. Registro, em seguida, comprimento bruto de invasão usando um paquímetro. Esta estimativa macroscópica é apenas indicativa.

4. processamento e quantificação de nervo

1. Incorpore os nervos dissecados em OCT composto. Faça certeza coloc os nervos longitudinalmente e tão plana na parte inferior do molde quanto possível.
2. Indicar o IEF lado proximal e distal do nervo, marcando a letra P e D.
3. Coloque os nervos incorporados em cima do gelo seco, se eles não são seccionados imediatamente. Amostra pode ser preservado a-80 ° C durante várias semanas.
4. Amostras de seção usando um micrótomo criostato em 5 seções de espessura e lugar μm em lâminas de vidro. Se possível, coloque 2 seções de nervo por slide. Indica o lado proximal do nervo.
5. Mancha de slides usando H & E mancha¹².
6. Digitalmente Digitalize secções nervosas manchada com um scanner de slides que fornece dados digitais de alta resolução.
7. Usando o software de imagem, quantificar o comprimento da invasão clicando no botão de distância medida, área de invasão, ou de outros parâmetros de desejado. Para uma boa estimativa do comprimento da invasão, use várias seções (2 a 4) do mesmo nervo.

Este método descreve a implantação cirúrgica de células de câncer pancreático em nervo ciático murino para criar um modelo in vivo da invasão de nervo quantificáveis. A Figura 1 ilustra a localização anatômica do nervo ciático e o local da injeção. A Figura 2 mostra os dois nervos ciático de um rato nude. Um nervo de PBS injetado (à esquerda) pode ser comparado a um nervo injetado com células de câncer de MiaPaCa-2 (à direita). O nervo injetado com células cancerosas está infiltrado por tumor e aparece mais espessa e mais escura que o nervo injetado com PBS.

A Figura 3 mostra as diferenças quantificáveis de invasão de nervo ciático pelas células de câncer pancreático Panc02H7 no tipo selvagem e ratos NCAM KO. NCAM KO ratos são ratos, na qual a molécula de adesão de célula neural de molécula de adesão 1 é deficiente¹³. Comprimento e área da invasão foram quantificados usando o software de imagem. Invasão foi encontrado significativamente reduzida em NCAM KO ratos⁷.

Figura 1 : O nervo ciático de rato e o local da injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Os dois dissecado nervos ciático de um rato. Um PBS injetado nervo (à esquerda) e um nervo injetado com câncer MiaPaCa-2 células (à direita) são mostradas. Setas pretas mostram o local da injeção.  Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : H & Longitudinal E seções dos nervos ciático injetados com células de câncer de Panc02H7 no tipo selvagem e ratos NCAM KO. As setas brancas indicam o local da injeção e lado proximal da medula espinhal. As setas pretas indicam o comprimento de invasão com valores correspondentes (mm). Barra de escala: 5 mm (top imagens) e 0,2 mm (imagens de fundo). Quantificação da invasão de nervo, medida pelo comprimento e área de invasão. Dados representam média ± DP. n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (NCAM1-KO), * * P < 0.005, * * * P < 0,0005 usando teste t. (Resulta da Deborde et al., 2016⁷). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Neste protocolo, descrevemos no vivo modelo murino de invasão perineural que permite a quantificação da invasão do nervo ciático por células de câncer pancreático. Este modelo permite o estudo dos mecanismos moleculares da invasão de nervo. Usando esta técnica de experiências bem sucedidas requerem uma abordagem cuidadosa para três passos críticos no processo: 1) a injeção de células cancerosas (etapas 2.7, 2.8), 2) a extração dos nervos invadiram (passo 3.4) e 3) processamento dos nervos colhidos (passo 4.1).

A injeção deve ser feita com grande cautela para evitar perfurar através da parede traseira do nervo, o que leva a uma perda de células cancerosas. Quando a agulha estiver em vigor, a injeção deve ser feita em um ritmo lento e constante mais 5 s para impedir que a força hidráulica impulsionando o câncer células muito na frente do ponto de injeção. Deixe a agulha no nervo após injeção por um adicional de 3 s irá minimizar fugas de célula trás fluxo e câncer. Durante a extração do nervo ciático, dissecação deve ser muito suave, como o nervo ciático invadiram é muito frágil. Invasão de câncer interrompe a organização celular normal do nervo ciático. Mesmo que invadiu os nervos aparecem engrossar de diâmetro em comparação com não injectada ou não-invadiu os nervos, eles são mais propensos a quebrar com alongamento ainda menores e manipulação. Durante a incorporação do nervo extirpado na OCT para processamento, é muito importante garantir que o nervo é colocado completamente plana sobre o molde. Esta etapa permite o corte da amostra para capturar todo o comprimento do nervo para análise adequada. Tumor sólido no nervo frequentemente precisa ser aparado para impedir que o segmento de nervo proximal ao tumor de levantar o nervo fora da parte inferior do molde. Todo o comprimento do nervo deve ser colocado completamente plana contra o molde.

Muitas modificações podem ser consideradas enquanto estiver usando este protocolo. Quando uma pequena espátula de metal não está disponível para ser colocado sob o nervo ciático, a superfície de um par de pinças ampla pode ser usada em vez disso. Um fórceps pode ser usado para segurar a agulha no lugar após a inserção, embora as desvantagens dessa abordagem são uma visão reduzida da injeção e potencial para esmagar o nervo se aplicar demasiada força. Outra maneira é usar uma pinça bem para levantar o nervo, em seguida, abrir a pinça para alongar os nervos. Este método é mais fácil de executar e fornece tensão e estabilização durante a injeção, mas pode danificar o nervo com alongamento excessivo do nervo. A injeção pode ser feita em qualquer direção proximal ou distal, mas encontramos que em ambos os casos, a direção da invasão câncer é tipicamente em direção a medula espinhal. Portanto, nós preferimos injetar distalmente para minimizar ainda mais a força hidráulica que pode empurrar as células cancerosas em direção a medula espinhal e confundir posteriores medidas de comprimento da invasão. Aconselhamos que é importante ser consistente na escolha da direção de injeção dentro de um conjunto de experiências.

Embora nós apresentamos um modelo de enxertia de syngeneic, uma técnica similar pode ser usada para as células de câncer humano xenografts em camundongos imunodeficientes, com apenas pequenas variações. Xenografts em camundongos podem necessários longos períodos de invasão do câncer para produzir semelhantes comprimentos de invasão de nervo, como nos modelos syngeneic. Linhas de células de câncer diferente também podem ser usadas. PNI não só é prevalente no câncer de pâncreas, mas também da cabeça e pescoço, próstata e câncer de pele. Nosso laboratório tem injetado com sucesso camundongos no nervo ciático, com linhas de células de câncer de pâncreas humano MiaPaCa-2 e Panc1^7,14,15.

Possíveis efeitos adversos incluem deiscência de ferida, como os ratos ocasionalmente mastigam seus pontos, resultando na abertura da ferida. Nesse caso, a ferida precisa ser re-costurados. Verificamos a ferida diariamente para os 3 primeiros dias pós-operatórios. Os ratos podem também caminhar com um ligeiro coxear no pós-operatório, provavelmente devido à dor de tanto o procedimento cirúrgico bem como invasão de seu nervo ciático com câncer. Isso geralmente não é grave o suficiente para exigir medicação para a dor.

Este modelo tem limitações. Alguma quantidade de alongamento e compressão do nervo durante o procedimento pode criar danos no nervo. Além disso, é difícil controlar o número exato de células para o nervo. Além disso, este modelo é limitado para o estudo das células que já invadiu os nervos. Não é um modelo para estudar a interação dos nervos com células de câncer localizadas no tumor primário. A principal desvantagem de usar os nervos ciático contra os nervos do trato gastrintestinal é que o nervo ciático não é um site metastático do câncer pancreático. A diferença na composição e a natureza das fibras do nervo pode influenciar a invasão. No entanto, a acessibilidade e o tamanho muito pequeno dos nervos do pâncreas não permitiria tal estudo.

Nossas principais sugestões para os iniciantes seria para remover o cabelo em torno dos locais de incisão planejada, uma área ampla para que os marcos podem ser facilmente identificados e certifique-se de ter uma posição firme antes de começar a injetar. Depois de muitas injeções, o intérprete deve ser capaz de obter 100% de animais com invasão de nervo.

Este modelo permite o estudo das interações entre cânceres e nervos em um modelo animal. Pode ser aplicado a uma ampla gama de estudos oncológicos usando ratos geneticamente modificados, células cancerosas ou ambos. Tratamentos farmacológicos contra a invasão de tumor ao longo de nervos também podem ser testados, comparando o comprimento e a área de invasão entre os grupos tratamento e controle. Estas diferentes aplicações possíveis fazem este modelo uma ferramenta extremamente versátil e poderosa para estudar PNI.

Os autores não têm nada para divulgar.

Os autores reconhecem os serviços técnicos fornecidos pelo centro de citologia molecular e a facilidade de animais do Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Este trabalho foi financiado por doações de NIH CA157686 (para R.J. Wong) e P30 CA008748 (concessão de apoio do Memorial Sloan Kettering Cancer Center).