Eine In Vivo murinen Ischiasnerv Modell Perineural Invasion

Wir beschreiben eine in Vivo Mausmodell Perineural Invasion durch Einspritzen von Phänomen pankreatischen Krebszellen in den Ischiasnerv. Das Modell ermöglicht eine Quantifizierung des Ausmaßes der Nerv Invasion und Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen der Perineural Invasion unterstützt.

Krebszellen dringen in Nerven durch einen Prozess bezeichnet Perineural Invasion (PNI), in denen Krebs Zellen vermehren sich und Wandern in den Nerv Mikroumgebung. Diese Art der Invasion wird durch eine Vielzahl von Krebsarten ausgestellt und findet sich sehr häufig bei Bauchspeicheldrüsenkrebs. Die mikroskopische Größe der Nervenfasern innerhalb Maus Bauchspeicheldrüse macht das Studium der PNI in Orthotopic murinen Modellen schwierig. Hier beschreiben wir eine heterotopisch in Vivo Modell des PNI, wo wir den murinen Ischiasnerv Phänomen Pankreatischer Krebs-Zell-Linie Panc02-H7 zuzuführen. In diesem Modell sind Ischias Nerven narkotisierten Mäuse ausgesetzt und mit Krebszellen injiziert. Die Krebszellen dringen in den Nerven nach proximal in Richtung Rückenmark ab dem Zeitpunkt der Injektion. Drangen Ischias Nerven sind dann extrahiert und verarbeitet mit OCT für gefrorenes schneiden. H & E und Immunfluoreszenz-Färbung dieser Abschnitte erlauben Quantifizierung von sowohl der Grad der Invasion und Änderungen im Protein-Expression. Dieses Modell kann auf eine Vielzahl von Studien auf seine Vielseitigkeit PNI angewendet werden. Mit Hilfe von Mäusen mit unterschiedlichen genetischen Veränderungen und/oder verschiedene Arten von Krebszellen ermöglicht die Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen der PNI und verschiedenen Krebsarten. Darüber hinaus können die Auswirkungen von Therapeutika auf Nerv Invasion durch Behandlung mit diesen Mäusen untersucht werden.

Nerven bilden einen bestimmten Tumor Mikroumgebung, die Krebs Wachstum und Migration^1,2,3stimuliert. Perineural Invasion (PNI) ist der Prozess, durch welche, den Krebs Zellen in und um die Nerven dringen. Es kann als eine individuelle Route von Metastasen da Krebs Invasion von den Stätten der Ursprung entlang Nerven erstreckt. PNI findet sich bei verschiedenen Krebsarten, einschließlich Bauchspeicheldrüse, Prostata, Kopf & Hals, Speicheldrüsen, Hals-, und Kolorektale Karzinome mit einer Inzidenz von 22 % bis 100 %^1,2. PNI ist mit Schmerzen verbunden und korreliert mit schlechter Prognose und schlechter Überleben Rate^1,2.

Entwicklung von Modellen der Perineural Invasion ist unerlässlich, die zellulären und molekularen Mechanismen dieses Prozesses aufzuklären und Kandidat Therapeutika PNI verringern zu testen. In-vitro- Methoden des Studierens Wechselwirkungen zwischen Krebserkrankungen und Nerven gehören Kokulturen von Krebszellen mit Nerv Explantaten⁴, Dorsal Root Ganglien^5,6,7, oder bestimmte Zellen vom Nerv Zellen Mikroumgebung wie Schwann⁷. In Vivo Ansätze jedoch mehr physiologisch relevant sind, umfassen die Verwendung von Krebs Mausmodelle, in denen Krebs induzierte oder transplantiert wurde, und haben den Vorteil der Rechnungslegung für die gesamte Nerv Mikroumgebung. Im orthotopen Modelle von Pankreas oder Prostata Krebs, PNI wurde gemeldeten^8,9,10 und die Inzidenz von PNI kann aufgezeichnet werden, aber wegen der geringen Größe der Nerven in diese Organe, ist es schwer zu sehen den gesamten Nerv und damit das Ausmaß der PNI zu quantifizieren. Die, die wir hier beschreiben ist ein in Vivo Modell des PNI in welcher Krebs Zellen in den Ischiasnerv von Mäusen durch einen einfachen chirurgischen Eingriff¹¹injiziert werden. Die heterotopisch Transplantation dringt innerhalb der Nerv in Richtung Rückenmark. Die Länge der Nerv Invasion von der Website der Injektion des Rückenmarks kann gemessen werden, sowie die Lautstärke des Krebses in den Nerv. Wichtig ist, kann die angegriffene Nerven auch für eine Vielzahl von Tests einschließlich mikroskopische und Molekulare Analysen gesammelt werden. Eine Vielzahl von Krebszellen kann getestet werden, und die Host-Mäuse, die genetisch modifiziert oder mit bestimmten Substanzen behandelt wurden sowie verwendet werden. Dieser leistungsstarke Assay ermöglicht die Krebszellen und der Host Mikroumgebung für die Untersuchung der Mechanismen der PNI geändert werden.

Alle Verfahren mit tierischen Probanden stimmten die institutionellen Animal Care und Use Committee am Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

1. Vorbereitung der Krebszellen

1. Ernte Sub konfluierende Panc02 H7 Zellen mit 0,25 % Trypsin für 5 min bei 37 ° C. Sammeln Sie die Zellen in einem Zentrifugenröhrchen 15 mL.
   Hinweis: Die Zellen wachsen in T-225 Kolben, enthält etwa 12 x 10⁶ Zellen pro Flasche bei 80 % Konfluenz und 4 mL Trypsin / Kolben verwendet wird.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen an x 900 g bei 4° C für 5 min. Waschen der Zellen durch die Zelle resuspending pellet in 1 mL PBS (durch pipettieren zweimal rauf und runter) und übertragen die Aussetzung zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder auf x 900 g bei 4° C für 5 min und verwerfen Sie den überstand, ohne zu stören das Pellet. Bewahren Sie die gebeizte Zellen auf Eis bis Injektion.

2. Vorbereitung der Mäuse und Chirurgie

Hinweis: 8 Wochen alten, männlichen und weiblichen C57BL/6J Mäuse werden in dieser Studie verwendet. Die Chirurgie-Bedingungen gelten die IACUC Regeln unserer Institution. Die Instrumente sterilisiert, chirurgische Arbeitsfläche desinfiziert, das Tier wird desinfiziert und der Chirurg trägt sterile Handschuhe.

1. Am Tag vor der Operation die Maus mit 2 % Isofluran zu betäuben und dann das Fell über die Länge des Oberschenkelknochens an der dorsalen Seite mit einer dünnen Rasierklinge oder einem chemischen Haar Entfernung Agent entfernen.
2. Am Tag der Operation die Mäuse, die mit 2 % Isofluorane in eine Induktion-Kammer zu betäuben. Die Anesthetization von Zehen Prise Ansporn und ein Mangel an Antwort zu bestätigen.
3. Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Augen, Trockenheit in Narkose zu verhindern.
4. Legen Sie die narkotisierten Maus auf die ventrale Seite und sichern Sie sanft jede Extremität mit hypoallergenen Klebestreifen erstelle ich milde Spannung in der Extremität injiziert werden. Anästhesie ist gepflegt mit Isofluran über eine Präzision Vaporizer und bugnase geliefert.
5. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit Betadine, dann wieder mit 70 % Alkohol. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal. Stellen Sie sicher, dass keine losen Haare auf das OP-Feld bleibt.
6. Machen Sie einen 1 cm Schnitt mit einer kleinen Schere ca. 2 mm unterhalb und parallel in den Oberschenkelknochen. Zurückziehen der Haut mit einer Pinzette seitlich um die Muskeln unter aussetzen.
7. Der Ischiasnerv verläuft tief in die Muskeln Gluteus Maximus und Bizeps Femoris. Diese beiden Muskeln entlang einer faszialen Ebene mit einer kleinen Schere zu trennen und den Ischiasnerv unter aussetzen. Kostenlos den Nerv von den umliegenden Muskeln mit stumpfe Dissektion.
8. Ziehen Sie 3 μL von Krebszellen (ca. 50.000 Zellen) aus das Pellet in eine 10 μl Spritze.
   Hinweis: Alternativ zeichnen Sie 3 μl PBS als ein Steuerelement.
9. Legen Sie eine kleine Metallspatel unter den Nerv zum Zeitpunkt der Injektion für die Unterstützung. Stechen Sie unter Visualisierung mit einem sezierenden Mikroskop die Nadel in den Nerv gegen Metallfuß, halten Sie die Nadel als parallel zu den Nerv wie möglich beim einsetzen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht durch die Hintertür des Nervs zu durchbohren. Minimieren Sie die Handhabung des Nervs im Laufe dieses Prozesses so weit wie möglich.
10. Langsam injizieren in den Nerv über 5 s. Eine Formation von einer Glühbirne im Bereich Injektion zeigt eine gute Injektion. Dann lassen Sie die Nadel für 3 s vor dem Entfernen der Nadelöhrs sanft. Halten die Nadel im Ort für 3 s minimiert Rückfluss der Zellen aus den Nerv.
    Hinweis: Injektion kann in Richtung der distalen Nerven oder das Rückenmark durchgeführt werden. Es ist wichtig, innerhalb einer Reihe von Experimenten konsistent bleiben. Wenn die Zellen außerhalb verschütten, sollte das Tier nicht in der Analyse des Experiments enthalten. Mit Erfahrung sind diese Ereignisse sehr selten.
11. Den Nerv in seine ursprüngliche Position zurück. Decken Sie den Nerv mit den darüber liegenden Muskeln. Behandeln Sie die Mäuse mit dem richtigen Analgesie zu, und schließen Sie dann die Haut mit 5: 0-Nylon-Fäden.
12. Platzieren Sie den Mauszeiger in einem sauberen Käfig für die Beobachtung während der Wiederherstellung, allein, bis es vollständig aus der Narkose erwacht.
    Hinweis: Es dauert 5-15 min für das Tier zu vollständigem Bewusstsein wieder zu erlangen. Das Tier ist nicht unbeaufsichtigt gelassen, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Das Tier wird nicht an die Gesellschaft anderer Tiere bis vollständig erholt zurückgegeben. Danach bewerten Sie Erholung mindestens einmal alle 24 h für 72 h.

3. n. ischiadicus Extraktion

1. Am OP Tag #7 einschläfern Sie die Mäuse mit CO₂. Platzieren Sie den Mauszeiger auf der Bauchseite und stabilisieren Sie die distalen Extremitäten mit Hilfe der Pins.
2. Entfernen Sie die Haut an der dorsalen Seite des injizierten Gliedmaßen und Rumpf.
3. Verwenden stumpfe Dissektion, aussetzen der Ischiasnerv tief in die Muskeln.
4. Die Nerv-Kurse zwischen dem Ilium und dem Kreuzbein. Um Zugriff auf die Nerven im Rückenmark Region haben, trennen Sie die beiden Knochen. Legen Sie zuerst geschlossenen Schere im schmalen Bereich befindet sich der Ischiasnerv und öffnen Sie dann die Schere halten Sie die Maus. Sein zart und die Integrität des Nervus ischiadicus während der Präparation.
5. Sorgfältig den Ischiasnerv bis zum Ende des Femur distal und proximal des Rückenmarks zu sezieren.
6. Hinweis: Angegriffene Nerven sind sehr zerbrechlich und anfällig für Bruch unter Spannung oder gewaltsame Behandlung.
7. Ernten Sie den Nerv durch erste schneiden ihrem distale Ende. Heben Sie vorsichtig den Nerv während aus angrenzenden Gewebe zu befreien. Schneiden Sie den Nerv am proximalen Ende, so nah wie möglich an seinem Austritt aus der Wirbelsäule.
8. Datensatz dann Brutto Länge der Invasion mit einem Nonius-Bremssattel. Diese makroskopische Abschätzung ist nur indikativ.

(4) Nerven Sie Verarbeitung und Quantifizierung

1. Nervus seziert in zusammengesetzten OCT einbetten. Vergewissern Sie sich, Nerven längs zu platzieren und so flach auf den Boden der Form wie möglich.
2. Zeigen Sie auf der Kassette der proximalen und distalen Seite des Nervs durch markieren den Buchstaben P und D.
3. Platzieren Sie eingebettete Nerven auf Trockeneis, wenn sie nicht sofort geschnitten werden. Probe konnte bei-80 ° C für mehrere Wochen erhalten.
4. Abschnitt Muster mit einem Kryostat Mikrotom bei 5 μm Dicke und Ort Abschnitte auf Objektträgern. Wenn möglich, passen Sie 2 Nerven Abschnitte pro Folie. Proximalen Seite des Nervs anzugeben.
5. Führen Sie Folien mit H & E Färbung¹²zu Flecken.
6. Digital Scan gebeizt Nerv Abschnitte mit einem Dia-Scanner, der hochauflösende digitale Daten bereitstellt.
7. Mit imaging-Software, die Länge der Invasion durch Klicken auf die Schaltfläche Maßnahme Abstand zu quantifizieren, Bereich der Invasion oder anderen gewünschten Parameter. Verwenden Sie für eine gute Einschätzung der Länge der Invasion mehrere Abschnitte (2 bis 4) auf den gleichen Nerv.

Diese Methode beschreibt die chirurgische Implantation der pankreatischen Krebszellen in der murinen Ischiasnerv, ein in Vivo Modell quantifizierbare Nerv Invasion zu erstellen. Abbildung 1 zeigt die anatomische Lage des Nervus ischiadicus und der Injektionsstelle. Abbildung 2 zeigt die zwei Ischias Nerven eine nackte Maus. Ein Nerv injiziert PBS (links) kann auf einen Nerv injiziert mit MiaPaCa-2 Krebszellen (rechts) verglichen werden. Der Nerv mit Krebszellen injiziert wird durch Tumor infiltriert und erscheint dicker und dunkler als bei den Nerv injiziert mit PBS.

Abbildung 3 zeigt die quantifizierbaren Unterschiede der Ischiasnerv Invasion von Bauchspeicheldrüsenkrebs Zelle Panc02H7 in Wildtyp und NCAM KO Mäusen. NCAM KO-Mäuse sind Mäuse, die in denen Molekül neuronaler Zelladhäsion Adhäsionsmolekül 1 mangelhaft¹³ist. Länge und Fläche der Invasion haben imaging-Software quantifiziert worden. Invasion wurde deutlich reduzierten NCAM KO Mäusen⁷gefunden.

Abbildung 1 : Die Maus Ischiasnerv und der Injektionsstelle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Die beiden seziert Ischias Nerven Mausklick. Eine PBS injiziert Nerv (links) und einen Nerv injiziert mit MiaPaCa-2 Krebs Zellen (rechts) gezeigt werden. Schwarze Pfeile zeigen an der Injektionsstelle.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : H & E längs Abschnitte des Ischias-Nerven mit Panc02H7 Krebszellen im Wildtyp und NCAM KO Mäusen injiziert. Weiße Pfeile zeigen die Website der Injektion und proximalen Seite des Rückenmarks. Die schwarzen Pfeile zeigen die Länge der Invasion mit entsprechenden Werten (mm). Maßstab: 5 mm (obere Bilder) und 0,2 mm (Bilder unten). Quantifizierung der Nerv Invasion, gemessen an Länge und Fläche der Invasion. Darstellung von Daten Mittelwert ± SD n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (NCAM1 KO), ** P < 0,005, *** P < 0,0005 mit t-Test. (Ergibt sich aus Deborde Et Al., 2016⁷). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine in Vivo Mausmodell Perineural Invasion, die für die Quantifizierung der Ischiasnerv Invasion von pankreatischen Krebszellen ermöglicht. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Nerv Invasion. Erfolgreiche Experimente mit dieser Technik erfordern eine sorgfältige Annäherung an drei wichtige Schritte im Prozess: (1) die Injektion von Krebszellen (Schritte 2.7, 2.8), (2) die Gewinnung von angegriffene Nerven (Schritt 3.4) und (3) die Verarbeitung der geernteten Nerven (Schritt 4.1).

Die Injektion sollte mit großer Vorsicht zu vermeiden, durch die Rückwand des Nervs, die zu einem Verlust von Krebszellen führt Punktion durchgeführt werden. Sobald die Nadel vorhanden ist, die Injektion sollte erfolgen in einem langsamen und stetigen Tempo über 5 s zu verhindern, dass die hydraulische Kraft treibt die Krebs-Zellen zu weit nach vorne unter dem Gesichtspunkt der Injektion. Lassen Sie die Nadel in den Nerv nach der Injektion für eine zusätzliche 3 s wird zurück fließen und Krebs Zelle Leckage minimiert. Während der Ischiasnerv Extraktion muss die Dissektion sehr sanft, wie der angegriffene Ischiasnerv sehr zerbrechlich ist. Krebs-Invasion stört die normale zelluläre Organisation des Nervus ischiadicus. Obwohl angegriffene Nerven scheinen verdicken Durchmesser im Vergleich zu nicht gespritzt oder Nerven nicht eingefallen, sie sind anfälliger für Bruch mit bereits geringe Dehnung und Manipulation. Beim Einbetten des ausgeschnittenen Nerven im Oktober für die Verarbeitung, ist es sehr wichtig, um sicherzustellen, dass die Nerven völlig flach auf die Form gelegt wird. Dieser Schritt ermöglicht die Aufteilung der Probe, die gesamte Länge des Nerven für die richtige Analyse zu erfassen. Soliden Tumoren auf den Nerv muss oft getrimmt werden, um den Nerv Segment proximal des Tumors von der Erhöhung des Nervs aus dem Boden der Form zu verhindern. Die gesamte Länge des Nervs muss völlig flach gegen die Form gelegt werden.

Viele Modifikationen können betrachtet werden, während der Verwendung dieses Protokolls. Bei einem kleinen Spatel zu unterstellen, der Ischiasnerv nicht vorliegt, kann die Oberfläche eines Paares von breiten Zange stattdessen verwendet werden. Eine Zange kann verwendet werden, um die Nadel nach dem Einfügen in Position zu halten, obwohl die Nachteile dieses Ansatzes sind eine verminderte Sicht der Einspritzung und Potenzial um den Nerv zu vernichten, wenn übermäßige Gewalt eingesetzt wird. Eine weitere Möglichkeit ist mit einer feinen Pinzette heben Sie den Nerv, dann Öffnen der Zange um die Nerven zu dehnen. Diese Methode ist einfacher ausgeführt und bietet Spannung und Stabilisierung beim Einspritzen, aber beschädigen den Nerv mit übermäßige Dehnung des Nervs. Die Injektion kann in einem proximalen oder distalen Richtung getan, aber wir haben festgestellt, dass in beiden Fällen die Richtung der Krebs-Invasion in der Regel in Richtung Rückenmark. Deshalb bevorzugen wir Injektion distal um weitere hydraulischen Kraft zu minimieren, der die Krebszellen auf das Rückenmark drücken, und späteren Maßnahmen der Länge der Invasion zu verwirren. Wir empfehlen, dass es wichtig ist, bei der Wahl der einspritzrichtung innerhalb einer Reihe von Experimenten übereinstimmen.

Obwohl wir ein Modell der Pfropfung Phänomen darstellen, kann eine ähnliche Technik für Xenotransplantate menschlichen Krebszellen in immungeschwächte Mäuse, mit nur leichten Variationen verwendet werden. Bei nackten Mäusen Xenotransplantate können erforderliche längere Krebs Invasion ähnliche Längen der Nerv Invasion wie Phänomen Modelle liefern. Verschiedenen Krebszelllinien können auch verwendet werden. PNI ist nicht nur weit verbreitet in der Krebs der Bauchspeicheldrüse, aber auch von Kopf und Hals, Prostata- und Hautkrebs. Unser Labor hat erfolgreich nackten Mäusen in den Ischiasnerv mit menschlichen pankreatischen Krebszelllinien MiaPaCa-2 und Panc1^7,14,15injiziert.

Mögliche Nebenwirkungen sind Wunde Dehiszenz, die Mäusen gelegentlich ihre Stiche resultierenden Öffnung der Wunde kauen. In diesem Fall müssten die Wunde wieder genäht werden. Wir überprüfen die Wunde täglich für die ersten 3 postoperativen Tage. Die Mäuse können auch mit einem leichten hinken postoperativ, wahrscheinlich aufgrund der Schmerzen von sowohl der chirurgischen Eingriff sowie Invasion von ihren Ischiasnerv mit Krebs zu Fuß. Dies ist in der Regel nicht schwerwiegend genug, um Schmerzmittel benötigen.

Dieses Modell hat Grenzen. Gewisses Maß an Dehnung und Einklemmen des Nervs während des Verfahrens kann Schäden in den Nervenzellen erstellen. Darüber hinaus ist es schwierig, die genaue Anzahl der Zellen in den Nerv zu kontrollieren. Darüber hinaus ist dieses Modell beschränkt sich auf die Untersuchung von Zellen, die bereits Nerven eingedrungen sind. Es ist kein Modell, das Zusammenspiel von Nerven mit Krebszellen befindet sich in der Primärtumor zu studieren. Der größte Nachteil der Verwendung der Ischias Nerven im Vergleich zu Nerven des Magen-Darm-Trakt ist, dass der Ischiasnerv kein metastasiertem Bauchspeicheldrüsenkrebs ist. Der Unterschied in der Zusammensetzung und die Art der Nervenfasern könnten die Invasion beeinflussen. Jedoch würde die Zugänglichkeit und die sehr geringe Größe der pankreatischen Nerven nicht solch eine Studie erlauben.

Unsere wichtigsten Vorschläge für Anfänger wäre, das Haar in einem weiten Bereich um die geplante Einschnitt-Websites zu entfernen, so dass die Sehenswürdigkeiten leicht identifiziert werden können und um sicherzustellen, dass eine stabile Position vor Beginn zu injizieren. Nach vielen Injektionen sollte der ausführende zu 100 % der Tiere mit Nerv Invasion.

Dieses Modell ermöglicht für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Krebserkrankungen und Nerven im Tiermodell. Es kann zu einer Vielzahl von onkologischen Studien mit genetisch veränderten Mäusen, Krebszellen oder beides angewendet werden. Pharmakologische Behandlungen gegen Tumorinvasion entlang Nerven können auch getestet werden, Länge und Bereich der Invasion zwischen Behandlung und Kontrollgruppen verglichen. Diese unterschiedlichen Einsatzmöglichkeiten machen dieses Modell ein extrem vielseitiges und leistungsstarkes Werkzeug für die Untersuchung PNI.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Autoren erkennen die technischen Leistungen der molekularen Zytologie und tierischen Facility des Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH-Stipendien CA157686 (zu r.j. Wong) und P30 CA008748 (Memorial Sloan Kettering Cancer Center Unterstützung gewähren).