Un modello In Vivo murino nervo sciatico di invasione perineurale

Descriviamo un modello murino in vivo di invasione perineurale iniettando le cellule tumorali pancreatiche syngeneic nel nervo sciatico. Il modello consente per la quantificazione del grado di invasione del nervo e appoggia la indagine dei meccanismi cellulari e molecolari dell'invasione perineurale.

Le cellule tumorali invadono nervi attraverso un processo chiamato invasione perineurale (PNI), in cui il cancro cellule proliferano e migrano nel microambiente del nervo. Questo tipo di invasione è esposto da una varietà di tipi di cancro e molto spesso è trovato nel cancro del pancreas. Le dimensioni microscopiche di fibre nervose all'interno del pancreas del mouse rende difficile in modelli murini di orthotopic lo studio del PNI. Qui, descriviamo un modello heterotopic in vivo di PNI, dove iniettiamo la linea cellulare di cancro del pancreas syngeneic Panc02-H7 nel nervo sciatico murino. In questo modello, nervi sciatici dei topi anestetizzati sono esposti e iniettati con le cellule tumorali. Le cellule tumorali invadono nei nervi prossimalmente verso il midollo spinale dal punto di iniezione. Il nervo sciatico invaso vengono poi estratti e trattato con OCT per sezionamento congelati. H & E e colorazione di immunofluorescenza di queste sezioni permettono di quantificazione di entrambi il grado di invasione e cambiamenti nell'espressione della proteina. Questo modello può essere applicato ad una varietà di studi su PNI data la sua versatilità. Utilizzando topi con diverse modificazioni genetiche e/o diversi tipi di cellule tumorali permette di indagine dei meccanismi cellulari e molecolari di PNI e per diversi tipi di cancro. Inoltre, gli effetti di agenti terapeutici sulla invasione del nervo possono essere studiati mediante l'applicazione di trattamento a questi topi.

I nervi formano un microambiente tumorale specifico che stimola il cancro crescita e migrazione^1,2,3. Invasione perineurale (PNI) è il processo attraverso cui il cancro cellule invadono in e intorno ai nervi. Può essere considerato come un unico itinerario della metastasi dall'invasione tumorale estende lontano dai siti di origine lungo i nervi. PNI è trovato in molti tipi di cancro tra cui testa del pancreas, della prostata & collo, salivario, cervicale e cancri colorettali con un'incidenza che varia da 22% a 100%^1,2. PNI è associato con dolore e correla con la prognosi difficile e peggio sopravvivenza tariffe^1,2.

Sviluppo di modelli di invasione perineurale è essenziale per delucidare i meccanismi cellulari e molecolari di questo processo e per candidati agenti terapeutici per ridurre PNI di test. Metodi in vitro di studiare le interazioni tra tumori e nervi comprendono la co-coltura delle cellule tumorali con nervo espianti⁴, con radice dorsale i gangli^5,6,7o con celle specifiche dal nervo microambiente come Schwann cells⁷. In vivo gli approcci, tuttavia, sono più fisiologicamente rilevanti, includono l'uso di modelli murini di cancro in cui il cancro è stato indotto o trapiantato e hanno il vantaggio di contabilità per il microambiente intero nervo. In orthotopic modelli di cancro del pancreas o della prostata, PNI è stato segnalato^8,9,10 e l'incidenza delle PNI può essere registrata, ma a causa delle piccole dimensioni dei nervi in quegli organi, è difficile da vedere l'intero nervo e quindi per quantificare l'entità del PNI. Il modello che qui descritto è un modello in vivo di PNI in cui il cancro le cellule vengono iniettate nel nervo sciatico dei topi tramite un semplice intervento chirurgico¹¹. Il trapianto heterotopic invade all'interno del nervo verso il midollo spinale. La lunghezza dell'invasione del nervo dal sito di iniezione al midollo spinale può essere misurata, così come il volume del cancro all'interno del nervo. D'importanza, il nervo invaso possa essere raccolti anche per una varietà di analisi compreso analisi microscopiche e molecolare. Una varietà di cellule tumorali possa essere testata, e i topi di host che sono stati geneticamente modificati o trattati con composti specifici possono essere usati pure. Questo potente test permette di essere modificate per indagine sui meccanismi di PNI per le cellule tumorali e il microambiente di host.

Tutte le procedure con soggetti di animali sono state approvate dal comitato di uso al Memorial Sloan Kettering Cancer Center e istituzionali Animal Care.

1. preparazione delle cellule tumorali

1. Raccolta cellule Panc02-H7 Sub-confluenti con tripsina 0,25% per 5 min a 37 ° C. Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   Nota: Le cellule sono coltivate in pallone a T-225, che contiene circa 12 x 10⁶ cellule per beuta a confluency di 80% e la tripsina 4ml / boccetta è usato.
2. Centrifugare le cellule a x 900 g a 4° C per 5 min, lavare le cellule da Risospendere la cella a pellet in 1 mL di PBS (pipettando su e giù due volte) e trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio.
3. Centrifugare le cellule nuovamente alle x 900 g a 4° C per 5 min e scartare il sopranatante senza disturbare il pellet. Mantenere le cellule pellettate su ghiaccio fino a iniezione.

2. preparazione dei topi e chirurgia

Nota: topi C57BL/6J 8-settimana-vecchi, maschi e femmine vengono utilizzati in questo studio. Le condizioni di chirurgia IACUC alle regole della nostra istituzione. Gli strumenti sono sterilizzati, la superficie di lavoro chirurgico viene disinfettata, l'animale viene disinfettata e il chirurgo indossa guanti sterili.

1. Il giorno prima della chirurgia, anestetizzare il mouse usando 2% isoflurane e quindi rimuovere il pelo lungo la lunghezza del femore sul lato dorsale con un rasoio sottile o un agente di rimozione dei capelli chimici.
2. Il giorno dell'intervento chirurgico, anestetizzare i topi utilizzando 2% isofluorano in un'aula di induzione. Confermare l'amputate da uno stimolo di pizzico di punta e una mancanza di risposta.
3. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza sotto anestesia.
4. Posizionare il mouse anestetizzato sul lato ventrale e fissare delicatamente ogni arto con nastro ipoallergenico per creare leggera tensione dell'arto deve essere iniettato. L'anestesia è effettuata utilizzando isoflurano consegnato tramite un vaporizzatore di precisione e il cono di naso.
5. Pulire il sito di iniezione con Betadine, poi di nuovo con alcool al 70%. Ripetere questo processo due volte. Assicurarsi che nessun capelli sciolti rimangono il campo chirurgico.
6. Praticare un'incisione di 1 cm con piccole forbici circa 2 mm di sotto e parallelo al femore. Ritirare la pelle con il forcipe lateralmente per esporre i muscoli sotto.
7. Il nervo sciatico viene eseguito profondo ai muscoli grande gluteo e bicipite femorale. Separare questi due muscoli lungo un piano fascia con piccole forbici ed esporre il nervo sciatico sotto. Liberare il nervo dai muscoli circostanti mediante dissezione smussa.
8. Disegnare 3 μL di cancro cellule (circa 50.000) dal pellet in una siringa da 10 μL.
   Nota: In alternativa, disegnare 3 μL di PBS come controllo.
9. Posto una piccola spatola di metallo sotto il nervo nel punto di iniezione per il supporto. Nell'ambito di visualizzazione con un microscopio da dissezione, inserire l'ago il nervo contro la base in metallo, mantenendo l'ago come parallelo al nervo possibile al momento dell'inserimento. Fare attenzione a non forare attraverso la parte posteriore del nervo. Ridurre al minimo la manipolazione del nervo per quanto possibile nel corso di questo processo.
10. Iniettare lentamente il nervo oltre 5 s. Una formazione di una lampadina nella zona di iniezione indica una bella iniezione. Quindi lasciare l'ago nel posto per 3 s prima di rimuovere l'ago delicatamente. Mantenere l'ago in posizione per 3 s minimizza il riflusso delle cellule fuori il nervo.
    Nota: L'iniezione può essere eseguita verso il distale del nervo o del midollo spinale. È importante rimanere coerenti all'interno di un set di esperimenti. Se le cellule fuoriuscire all'esterno, l'animale non deve essere incluso nell'analisi dell'esperimento. Con esperienza, questi eventi sono molto rari.
11. Restituire il nervo nella sua posizione originale. Coprire il nervo con i muscoli sovrastanti. Trattare i topi con analgesia adeguata e quindi chiudere la pelle con i suturare di Nylon 5-0.
12. Posizionare il mouse da solo in una gabbia pulita per osservazione durante il recupero, fino a che completamente si risveglia dall'anestesia.
    Nota: Ci vogliono 5-15 min per l'animale a ritrovare la piena consapevolezza. L'animale non viene lasciato incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. L'animale non viene restituito alla compagnia di altri animali fino a quando completamente recuperato. Da allora in poi, valutare il recupero almeno una volta ogni 24 h per 72 h.

3. nervo sciatico estrazione

1. Il giorno del postop #7, eutanasia i topi con CO₂. Posizionare il mouse sul lato ventrale e stabilizzare gli arti distali con perni.
2. Togliere la pelle dal lato dorsale dell'arto iniettato e torso.
3. Mediante dissezione smussa, esporre il nervo sciatico profondo ai muscoli.
4. I corsi del nervo tra l'ileo e l'osso sacro. Per avere accesso al nervo alla regione del midollo spinale, separare le due ossa. Inserire prima le forbici chiuse nella ristretta area in cui si trova il nervo sciatico e quindi aprire le forbici tenendo il mouse. Essere delicato e mantenere l'integrità del nervo sciatico durante la dissezione.
5. Accuratamente sezionare il nervo sciatico distalmente alla fine del femore e prossimalmente al midollo spinale.
6. Nota: Invaso i nervi sono estremamente fragili e inclini a rottura sotto tensione o di forte manipolazione.
7. Vendemmia del nervo dal primo taglio sua estremità distale. Sollevare con cautela il nervo mentre liberandola dal tessuto adiacente. Tagliare il nervo all'estremità prossimale, più vicino possibile alla sua uscita dalla colonna vertebrale.
8. Registrare quindi lordo lunghezza dell'invasione utilizzando un calibro a corsoio. Questa valutazione macroscopica è solo indicativa.

4. elaborazione e quantificazione del nervo

1. Incorporare il nervo sezionato in OCT composto. Fare attenzione a posizionare i nervi longitudinalmente e come piatto sul fondo dello stampo come possibile.
2. Indicare sulla cassetta lato prossimale e distale del nervo contrassegnando la lettera P e D.
3. Posto nervi incorporati sulla cima di ghiaccio secco, se essi non vengono sezionate immediatamente. Campione può essere conservato a-80 ° C per diverse settimane.
4. Esempi di sezione utilizzando un microtomo criostato a 5 μm di spessore e posto sezioni sulle lastre di vetro. Se possibile, montare 2 sezioni del nervo per ogni diapositiva. Indicare lato prossimale del nervo.
5. Macchia di diapositive utilizzando H & E¹²di colorazione.
6. Scansione digitale sezioni macchiate del nervo con un-scanner per diapositive che fornisce dati digitali ad alta risoluzione.
7. Utilizzando il software di imaging, quantificare la lunghezza dell'invasione facendo clic sul pulsante di distanza di misura, desiderato zona di invasione, o altri parametri. Per una buona stima della lunghezza dell'invasione, utilizzare più sezioni (da 2 a 4) del nervo stesso.

Questo metodo viene descritto l'impianto chirurgico di cellule di cancro al pancreas nel nervo sciatico murino per creare un modello in vivo di invasione del nervo quantificabili. La figura 1 illustra la posizione anatomica del nervo sciatico e il sito di iniezione. La figura 2 Mostra i due nervi sciatici di un topo nudo. Un nervo di PBS iniettato (a sinistra) può essere paragonato ad un nervo iniettato con cellule tumorali MiaPaCa-2 (a destra). Il nervo iniettato con cellule tumorali è infiltrato da tumore ed appare sia più spesso e più scura rispetto al nervo iniettato con PBS.

Figura 3 Mostra le differenze quantificabili di nervo sciatico invasione da parte delle cellule di cancro del pancreas Panc02H7 in topi KO NCAM e wild-type. NCAM KO topi sono topi in cui la molecola di adesione neurale delle cellule della molecola 1 di adesione è carente¹³. Lunghezza e area di invasione sono stati quantificati utilizzando software di imaging. L'invasione è stata trovata significativamente ridotto in NCAM KO topi⁷.

Figura 1 : Il nervo sciatico del mouse e nel sito di iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : I due dissecato i nervi sciatici di un mouse. Un PBS iniettato nervo (a sinistra) e un nervo iniettato con cancro MiaPaCa-2 cellule (a destra) sono mostrate. Frecce nere mostrano nel sito di iniezione.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : H & E longitudinale sezioni dei nervi sciatico iniettati con cellule tumorali Panc02H7 in wild type e NCAM KO topi. Frecce bianche indicano il sito di iniezione e lato prossimale del midollo spinale. Le frecce nere indicano il periodo di invasione con valori corrispondenti (mm). Barra della scala: 5 mm (top immagini) e 0,2 mm (immagini di fondo). Quantificazione dell'invasione del nervo, come misurato dalla lunghezza e area di invasione. I dati rappresentano la media ± SD. n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (NCAM1 KO), * * P < 0,005, * * * P < 0.0005 utilizzando il test t. (Risultati da Deborde et al., 2016⁷). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo protocollo viene descritto un modello murino in vivo dell'invasione perineurale che permette per la quantificazione del nervo sciatico invasione dalle cellule di cancro del pancreas. Questo modello permette lo studio dei meccanismi molecolari dell'invasione del nervo. Esperimenti riusciti utilizzando questa tecnica richiedono un approccio attento a tre passaggi critici nel processo: 1) l'iniezione delle cellule tumorali (passi 2.7, 2.8), 2) l'estrazione dei nervi invasi (punto 3.4) e 3) elaborazione dei nervi raccolti (punto 4.1).

L'iniezione dovrebbe essere fatto con molta cautela per evitare di perforare attraverso la parete posteriore del nervo, che conduce ad una perdita di cellule tumorali. Una volta che l'ago è in posizione, l'iniezione deve essere eseguita ad un ritmo lento e costante oltre 5 s per impedire la forza idraulica di propulsione il cancro cellule troppo in avanti dal punto di iniezione. Lasciare l'ago nel nervo dopo l'iniezione per un supplemento di 3 s riduce al minimo la perdita delle cellule posteriore flusso e cancro. Durante l'estrazione del nervo sciatico, dissezione deve essere molto delicata come il nervo sciatico invaso è molto fragile. Invasione di cancro sconvolge la normale organizzazione cellulare del nervo sciatico. Anche se hanno invaso i nervi appaiono addensare di diametro rispetto ai non-iniettato o non invaso i nervi, sono più inclini alla rottura con stretching anche lievi e manipolazione. Durante l'incorporamento del nervo asportato in ottobre per l'elaborazione, è molto importante assicurare che il nervo è appoggiato completamente piatta sullo stampo. Questo passaggio consente di catturare l'intera lunghezza del nervo per un'adeguata analisi per il sezionamento del campione. Tumore solido sul nervo spesso deve essere tagliata per evitare che il segmento del nervo prossimale al tumore dal sollevare il nervo fuori dalla parte inferiore dello stampo. L'intera lunghezza del nervo deve essere posato completamente piatta contro la muffa.

Molte modifiche possono essere considerate durante l'utilizzo di questo protocollo. Quando una piccola spatola di metallo non è disponibile per essere posta sotto il nervo sciatico, la superficie di un paio di pinze ampie può essere utilizzata invece. Un forcipe può essere utilizzato per tenere l'ago in posizione dopo l'inserimento, anche se i lati negativi di questo approccio sono una vista diminuita l'iniezione e la possibilità di schiacciare il nervo se viene utilizzata una forza eccessiva. Un altro modo consiste nell'utilizzare un forcipe fine di sollevare il nervo, quindi aprendo il forcipe per distendere i nervi. Questo metodo è più facile da eseguire e fornisce la tensione e la stabilizzazione durante l'iniezione, ma può danneggiare il nervo con eccessivo stiramento del nervo. L'iniezione può essere fatta in senso prossimale o distale, ma abbiamo trovato che in entrambi i casi, la direzione dell'invasione del cancro è in genere verso il midollo spinale. Di conseguenza, noi preferiamo iniettando distalmente per ridurre ulteriormente la forza idraulica che può spingere le cellule tumorali verso il midollo spinale e confondere successive misure di lunghezza di invasione. Si consiglia che è importante essere coerenti nella scelta della direzione di iniezione all'interno di un set di esperimenti.

Anche se vi presentiamo un modello di trapianto syngeneic, una tecnica simile utilizzabile per le cellule tumorali umane di xenotrapianti in topi immunodeficienti, con solo lievi variazioni. Gli xenotrapianti in topi nudi possono richiesti lunghi periodi di invasione tumorale a produrre simili lunghezze dell'invasione del nervo come nei modelli syngeneic. Linee cellulari tumorali differenti possono anche essere utilizzati. PNI non è solo diffuso nel cancro del pancreas, ma anche di testa e collo, prostata e tumori della pelle. Il nostro laboratorio ha iniettato con successo topi nudi nel nervo sciatico con linee cellulari di cancro del pancreas umano MiaPaCa-2 e Panc1^7,14,15.

Possibili eventi avversi includono deiscenza della ferita, come i topi occasionalmente masticare loro punti con conseguente apertura della ferita. In tal caso, la ferita avrebbe bisogno di essere ri-cucita. Controlliamo la ferita ogni giorno per i primi 3 giorni post-operatori. I topi possono anche camminare con una zoppia lieve postoperatorio, probabilmente a causa di dolore da sia la procedura chirurgica, nonché l'invasione del loro nervo sciatico con cancro. Questo non è solitamente abbastanza grave da richiedere farmaci contro il dolore.

Questo modello presenta limitazioni. Alcune quantità di stretching e pizzicamento del nervo durante la procedura potrebbe creare danni al nervo. Inoltre, è difficile controllare l'esatto numero di cellule andando nel nervo. Inoltre, questo modello è limitato allo studio delle cellule che hanno già invaso i nervi. Non si tratta di un modello per studiare l'interazione dei nervi con le cellule tumorali che si trova nel tumore primario. Lo svantaggio principale dell'utilizzo il nervo sciatico contro i nervi del tratto gastrointestinale è che il nervo sciatico non è un luogo metastatico del cancro del pancreas. La differenza nella composizione e la natura delle fibre nervose potrebbe influenzare l'invasione. Tuttavia, l'accessibilità e la dimensione molto piccola dei nervi del pancreas non consentirebbe un tale studio.

I nostri suggerimenti chiavi per i principianti sarebbe per rimuovere i peli in una vasta area intorno ai siti di incisione pianificata affinché i punti di riferimento possono essere facilmente identificati e di assicurarsi di avere una posizione stabile prima di iniziare a iniettare. Dopo molte iniezioni, l'esecutore deve essere in grado di ottenere il 100% degli animali con l'invasione del nervo.

Questo modello permette lo studio delle interazioni tra tumori e nervi in un modello animale. Può essere applicato a una vasta gamma di studi oncologici utilizzando topi geneticamente modificati, le cellule tumorali o entrambi. Trattamenti farmacologici contro l'invasione del tumore lungo i nervi possono essere testati anche confrontando la lunghezza e la zona di invasione tra gruppi di trattamento e di controllo. Queste diverse possibili applicazioni fanno di questo modello uno strumento estremamente versatile e potente per lo studio di PNI.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Gli autori riconoscono i servizi tecnici forniti dall'impianto di citologia molecolare e la struttura animale del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio NIH CA157686 (per R.J. Wong) e P30 CA008748 (concessione di supporto Memorial Sloan Kettering Cancer Center).