Metodologias para o estudo

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

comunidades bacterianas multi-celulares desempenham papéis importantes em ambientes naturais e antropogênicas, e pode ser benéfica ou altamente prejudicial. Estas colónias multi-celulares são conhecidos como biofilmes, em que as células individuais são embutidos em um (EPS) de matriz extracelular substâncias poliméricas auto-produzido. Os EPS aderir fortemente as células à superfície, eles colonizam. Eles servem como um escudo contra as forças mecânicas e químicas e criar contacto próximo entre as células vizinhas, facilitando a comunicação celular ^1. Um biofilme pode ser visto como uma comunidade diferenciada, em que as células usam altamente regulado, orquestrada processos para coordenar as suas actividades no seio da comunidade, bem como entre espécies ^2-5. A transição de uma planctônicas, o modo de vida livre do crescimento a um estado de biofilme é frequentemente associada com os processos de desenvolvimento. Um bom exemplo é o Bacillus subtilis bactéria do solo Gram-positivas, e, portanto, uma undomeestirpe sticated serve como um organismo modelo robusto para estudar os estágios de desenvolvimento que conduzem a formação de biofilme. Nesta bactéria, células móveis se organizam em estruturas multicelulares conspícuos que realizam tarefas especializadas ^4. Um grupo de células, a matriz-produtores secretam exopolissacáridos ^6, a proteína amilóide tasa ^7,8, e a proteína de hidrofobicidade da superfície BslA ^9,10; todos os que participam da montagem dos EPS ^11-13.

Dada a abundância de biofilmes em nichos naturais e antrópicos e os danos fatais putativo eles podem causar, há uma necessidade premente de encontrar formas de prevenir a sua formação. inibidores de moléculas pequenas podem auxiliar na descoberta de novas vias reguladoras, enzimas e proteínas estruturais envolvidas na formação de biofilme, e, assim, promover insights os complexos processos de montagem comunidade multicelular. Como B. subtilis é um modelo bem estudado para bioformação de película ^14,15, ele pode ser usado para avaliar os efeitos de vários inibidores de biofilme. Este estudo aborda quatro métodos fundamentais que são a chave para avaliar a resposta de biofilmes a inibidores de pequenas moléculas. Em primeiro lugar, para assegurar que estes inibidores têm um alvo específico do biofilme, a separação do efeito sobre o crescimento planctônicas de o efeito sobre a formação de biofilme é crítica. A maioria dos agentes antibacterianos como alvo as células em sua fase de crescimento planctônicas, mas as moléculas que têm como alvo o estilo de vida biofilme são raros. Além disso, como as moléculas que não afectam o crescimento planctônicas não são tóxicos, podem reduzir a pressão selectiva favorecendo mutantes resistentes a antibióticos ^16. Por exemplo, quando biofilmes são tratados com D-aminoácidos ou determinadas outras moléculas interferentes da parede celular, eles são ou perturbada ou desmontado, mas estes inibidores apenas afectam moderadamente ^12,17 crescimento planctônicas. Em contraste, muitos antibióticos prejudicar drasticamente o crescimento planctônicas, com little ou nenhum efeito sobre a formação de biofilme ^17.

Em segundo lugar, que estabelece um quadro experimental consistente e robusta para estudar o efeito de as moléculas pequenas é crucial. Observou-se que o intervalo de concentração activa de inibidores de moléculas pequenas era sensível às condições de pré-cultura e para a instalação experimental utilizada para estudar o efeito destes inibidores de moléculas pequenas. Vários relatórios, particularmente aqueles que estudam B. subtilis, revelou variações no intervalo de concentrações em que D-aminoácidos inibem a formação de películas - as flutuantes biofilmes bacterianas ^12,17-19. Os resultados aqui apresentados sugerem que os seguintes fatores em conta as diferenças na faixa de concentração ativa: as condições pré-cultura (logarítmica ^12,17 ante fase de ²⁰ crescimento tardio-estacionária), o meio de crescimento utilizada na condição de pré-cultura (rico, indefinido [Caldo de Luria, LB] versus definido [glutamato monossódico-glicerol, MSgg]), a proporção da inoculação e, especialmente, a remoção do meio de pré-cultura antes da inoculação. A temperatura de crescimento da película estática mostrou um papel menos importante na gama do inibidor de molécula pequena de D-leucina, uma D-aminoácido representativa utilizada neste estudo a actividade.

Finalmente, uma vez que os biofilmes são tratados com inibidores específicos de biofilme, métodos robustos e informativas são necessários para caracterizar os efeitos destes inibidores sobre a aptidão do biofilme. Aqui, dois métodos para caracterizar de forma independente do efeito de inibidores de moléculas pequenas são descritos em detalhe: (1) O efeito sobre as células individuais dentro de uma colónia de biofilme e a sua resistência a agentes antimicrobianos. As células em biofilmes são tipicamente mais resistentes a antibióticos quando comparado com as bactérias de vida livre ^21-23. Embora este fenómeno é multifactorial, a capacidade do EPS para reduzir a penetração de antibiótico foi muitas vezes considerado como uma explicação atraente ²⁴ . Este método avalia a sobrevivência de células do biofilme pré-estabelecido após a exposição a substâncias antibacterianas. (2) O efeito sobre a arquitectura do biofilme colónia, a partir da grande para a pequena escala. colónias de biofilme são caracterizados pela sua estrutura tridimensional e a presença do EPS. Utilizando microscopia eletrônica de varredura, as alterações na morfologia celular, estrutura da colônia de biofilme e a arquitetura e abundância das EPS pode ser visualizado a partir do grande (mm) para a pequena escala (mm).

1. Avaliar o efeito de pequenas moléculas inibidores de Película e formação de biofilme Colony

1. Prepara-se uma solução de meio de indução de biofilme MSgg definido 2x ²⁵ sem o cloreto de cálcio e ferro (III), cloreto de hexa-hidrato. Após a esterilização do filtro, adicionar o cloreto de cálcio. O meio é pronto para usar directamente ou pode ser armazenado a 4 ° C no escuro.
2. Preparar uma diluição 1x MSgg no dia da experiência.
   1. Dilui-se o meio 2x MSgg para 1x com água destilada estéril (películas) ou ágar estéril de 3% quente (80 ° C) (biofilmes) e adicionar ferro (III) hexa-hidratado cloreto a uma concentração final de 50 uM (películas) ou 250 uM ( biofilmes). Adicionar antibióticos ou inibidores de moléculas pequenas para a concentração desejada e misturar bem. Por exemplo, para se obter uma concentração final de mM de D-leucina em 30 ml de 0,5 para estabelecer películas ou biofilmes, adicionar 196,6 ul de uma 76,3 mM (10 mg / ml) solução de D-leucina.
      NÃOTE:. A composição final 1x MSgg é descrito na Tabela 1, em comparação com a receita original ^25, o meio continha 50 ug / ml de treonina e a concentração de ferro para crescer colónias de biofilme em meio MSgg sólido foi aumentada de 2,5 vezes para optimizar a morfologia de colónia rugosa .
3. Após a solidificação do agar, secar as placas MSgg sólidos em uma capa biológica durante 30-45 minutos antes da inoculação.
4. Para seleccionar inibidores específicos que interferem com os mecanismos de formação de película (Figura 1), exclui que as concentrações utilizadas e afectar planctônicas crescimento estática.
   1. Determinar crescimento planctônicas (aumento na densidade óptica com o tempo em cultura líquida) de uma curva de crescimento simples através da medição da densidade óptica a 600 nm a cada hora até que a fase estacionária de crescimento.
   2. Para confirmar que a turbidez da cultura medida representa as contagens de células vivas, determinar o número de unidades formadoras de colónias (CFU)de células em fase de crescimento planctônicas de uma cultura sob agitação após vários pontos no tempo.
   3. Para avaliar o efeito de inibidores de molécula pequena sobre o crescimento da película estática, células de colheita, no final de uma incubação de 3 dias a 23 ° C a partir de uma cultura de células de 24 poços bem, inoculadas nas mesmas condições tal como descrito nas secções 1,7-1,9 e determinar a CFU. Por este controle, usar uma estirpe deficiente em película que não possua os operões que codificam para os componentes da matriz extracelular (por exemplo, B. subtilis Δ EPSH, Δ tasa).
      NOTA: Esta estirpe é capaz de crescer sob condições estáticas, mas em contraste com um tipo selvagem de formação de película, que é deficiente na capacidade de flutuar para a interface ar-líquido, em que o crescimento é favorecido devido ao aumento dos níveis de oxigénio ^26. Assim, esta matriz-extracelular e tensão película com deficiência é uma estirpe de referência recomendado para avaliar o crescimento em condições estáticas.
      NOTA: Para o ex específicaampla do D-amino ácido D-leucina não-canônico descrito abaixo, um efeito sobre planctônicas e crescimento estática em concentrações que interferiram com a formação de película foi descartada ^12,17. Os métodos para determinar o crescimento planctônicas e estática são descritos em pormenor ^17.

Figura 1. Visão Conceitual para a identificação de uma configuração experimental robusto para avaliar a inibição específica da formação de biofilme. Os critérios de seleção para os inibidores de pequenas moléculas que indicam a interferência específica à formação de biofilme sem efeito pronunciado sobre o crescimento planctônicas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Streak fora B. subtilis de um estoque de -80 ° C (cultu LBre de 10 ⁹ células / mL congelados em glicerol a 20%) para isolar colónias únicas em uma placa% agar-LB 1.5 com uma ponta estéril ou aplicador.
6. Crescer durante a noite a 30 ° C.
7. Passo crítico: Para uma inibição de película sólida por os ácidos não-canónica D-aminoácidos tais como D-leucina, crescer uma única colónia colhidos a partir da% placa de ágar-1,5 LB em 3 ml de caldo LB a 37 ° C durante 4 horas numa agitando incubadora (balançando velocidade de 200 rpm). Substituir o caldo de LB médio com MSgg indutor de biofilme antes da inoculação por centrifugação de 1,5 ml de cultura de arranque durante 4 min a 6000 xg, removendo cuidadosamente o sobrenadante e re-suspensão do sedimento em 1,5 ml de meio MSgg. O resto da cultura pode ser descartado.
   Importante: Para assegurar a robustez do sistema, a densidade óptica a 600 nm _(DO600) da cultura de arranque deve ser lavada entre 0,6 e 1.
8. Durante o crescimento da cultura de arranque, preparar uma placa de cultura de células multidish contend de 12 poçosg 3 ml de meio MSgg sem ou com uma gama de concentrações do inibidor de molécula pequena (por exemplo, 0,3, 0,5, 1 mM de D-leucina ^17). Para excluir os efeitos de borda, distribuir a localização das diferentes concentrações do outro lado da placa multidish. Em alternativa, usar de 24 poços de cultura celular multidish placas contendo 1,5 ml de meio MSgg.
9. Inocular os poços da cultura de células-placa de 12 poços multidish com 3 ul da cultura de arranque lavada (diluição 1: 1000).
   NOTA: A razão de diluição inferior, isto é, 1: 500 pode ser utilizado. Isto diminui o tempo de desenvolvimento das películas.
10. Crescer as películas a 23 ° C, em condições estáticas, durante três dias. Não se mova as películas durante este tempo, uma vez que pode afectar a morfologia da superfície final da película.
11. Adquirir imagens com uma exposição binocular e homogénea de um raio. Alternativamente, tirar uma foto das películas com uma câmera de alta resolução. Para evitar artefactos causados ​​por inconsisângulos de luz tenda e sombras, dê top-down fotos com a câmera fixa num tripé e utilizar uma fonte de luz suave e grande em 45 ° de ambos os lados.
    NOTA: Um método alternativo para estudar B. subtilis multicelularidade é o ensaio colônia biofilme em meio sólido, induzindo-biofilme MSgg. Tal como películas, este ensaio permite o estudo de processos de espaço-temporais. Uma vez que o intervalo activo de inibidores de moléculas pequenas é determinada, o seu efeito sobre a formação de colónias de biofilme pode ser estudada.
12. Para crescer colónias de biofilme, simetricamente detectar 1.5 ul de pré-cultura não lavado (Passo 1.7) sobre a 1,5% MSgg placa de agar seca com a ajuda de um modelo - 4 gotas por placa de Petri de diâmetro de 8,5 centímetros. Deixe as gotas adsorver à placa antes de movê-los.
    NOTA: O modelo ajuda a obter uma distribuição igual das colônias biofilme dentro da área onde as células são cultivadas. Para preparar o modelo, desenhar a área total de crescimento em escalas originais, dividi-lo à igualdade de seitaRUP e marcar o centro. Para um prato redondo Petri de 8,5 cm de diâmetro, este atribui 14 ^cm2 a uma colónia de biofilme.
13. Incubar as placas a 30 ° C durante três dias. Durante este tempo, as colónias de biofilme se desenvolvem para formar uma estrutura tridimensional, enrugado.
14. Tire fotos como no passo 1.11.

2. Etanol Resistência Assay

1. Crescer biofilmes conforme descrito nas etapas 1,1-1,7 e 1.12-1.14.
2. Após 68 horas de crescimento a 30 ° C, as colónias de biofilme cortar em duas partes iguais com a ajuda de uma lâmina de barbear e o molde.

Figura 2. Exemplo desenho experimental para avaliar a resistência das células do biofilme de colónias de agentes esterilizantes. (A) Molde utilizado para a distribuição igual de colónias de biofilme através de uma placa de Petri e para o corte. (B)imagens de cima para baixo não tratada do tipo selvagem biofilme cresceu por 68 horas em meio sólido, definido indutoras de biofilme MSgg a 30 ° C. O alargamento mostra como uma colônia de biofilme pode ser cortado em duas metades iguais. (C) As duas metades iguais de biofilme são tratados da mesma forma (o controlo, PBS) ou com PBS ou agente de esterilização e processados como descrito. Barra de escala:. 1 cm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Cuidadosamente levantar cada metade da colónia biofilme da placa de agar com uma pequena espátula e movê-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 500 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Se necessário, raspar as restantes células a partir da placa e transferi-los para o tubo de microcentrífuga bem.
   NOTA: A segunda metade da colónia biofilme é tratada diferencialmente, dependendo se é o controlo ou para testar a resistência à Steriagentes Lizing.
4. Para o controlo, incubar a segunda metade da colónia de biofilme em 500 ul de PBS como no passo 2.3. Para avaliar a resistência aos agentes esterilizantes, transferir a segunda metade da colónia biofilme a 500 ul 50% (v / v) de etanol.
   NOTA: esterilização Alternativa agentes, tais como o hipoclorito de sódio pode ser utilizado. Para todos os agentes de esterilização utilizados, determinar o tempo de concentração e de incubação ativa de uma experiência preliminar.
5. Incubam-se as colónias de biofilme durante 10 min sobre a bancada à temperatura ambiente.
6. Centrifugar as colônias biofilme durante 5 minutos a 18.000 xg e remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta. Adicionar 300 ul de PBS.
7. Sonicar as células suavemente (amplitude de 10%, de pulso 5 s) com a microponta de um sonicador.
   NOTA: A energia de ultra-sons deve ser suficiente para agregados biofilme separadas. No entanto, ultra-sons muito dura pode lisar as células. Confirme antecipadamente por microscopia de luz que a energia sonicaçãoutilizadas não lisar as células e que todos os agregados sejam dissolvidos.
8. Adicionar 700 ul de PBS a um volume final de 1 ml. Efectuar uma diluição em série (a 10 ^-7) em PBS e espalhar 100 ul de 3 diluições numa placa de agar LB a 1,5%, utilizando esferas de vidro estéreis.
   NOTA: As diluições óptimas a ser revestida deve ser determinado numa experiência preliminar, uma vez que depende da quantidade de células do biofilme colónia de interesse e a taxa de sobrevivência das células em resposta ao agente de esterilização.
9. Incubar as placas durante a noite a 30 ° C, a contagem de CFU e determinar CFU / ml. A partir do final de UFC / ml de cada colônias meio de biofilme, calcular a percentagem de sobreviventes.
   NOTA: Quando realizada e analisada tal como descrito, as duas metades da colónia de controlo do biofilme e o tratamento contra metade tratada com etanol da colónia de biofilme não tratada deve dar origem a diferenças inferiores a 10% na contagem de células viáveis, verificando a simetria ou a resistência da colónia , respectively. Alternativamente, os resultados podem ser representados no total de CFU. As contagens de células de controlo e da colónia não tratada biofilme deve permanecer na mesma ordem de grandeza. Em contraste, espera-se que as contagens de células da metade tratada com etanol de uma pequena colónia tratada biofilme molécula-a cair por um mínimo de duas ordens de grandeza a reivindicação para um aumento da sensibilidade para o agente de esterilização.

3. biofilme Colony Preparação de Amostras para Microscopia Eletrônica de Varredura

1. Crescer colônias biofilme conforme descrito nas etapas 1,1-1,7 e 1.12-1.14.
2. Prepara-se uma nova porção de 2% (v / v) de glutaraldeído, 3% (v / v) em solução de paraformaldeído a cacodilato de sódio 100 mM, tampão de cloreto de cálcio 5 mM, pH 7,3. Prepare 5 ml de fixador para cada placa de Petri de diâmetro de 8,5 centímetros.
   CUIDADO: glutaraldeído e paraformaldeído são perigosos. Lidar com eles com equipamento de segurança dentro de um capuz químico. Descartar as soluções e os materiais contaminados para o hazresíduos ardous.
3. Adicionar cuidadosamente o fixador para as colônias biofilme, sem dispensar diretamente em cima dos biofilmes.
   NOTA: Devido ao carácter hidrofóbico da colónia de biofilmes, as colónias lentamente destacar do agar e começar a flutuar.
4. Cuidadosamente selar as placas com uma tira de Parafilm. Incubar num agitador rotativo durante 2 horas à temperatura ambiente e subsequentemente transferir as placas a 4 ° C durante a noite.
5. No dia seguinte, remover o líquido cuidadosamente com uma pipeta de Pasteur de vidro ligada a uma bomba de vácuo.
6. Adiciona-se cuidadosamente 10 ml de 100 mM de cacodilato de sódio, tampão de cloreto de cálcio 5 mM, para lavar o biofilme e incubar durante 5 min. Remova cuidadosamente o líquido com a pipeta de vidro Pasteur a partir do canto da placa para evitar danificar o biofilme e adicionar solução de lavagem fresco por pipetagem suave. Repita este passo uma vez.
7. Para a desidratação das colônias biofilme, prossiga com as seguintes etapas: 2x 5 min em DDH ₂ O; 2 x 20 min em três0% de etanol; 2 x 20 min em etanol a 50%; 2 x 20 min em etanol a 70%; 2 x 20 min em etanol a 96%; 2x 30 min em 100% de etanol.
   1. Adicionar 15 ml de líquido por cada placa de Petri de diâmetro de 8,5 cm de cada passo e remover o líquido cuidadosamente após cada incubação.
8. Utilizar um dos dois métodos diferentes para a secagem das amostras a partir de etanol.
   1. Por secagem ao ar a partir de etanol:
      1. Corte um papel de filtro de celulose (diâmetro de 9 cm) em trimestres. Resumidamente submergir quarto em 100% de etanol, e, em seguida, transferir cuidadosamente uma colónia flutuante biofilme sobre ele. Colocar o papel de filtro molhado numa placa de Petri forradas com papel de filtro. Cubra o prato Petri e deixar as colônias biofilme secar durante a noite em uma capa química.
   2. Para o ponto crítico (CP) -drying usando dióxido de carbono _(CO2) como o fluido de transição:
      1. Encher 75% da câmara de máquina de ponto crítico de secagem com 100% de etanol. Transferir as amostras em um suporte, cada amostra em seu próprio cHamber. Se necessário, cortar o biofilme com uma tesoura em pedaços menores. Deixar as amostras submersas em etanol durante todas as manipulações. Em seguida, transferir o suporte para dentro da câmara e fecha hermeticamente a câmara.
      2. Arrefece-se a câmara até 7 ° C e começar a agitar. Encha a câmara completamente com o CO ₂ líquido. Durante um período de incubação de 7 min, deixar a mistura de etanol com o CO _2. Em seguida, de descarga 25% da solução.
         NOTA: Não esvazie a câmara abaixo do nível da amostra.
      3. Repita o passo 3.8.2.2 quatro vezes.
      4. Repita o passo 3.8.2.2 cinco vezes com um tempo de incubação de apenas 5 min. Finalmente, o etanol deve ser completamente substituída por CO _2.
      5. Durante a última rodada, vazio apenas 5% da câmara. Desligue a agitação e o arrefecimento. Iniciar o aquecimento da câmara até 42 ° C. A uma temperatura de 31,1 ° C e uma pressão de 73,9 bar, o _CO2 líquido atinge o seu ponto crítico, o estado em que o pH gasosoase tem a mesma densidade que a fase líquida do solvente ^27. Uma vez que a temperatura atinge 42 ° C, incubar durante 10 min. A 42 ° C, o CO ₂ na câmara existe como gás supercrítico.
         NOTA: Verifique constantemente a pressão da câmara. A pressão não deve ser superior a 120 bar, a 42 ° C.
      6. Começar a liberar lentamente o gás com aquecimento contínuo. Isto mantém as amostras na fase _CO2 -gas e impede a deformação da morfologia da amostra através da tensão superficial do líquido. Defina o medidor de vazão para 5 L / hr por ajuste fino da válvula de medição de controle do medidor de vazão. Aguardar até que a toda a pressão na câmara é libertado. Agora abra a câmara e retire as amostras cuidadosamente do suporte.
9. Brasão de microscopia eletrônica de stub com fita de carbono. Com a ajuda de uma pinça, transferir cuidadosamente as colônias biofilme para o topo. Ligue cada colônia para o stub adicionando uma ponte fina de carrofita bon, que é crucial para a eliminação de carga sob o feixe de elétrons. Nesta fase, lidar com as colônias biofilme com cuidado, pois eles são muito frágeis. Armazenar as amostras num exsicador durante pelo menos 24 h ou até à sua análise.
10. No dia do exame com o microscópio eletrônico de varredura, por pulverização catódica-coat as colônias biofilme para 2 min em um ângulo de 60 ° em um ouro-paládio sputter-coater. Repita esta etapa duas vezes e girar as amostras em 120 ° no meio. No final, sputter-revestir as amostras uma vez durante 3 minutos a partir do topo. A fina camada de 20 nm de ouro-paládio melhora a condutividade e melhora o contraste da amostra para a imagem no SEM.
11. Armazenar as amostras em um dessecador para evitar a re-hidratação da amostra de ²⁸ até imagiologia com um microscópio eletrônico de varredura ^29,30.

O ensaio de película é um método para estudar os processos altamente regulados e dinâmicas de B. multicelularidade subtilis. Além disso, o ensaio de película é adequado para testar uma gama de condições, quer pré-inicial ou concentrações de moléculas pequenas em uma placa de cultura de células multidish único numa experiência. No entanto, B. subtilis formação de película é sensível às condições de pré-cultura (por exemplo, o meio de crescimento de pré-cultura e da sua fase de crescimento), a proporção da inoculação e a remoção do meio de pré-cultura. Por isso, primeiro rastreadas para uma instalação experimental que permitiu-nos para reproduzir inibição película por D-leucina. Os nossos resultados mostram que a inibição da película reprodutível por D-leucina pode ser obtido se as células forem pré-cultivadas em indefinido, meio rico LB para uma fase de crescimento meio-logarítmica (colónia única em 3 ml de LB a 37 ° C durante 4 h com agitação ), centrifugadas e re-suspensas em meio de MSgg definido antes de um 1: inoculação 1000de iões (Figura 3A). Quando as células foram cultivadas em meio MSgg para o meio-logarítmica fase de crescimento (única colónia em 1 ml de LB durante 2 horas, re-diluída 1: 100 a 3 ml MSgg, e cultivadas durante 5 h a 37 ° C com agitação a 200 rpm), a remoção do meio de pré-cultura não teve efeito sobre a actividade de D-leucina. As células cultivadas para a fase estacionária de crescimento (única colónia em 1 ml de LB durante 2 horas, re-diluída 1: 100 a 3 ml MSgg, e cultivadas durante até 20 h num rolo à temperatura ambiente) e lavadas em meio MSgg antes inoculação foram menos sensíveis. No entanto, este aumento na resistência para o efeito de inibição da película de D-leucina pode ser devido à maior densidade de células de pré-cultura, aumentando a taxa de inoculação. A proporção de inoculação da pré-cultura para o crescimento em meio estático MSgg, isto é, 1: 500 ou 1: 1000, influenciado a gama de actividade de D-leucina e o tempo do desenvolvimento da película (Figura 3B). inibição película por D-leucina ocorreua temperaturas diferentes de crescimento (23 ° C e 30 ° C, Figura 3C). Importante, enquanto que a sensibilidade de células a D-leucina depende das condições de pré-cultura, a reprodutibilidade dos fenómenos em diferentes temperaturas demonstra que a inibição da película por a pequena molécula de D-leucina tem características robustas.

. Figura 3. Exemplo resultados que mostram os efeitos de várias condições de pré-cultura sobre a inibição da película por D-leucina Vários parâmetros devem ser avaliadas para se obter uma configuração experimental robusta, incluindo: Remoção do (A) de contaminantes a partir do crescimento de pré-cultura médio (não lavado contra lavada), o meio de crescimento de pré-cultura (, meio LB rico indefinido ou definido biofilme de indução de meio de MSgg), e estado de crescimento da pré-cultura (logarítmica contra a fase de crescimento estacionário), (B) índice de inoculação (1: 1.000 versus 1: 500) da pré-cultura para o meio de crescimento da película final, e () Temperatura de crescimento C (23 ° C versus 30 ° C) B.. células subtilis NCIB 3610 foram cultivadas no meio indicado (LB ou MSgg) durante 4 h a 37 ° C ou à temperatura ambiente durante a noite (O / N) com agitação, e meio de pré-cultura foi substituído por MSgg se indicado (lavado ou não-lavado). Finalmente, a cultura de arranque foi inoculada 1: 1000, se não indicado de outra forma e películas foram cultivadas sob condições estáticas, a 23 ° C durante três dias. fotografias de cima para baixo foram adquiridas com uma câmera. Bem diâmetro é de 22 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após a identificação de condições pré-cultura e uma montagem experimental que permitiu uma gama actividade reprodutível de D-leucina na formação de película (pré-cultura cultivada em meio LB para uma fase de crescimento meio-logarítmica, lavou-se em MSgg, diluído 1: 1000 e crescida a 23 ° C durante três dias), o efeito foi testado quanto à sua robustez. Para esse efeito, a actividade de D-leucina na formação da película foi avaliada em vários meios MSgg modificada (Figura 4). A gama de D-leucina na inibição da actividade da película era consistente nos cinco meios testados, e mostra que o efeito de D-leucina na formação da película é robusta. Uma tendência semelhante foi observada com D-tirosina, em que a inibição da película na gama de concentrações até 2 ^ M foi consistente em vários meios MSgg modificado (concentração de ferro inferior e substituição da fonte de azoto, com cloreto de amónio ou a fonte de carbono com a glicose, os dados não mostrando).

Figura 4. Sensibilidade a D-leucina em ocorrevários meios de crescimento. São mostradas fotografias de cima para baixo de B. subtilis NCIB 3610 películas, cultivadas em condições estáticas, a 23 ° C em meio MSgg definido, induzindo-biofilme ou em meios MSgg modificado diferente (fonte de carbono de 0,5% de glicose; fonte de azoto 0,5% (NH _{4) 2} SO _4; alto teor de ferro de 250 um _FeCl3; 0,125% de glicerol baixo glicerol) durante três dias, excepto para o meio de fonte de azoto alternativa (onde as películas foram cultivadas durante cinco dias), sem ou com D-leucina nas concentrações indicadas. As culturas-mãe foram cultivadas durante 4 h a 37 ° C com agitação em meio definido, rico LB. Antes da inoculação, as células foram lavadas por centrifugação e ressuspensas em meio de crescimento de película correspondente. A cultura inicial foi diluído 1: 1.000, o diâmetro do poço é de 22 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um método alternativo para estudar B. subtilis multicelularidade é o ensaio colônia biofilme em meio MSgg sólida. Tal como películas, este ensaio permite o estudo de processos de espaço-temporais. Uma vez que o intervalo activo de inibidores de moléculas pequenas é determinada no sistema de película, o seu efeito sobre a formação de colónias de biofilme pode ser estudada. Neste estudo, as colónias de biofilme foram utilizados para avaliar o efeito de D-leucina na resistência de colónias de biofilme de agentes esterilizantes, por colónias de biofilme são menos frágil e no fundo sólido, que são mais fáceis de manipular. Quando colónias de biofilme tratados com D-leucina são expostas a 50% de etanol durante 10 min, a percentagem de células sobreviventes cai drasticamente em comparação com a fracção não tratado (Figura 5). Este método pode ainda ser desenvolvida para avaliar os efeitos de outros inibidores de moléculas pequenas e seus efeitos sobre a resistência aos agentes bactericidas (Sterilagentes nizar ou antibióticos).

Figura 5. Os resultados de exemplo de não tratada ou tratada de resistência biofilme colónia contra um agente esterilizante. Colônias biofilme de B. subtilis NCIB 3610 foram cultivadas em meio sólido, definido por 68 h a 30 ° C, com ou sem mM de D-leucina 0,5. Depois de cortar as colónias em duas metades iguais, uma metade foi tratado com PBS (controlo interno) e a outra metade com etanol a 50% ou PBS (controlo). Após sonicação suave, diluição em série, plaqueamento e contagem das unidades formadoras de colónias, foi calculada a percentagem de sobreviventes em comparação com o controlo interno. São mostrados os resultados de três experimentos independentes com as médias de dois (A) ou três (B, C) replica e seus desvios-padrão. Por favor clique aqui to visualizar uma versão maior desta figura.

Microscopia eletrônica de varredura (SEM) é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para se concentrar na arquitetura espacial das rugas biofilme colônia, a abundância e localização dos EPS e morfologia única célula ^31. SEM de imagem requer amostras que podem ser visualizados sob alto vácuo. Para investigar amostras sob condições de alto vácuo, todas as moléculas de água em massa tem que ser removido, e por conseguinte, SEM de imagem requer a desidratação da amostra antes da imagiologia. Alternativamente, as amostras podem ser trabalhada em condições de baixo vácuo no modo molhado por microscopia electrónica de varrimento ambiental (ESEM), em que a amostra é suavemente hidratada seca na câmara de microscópio. Para avaliar os efeitos de pequenas moléculas inibidoras de biofilme sobre a arquitectura colónia, a morfologia celular e organização EPS, foram comparados três tipos diferentes de desidratação amostra: secagem ao microscópio sob MO molhadocondições de (ESEM), secou-se ao ar a partir de um solvente ou ponto crítico (CP) -legumes usando dióxido de carbono como o fluido de transição. Em não tratada e D-leucina-tratada B. subtilis colónias biofilme diferentes etapas de hidratação de acordo com o método utilizado pode ser observada. Imagiologia sob baixas condições de vácuo no modo molhada pela ESEM preservado o estado muito natural da colónia biofilme. No entanto, a informação sobre a morfologia das células única e EPS abundância e arquitectura era escassa, como o EPS ainda estavam completamente hidratado e as células foram incorporados no EPS (dados não mostrados). Em termos de desidratação, CP-secagem foi o procedimento mais rigoroso. É removido estruturalmente mais moléculas de água ligada e a granel a partir do tecido, o que representa uma perda de volume de 30-70%, dependendo do tecido ^32. Em contraste, a secagem ao ar preservadas as moléculas de água ligada. Um tecido embrionário, por exemplo, perdeu 18% do seu volume após secagem ao ar a partir do etanol solvente volátil e de 59% após secagem ^CP-32 . Como o EPS ligar a água e são muito hidratado, recomendamos considerando a perda total de água no método de secagem-CP. Quando as amostras de estudo foram desidratadas em álcool etílico e secou-se ao ar, a estrutura tridimensional da colónia de biofilme foi preservada, células individuais apareceu, e o RPE foram achatados, mas ainda ligado e coberto as células individuais (Figura 6A) . Colônias biofilme que estavam desidratados com etanol e CP-seca também preservaram a sua estrutura tridimensional, e os EPS apareceu como uma teia de aranha (Figura 6C). Nas amostras secas ao ar e secou-se ao CP, os efeitos do inibidor de molécula pequena de D-leucina na arquitectura biofilme colónia, a única morfologia celular e estrutura foram EPS aparente (figura 6B e D). As colónias cultivadas de biofilme, na presença de D-leucina eram menores e as rugas foram menos pronunciados. As células tratadas com D-leucina foram alongados, um fenótipo que é OBSErved em células tratadas com células de parede-segmentação moléculas ^33. Além disso, as células foram claramente menos coberto com o EPS e não firmemente ligado às suas células vizinhas através do RPE como pode ser visto nas colónias de biofilme não tratados. Os resultados apresentados mostram que ambos os métodos de biofilme colónia desidratação, a partir de etanol ou secas ao ar CP-secas usando dióxido de carbono como o fluido de transição dão informações valiosas sobre o efeito de moléculas pequenas sobre a morfologia de célula única, bem como sobre a abundância EPS e arquitetura.

Figura 6. moléculas pequenas podem mudar a grande e pequena escala da arquitetura do biofilme colônia. Colônias biofilme de B. subtilis NCIB 3610 adulto (A e D) ou na ausência (B e D) na presença de mM de D-leucina 0,5 durante 72 horas a 30 ° Cem meio sólido MSgg foram fixados conforme descrito no protocolo e secou-se a partir de etanol, como se segue: (A e B) e secou-se ao ar (C e D) utilizando dióxido de carbono como o fluido de transição secou-CP. São mostrados de cima para baixo imagens binoculares das colônias biofilme (esquerda, painéis superiores), de cima para baixo fotografias das colônias biofilme secas montadas em bases de microscopia eletrônica antes de ouro-paládio-coating (esquerda, painéis inferiores), de baixa e alta ampliação imagens obtidas por MEV para mostrar a arquitetura 3D das rugas biofilme colônia ou a morfologia celular organização / EPS única. Barras de escala a partir da esquerda para a direita:. 5 mm, 100 mm, 2 m Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. Composição final 1x MSgg utilizado neste estudo.

Bacillus subtilis formas robustas e altamente estruturados biofilmes ambos no estado líquido (películas) e em meio sólido (colônias). Por isso, serve como um organismo modelo ideal para a caracterização do modo de acção dos inibidores específicos de biofilme. Em meio sólido, as células formam estruturas multicelulares com características distintas que não são evidentes em películas, como rugas que irradiam do centro para a borda. Assim, películas e colônias são sistemas complementares para estudar B. multicelularidade subtilis.

O objetivo deste estudo é desenvolver um B. sistema modelo subtilis para biofilme (películas e colônias) inibição. Vários passos são fundamentais para a reprodutibilidade do ensaio biofilme perturbação. Um primeiro passo crítico é para confirmar que o efeito sobre a formação de biofilme não é devido a uma toxicidade geral de bactérias cultivadas no estilo de vida planctônicas. Isto pode ser considerado, comparando o efeito de uma dada concentração de quantoMall molécula inibidora sobre a inibição do biofilme em relação ao efeito desta molécula em crescimento planctônicas. Um efeito dramaticamente mais forte sobre o desenvolvimento do biofilme pode assegurar a identificação dos mecanismos de alvo que são especificamente importante para o desenvolvimento dos biofilmes. Além disso, o estudo aqui descrito demonstra a importância das condições pré-cultura para o desenvolvimento de películas e a sua sensibilidade a pequenas moléculas. Antes de caracterizar o efeito de pequenas moléculas, as condições experimentais reprodutíveis e robustos (por exemplo, temperatura de crescimento da película e falta de sensibilidade para a composição do meio) para testar os seus efeitos deve ser definido. Para encontrar tais condições, os meios de comunicação da condição de pré-cultura, fase de crescimento dos meios de comunicação pré-cultura, de remoção de mídia pré-cultura, temperatura de crescimento e de crescimento deve ser considerado.

Um desafio importante, uma vez que um inibidor específico para a formação de biofilme é encontrada, é encontrar quantitativae métodos qualitativos que caracterizam os efeitos destes inibidores de molécula pequena sobre o desenvolvimento do biofilme e resistência. Aqui, duas metodologias importantes são descritas em pormenor que podem ser utilizados para avaliar os efeitos de tais inibidores. Em primeiro lugar, nós apresentamos um método quantitativo simples que pode reprodutivelmente sondar a resistência de biofilmes de colónias tratado versus não tratados para bactericidas, tais como o etanol. Os resultados representativos são mostrados para a sensibilidade de colónias de biofilme D-leucina-tratada a 50% de etanol. No entanto, este ensaio pode ser facilmente modificado através da utilização de agentes esterilizantes diferentes ou antibióticos. Em segundo lugar, um método SEM é descrito em detalhe que permite o exame de alta resolução das alterações na colónia biofilme causada pelo inibidor de molécula pequena em vários níveis complementando: a estrutura geral, a organização e a abundância da matriz EPS e seus componentes, e o morfologias de célula única em todo o biofilme. Notamos que dois métodos de dehydratiem (secagem ao ar a partir de 100% de etanol ou CP-secagem usando dióxido de carbono como o fluido de transição) podem ser igualmente utilizados durante a preparação da amostra SEM de uma colónia de biofilme. É importante salientar a fixação bem sucedida da amostra de biopelícula depende em larga medida da hidrofobicidade da colónia biofilme. Este hidrofobia é uma característica intrínseca da B. biofilmes subtilis devido à camada de superfície hidrofóbica ^10,34.

Várias abordagens foram usadas anteriormente para estudar a montagem e desenvolvimento de biofilme com B. subtilis como organismo modelo ^35. Um número de estudos independentes demonstraram os efeitos da composição do meio sobre o desenvolvimento do biofilme ^36-38. Até agora, no entanto, uma avaliação sistemática dos efeitos da composição do meio sobre a inibição do biofilme foi, para o melhor de nosso conhecimento, falta. Este estudo demonstra que, enquanto a inibição película de B. subtilis por moléculas pequenas é sensível às condições de pré-cultura, é unaffected pelos efeitos da temperatura e da composição do meio, e, assim, útil para telas sistemáticas de inibidores de moléculas pequenas. Além disso, foi estabelecido um método simples, reproduzível e quantitativo para avaliar a resistência de molécula pequena não tratadas ou tratadas com inibidores de colónias de biofilme para agentes antibacterianos, actualmente não existe no modelo de biofilme organismo B. subtilis.

B. subtilis biofilmes em combinação com os repórteres fluorescentes pode ser feita ainda mais a procurar inibidores de moléculas pequenas que têm como alvo quer um passo específico do desenvolvimento da formação de biofilme ou uma sub-população específica de células dentro do biofilme. Os métodos aqui descritos não fornecem a resolução de uma única célula em termos de expressão do gene dentro do biofilme. Os métodos para a análise da expressão do gene da matriz EPS dentro B. biofilmes subtilis no nível da célula única foram estabelecidas com sucesso ^39.

biofilme bacteriano são de crucial importância em ambientes agrícolas, industriais e clínicos. Em um contexto agrícola, a capacidade de formar biofilmes aumenta a colonização do hospedeiro planta de numerosos agentes patogénicos ^40, e em um contexto clínico, os biofilmes são intrinsecamente resistentes a agentes antimicrobianos ²¹ e estão no centro de muitas infecções bacterianas persistentes e crônicas. Além disso, é agora reconhecido que biofilmes tem enormes implicações de custos para a indústria como eles são extremamente difíceis de remover e controlar ^41. Assim, o desenvolvimento de um modelo experimental para o estudo de inibidores de biofilmes microbianos irá fornecer significativas agrícola ^{42,43, 21,44} clínicos, e tecnológicas ^45-47 avanços.

Os métodos correntes estão limitados a B. subtilis. Recomendamos a seguir os conceitos quantitativos e qualitativos descritos para estudar inibidores de pequena molécula especifica para a biofilme em outras espécies bem. Além , O presente estudo refere-se a um exemplo específico para a inibição de biofilmes por D-leucina, a partir de vários inibidores de biofilme específico publicada previamente ^17. Importante, D-leucina já foi caracterizado como uma molécula anti-biofilme na patógeno de planta Xanthomonas citri ^48, apresentando possíveis semelhanças entre a colonização da planta e formação de biofilme. Formação de biofilme (película e formação de colônia rugosa) também é comum em patógenos humanos (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa ^49-51 e Escherichia coli uropatogênica ^52,53). Os métodos descritos podem ser mais desenvolvidos para procurar drogas específicas que inibem a formação de biofilme e reduzir a resistência mediada por biofilme aos agentes antimicrobianos em pesquisa clínica. Em geral, os métodos descritos aqui podem ser utilizados como uma base para desenvolver conceitos quantitativos e qualitativos para estudar inibidores de pequena molécula especifica para a biofilme em outras espécies bem.

The authors have nothing to disclose.

Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation - Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.