研究のための方法論

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

多細胞細菌群集は、自然と人為的な環境で重要な役割を果たし、かつ有益であるか、または非常に有害であり得ます。これらの多細胞コロニーを、個々の細胞が自己生産細胞外ポリマー物質（EPS）マトリックス中に埋め込まれている前記バイオフィルムとして知られています。 EPSは強く、彼らが植民地化の表面に細胞を接着します。彼らは、機械的および化学的な力に対するシールドとして機能し、セルラー通信^1を容易^に 、隣接するセルの間の密接な接触を作成します。バイオフィルムは、細胞が高度に制御使用差別コミュニティ、と見ることができる、コミュニティ内だけでなく、種^2-5全体で彼らの活動を調整するためのプロセスを画策。バイオフィルム状態への成長のプランクトン、自由生活モードからの移行は、多くの場合、発達過程と関連しています。良い例は、グラム陽性土壌細菌の枯草菌（Bacillus subtilis）、したがってundomeですsticated株は、バイオフィルム形成につながる発達段階を研究するための堅牢なモデル生物としての役割を果たす。この細菌では、運動性の細胞は、特殊なタスク^4を実行目立つ多細胞構造に自分自身を整理します。細胞の一つのグループは、マトリックス・プロデューサーはエキソポリサッカライド^6を分泌^し 、アミロイドタンパク質TASA ^7,8、および表面疎水性タンパク質BslA ^9,10;これらの全ては、EPS ^11-13の組み立てに参加しています。

自然と人為的ニッチでのバイオフィルムの豊かさと、彼らが引き起こす可能性が推定される致命的なダメージを考えると、それらの形成を防止するための方法を見つけることが急務です。小分子阻害剤は、バイオフィルム形成に関与する新たな調節経路、酵素および構造タンパク質の発見を補助し、それによって多コミュニティアセンブリの複雑なプロセスにおける洞察を促進することができます。 B.として枯草菌バイオのためのよく研究モデルであります成膜^14,15は、様々なバイオフィルム阻害剤の効果を評価するために使用することができます。この研究は、小分子阻害剤に対するバイオフィルムの反応を評価するための主要な4つの基本的な方法に取り組みます。まず、これらの阻害剤はバイオフィルム特有の目標を持っていることを確認するために、バイオフィルム形成に及ぼす影響からプランクトンの成長への影響の分離が重要です。ほとんどの抗菌剤は、それらのプランクトン増殖期の細胞を標的とするが、バイオフィルムのライフスタイルをターゲット分子はまれです。プランクトンの成長に影響を及ぼさない分子は毒性がないとして加えて、彼らは抗生物質耐性変異体^16に有利な選択圧を減らすことができます。バイオフィルムは、D-アミノ酸または他の特定の細胞壁干渉分子で処理した場合、例えば、それらは、いずれの乱れまたは分解が、これらの阻害剤は、軽度に浮遊成長^12,17に影響を及ぼす。これとは対照的に、多くの抗生物質は劇的リットルで、プランクトンの成長を損ないますittleまたはバイオフィルム形成¹⁷に影響はありません。

第二に、小分子の効果を研究するための一貫性と堅牢な実験的な枠組みを確立することが重要です。我々は、小分子阻害剤の有効濃度範囲は、前培養条件およびこれらの小分子阻害剤の効果を研究するために使用される実験に感受性であったことを観察しました。各種レポート、Bを勉強特に浮遊細菌のバイオフィルム^12,17-19 - 枯草菌は、D-アミノ酸がペリクルの形成を阻害する濃度範囲の変化を明らかにしました。ここに示された結果は、以下の要因が活性濃度範囲の差を考慮することを示唆している：前培養条件（後期静止²⁰増殖期対対数^12,17）、前培養の条件で使用される増殖培地は、（リッチ、定義された対未定義[ルリアブロス、LB] [グルタミン酸ナトリウム- グリセロール、MSgg]）、接種率、特に接種前に前培養培地を除去します。静的ペリクル成長の温度は、小分子阻害剤D-ロイシン、本研究で使用した代表D-アミノ酸の活性範囲においてそれほど重要な役割を示しました。

最後に、一度バイオフィルムは、特定のバイオフィルム阻害剤は、堅牢かつ有益な方法は、バイオフィルムのフィットネスにこれらの阻害剤の効果を特徴付けるために必要とされるで処理されます。ここでは、独立して小分子阻害剤の効果を特徴づけるための2つの方法が詳細に記載されている：（1）バイオフィルムコロニー中で単一細胞に作用し、抗菌剤に対する耐性。自由生活細菌^21-23と比較した場合、バイオフィルム中の細胞は、典型的には、抗生物質に対してより耐性があります。この現象は多因子ですが、抗生物質の侵入を低減するためのEPSの能力は、多くの場合、魅力的な説明を²⁴としました。この方法は、抗菌性物質への曝露後の予め確立されたバイオフィルム細胞の生存率を評価します。 （2）バイオフィルムコロニーアーキテクチャへの影響を、大から小スケールへ。バイオフィルムコロニーは、それらの三次元構造およびEPSの存在によって特徴付けられます。小スケール（μm）とし、走査型電子顕微鏡を利用して、細胞形態、バイオフィルムコロニー構造とEPSのアーキテクチャ及び存在量の変化が大きい（ミリメートル）から可視化することができます。

1.ペリクルおよびバイオフィルムコロニー形成への小分子阻害剤の影響を評価します

1. 塩化カルシウムと鉄を含まない培地定義されたバイオフィルム誘発MSgg ²⁵の2×溶液を調製する（III）六水和物。フィルター滅菌した後、塩化カルシウムを加えます。培地を直接使用する準備ができているか、暗所で4℃で保存することができます。
2. 実験の日に、1×MSgg希釈液を準備します。
   1. （滅菌蒸留水（ペリクル）または滅菌3％熱い（80℃）寒天（バイオフィルム）で1倍、50μM（ペリクル）または250μMの最終濃度に塩化鉄（III）六水和物を追加するには、2倍MSgg媒体を希釈バイオフィルム）。所望の濃度に抗生物質または小分子阻害剤を加え、よく混ぜます。たとえば、76.3ミリ（10 mg / mlで）D-ロイシンストック溶液196.6μLを加える、ペリクルまたはバイオフィルムを確立するために、30ml中に0.5mMのD-ロイシンの最終濃度を得ました。
      NOTE：最終1×MSgg組成物は、表1に記載されている元のレシピ²⁵と比較すると、媒体は、固体MSgg媒体上のバイオフィルムコロニーを成長させるために50トレオニン/ mlのμgの鉄濃度を含有したが、しわコロニー形態を最適化するために、2.5倍に増加しました。 。
3. 寒天が固化した後、接種前に30-45分のための生物学的フード内で固体MSggプレートを乾燥させます。
4. 薄膜形成（ 図1）のメカニズムを妨害する特異的阻害剤を選択するには、使用される濃度は、プランクトンや静的な成長に影響を与えることを排除します。
   1. 定常増殖期まで、600 nmで毎時間、光学密度を測定することにより、単純な成長曲線におけるプランクトンの成長（液体培養時間にわたる光学密度の増加）を決定します。
   2. 、測定された培養物の濁度は、生細胞の数を表すことを確認する単位（CFU）を形成するコロニーの数を決定しますいくつかの時点後の振盪培養物からの浮遊増殖期にある細胞の。
   3. 24ウェル細胞培養物から23℃で3日間のインキュベーションの終了時に静的な薄膜成長、収穫細胞の小分子阻害剤の効果を評価するために、セクション1.7〜1.9に記載したのと同じ条件下で接種そしてCFUを決定します。この制御のために、細胞外マトリックス成分（ すなわち 、 枯草菌 ΔepsH、ΔTASA）をコードするオペロンを欠いているペリクル欠損株を使用します。
      注：この株は、静的条件下で成長させることが可能であるが、ペリクルを形成する野生型とは対照的に、それは成長が増加による酸素レベル²⁶に支持される、液体-空気界面に浮遊する能力を欠損しています。したがって、この細胞外の行列 - ペリクル欠損株は、静的な条件下での成長を評価するための推奨基準株です。
      注：特定の元について以下に記載される非正規のD-アミノ酸のD-ロイシンの豊富な、ペリクルの形成を妨害する濃度ではプランクトンと静的な成長への影響は^12,17除外されました。プランクトン及び静的成長を決定するための方法が詳細¹⁷に記載されています。

図1.バイオフィルム形成の特異的阻害を評価するための堅牢な実験を識別するための概念的な概要。プランクトンの成長に顕著な効果のないバイオフィルム形成との特異的な干渉を示す小分子阻害剤の選択基準。 拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。

5. B.アウトストリーク-80℃ストックから枯草菌 （LBのcultu20％グリセロール中で凍結10 ⁹細胞/ ml）の再滅菌先端又はアプリケータスティックを用いてLB-1.5％寒天プレート上に単一コロニーを単離します。
6. 30℃で一晩増殖。
7. 重要なステップ：例えばD-ロイシンなどの非標準的なDアミノ酸による強固なペリクル阻害のためには、単一コロニーを、4時間、37℃で3 mlのLBブロス中でLB-1.5％寒天プレートから採取して増殖します振盪インキュベーター（速度200rpmで振とう）。慎重に上清を除去し、1.5ミリリットルMSgg培地でペレットを再懸濁し、6,000×gで4分間、1.5ミリリットルスターター培養物を遠心分離することにより、接種前にバイオフィルム誘導MSgg培地でLBブロスを交換してください。培養物の残りは廃棄することができます。
   重要：システムの堅牢性を確保するために、洗浄スターター培養の600 nmの（OD _600）での光学密度は0.6と1の間であるべきです。
8. スターター培養物の増殖中に、12ウェル細胞培養multidishプレートcontaininを準備せずに、または小分子阻害剤（ 例えば 、0.3、0.5、1 mMのD-ロイシン^17）の濃度範囲でMSgg培地G 3 mlです。エッジ効果を除外するために、multidishプレート全体に異なる濃度の場所を配布します。また、MSgg培地の1.5ミリリットルを含む24ウェル細胞培養multidishプレートを使用しています。
9. （：1,000希釈1）洗浄スターターカルチャーの3μlの12ウェル細胞培養multidishプレートのウェルに接種。
   注：より低い希釈率、 すなわち 、1：500を使用することができます。これは、ペリクルの開発時間を減少させます。
10. 3日間静的条件下で、23℃でペリクルを成長させます。それはペリクルの最終的な表面形態に影響を与えることができるように、この時間の間にペリクルを動かさないでください。
11. 雷の両眼と均質な露出で画像を取得します。また、高解像度のカメラでペリクルの写真を撮ります。 inconsisに起因するアーチファクトを回避するために、テント光角度と影、カメラ三脚に固定し、両側から45°で柔らかく、大きな光源を使用して、トップダウンの写真を撮ります。
    注：B.を研究するための代替方法枯草菌の多細胞は、固体、バイオフィルム誘導MSgg媒体上のバイオフィルムコロニーアッセイです。ペリクルと同様に、このアッセイは、時空間プロセスの研究を可能にします。小分子阻害剤の有効範囲が決定されると、バイオフィルムコロニー形成に及ぼす影響を研究することができます。
12. 8.5センチメートル直径のペトリ皿当たり4滴 - バイオフィルムコロニーを成長させるために、対称的に洗っていない前培養1.5μlのテンプレートの助けを借りて、乾燥MSgg 1.5％寒天プレート上で（ステップ1.7）を見つけます。滴は、それらを移動する前にプレートに吸着してみましょう。
    注：テンプレートは、細胞が成長しているエリア内のバイオフィルムコロニーの平等な分配を取得するのに役立ちます。テンプレートを準備するには、元のスケールでの成長の総面積を描き同じ宗派にそれを分けますORSと中心をマーク。 8.5センチメートル径の丸シャーレの場合、この14 cm ²で1バイオフィルムコロニーを割り当てます。
13. 3日間30℃で培養します。この間、バイオフィルムコロニーを開発し、3次元、しわ構造を形成します。
14. ステップ1.11のように撮影してください。

2.エタノール耐性アッセイ

1. ステップ1.1から1.7と1.12から1.14に記載されているようにバイオフィルムを成長させます。
2. 30℃での成長の68時間後、カミソリの刃とテンプレートの助けを借りて2等分バイオフィルムコロニーをカット。

図2の例滅菌剤にバイオフィルムコロニー細胞の抵抗性を評価するための実験デザイン。シャーレ全体の生物膜コロニーの平等な分配のためにおよび切断するためのもの（A）のテンプレート。 （B）30℃で固体で、定義されたバイオフィルム誘導MSgg媒体上に68時間増殖させ、未処置の野生型バイオフィルムのトップダウン画像。拡大は、バイオフィルムコロニーは2等分にカットすることができる方法を示しています。 （C）2つの等しいバイオフィルムの半分は、またはPBSまたは滅菌剤と記載されているように処理のいずれかで（PBS、コントロールを）同等に扱われています。スケールバー：1センチメートルこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

3. 慎重に小さなへらで寒天プレートからバイオフィルムコロニーの各半分を持ち上げ、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の500μLを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移動します。必要に応じて、プレートから残りの細胞をこすり、同様にマイクロ遠心チューブに移します。
   注：バイオフィルムコロニーの後半は、それが制御されたりsteriに対する耐性をテストするかどうかに応じて、差動的に処理されますlizingエージェント。
4. 制御のために、ステップ2.3のように500μlのPBS中のバイオフィルムコロニーの後半をインキュベートします。滅菌剤に対する耐性を評価するために、500μlの50％（v / v）のエタノール、バイオフィルムコロニーの後半を転送します。
   注：このような次亜塩素酸ナトリウムのような代替的な殺菌剤を使用することができます。使用されているすべての滅菌剤の場合は、予備実験で活性濃度およびインキュベーション時間を決定します。
5. 室温でベンチトップ上で10分間、バイオフィルムコロニーをインキュベートします。
6. 18,000×gで5分間、バイオフィルムコロニーを遠心し、 慎重にピペットで上清を除去します。 300μlのPBSを追加します。
7. 超音波処理器のマイクロチップで穏やかに細胞（振幅10％、パルス5秒）を超音波処理します。
   注：超音波処理エネルギーは、個別のバイオフィルムの集合体に十分でなければなりません。しかし、あまりにも過酷な超音波処理は、細胞を溶解することができます。光学顕微鏡、超音波処理エネルギーによって事前に確認してください細胞を溶解しない使用し、すべての凝集物が溶解していること。
8. 1ミリリットルの最終容量にPBS700μlのを追加します。 PBS（10 ^-7）で連続希釈を行い、滅菌ガラスビーズを用いて、LB-1.5％寒天プレート上に3希釈100μlの広がり。
   注：これは、関心のバイオフィルムコロニーと滅菌剤に応答した細胞の生存率の細胞の量に依存するようにメッキされる最適な希釈は、予備実験において決定されるべきです。
9. CFUをカウントし、CFU / mlと決定し、30℃で一晩培養します。各半分バイオフィルムコロニーの最終CFU / mlの、生存者の割合を計算します。
   注：実行され、分析記載されているように、対称またはコロニーの耐性を検証コントロールバイオフィルムコロニーの2つの半分と生存細胞数の10％以下の相違点を得なければならない未処理のバイオフィルムコロニーのエタノールで処理した半分の対未処理、 、respectively。代替的に、結果は、全CFUで表すことができます。制御および未処理のバイオフィルムコロニーの細胞数は、同じ大きさの順に残るべきです。これとは対照的に、小分子で処理したバイオフィルムコロニーのエタノールで処理した半分の細胞数は、滅菌剤に対する感受性の増大を請求するために二桁の最小値によって落下することが期待されます。

走査電子顕微鏡観察のため3.バイオフィルムコロニーサンプル調製

1. ステップ1.1から1.7と1.12から1.14に記載されているように、バイオフィルムコロニーを成長させます。
2. 2％の100mMカコジル酸ナトリウム、5mMの塩化カルシウム緩衝液、pH 7.3中の（v / v）のグルタルアルデヒド、3％（v / v）のパラホルムアルデヒド溶液の新鮮なバッチを調製します。 8.5センチメートル直径のすべてのペトリ皿のための固定液5ミリリットルを準備します。
   注意：グルタルアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドは危険です。化学フード内部の安全装置とそれらを扱います。 HAZにソリューションや汚染物質を廃棄ardous廃棄物。
3. 慎重にバイオフィルムの上に直接分配することなく、バイオフィルムコロニーに固定液を追加します。
   注：バイオフィルムコロニーの疎水性により、コロニーをゆっくりと寒天から切り離し、フロートを開始します。
4. 慎重にパラフィルムのストリップとプレートをシール。室温で2時間、ロータリーシェーカー上でインキュベートし、続いて一晩4℃にプレートを転送します。
5. 翌日、慎重に真空ポンプに接続されたパスツールガラスピペットを用いて液体を除去します。
6. 慎重に、バイオフィルムを洗浄し、5分間インキュベート10 100mlのミリモルのカコジル酸ナトリウム、5mMの塩化カルシウム緩衝液を加えます。静かにバイオフィルムを損傷しないように、穏やかにピペッティングすることによって、新鮮な洗浄溶液を追加するために、プレートの隅からパスツールガラスピペットを用いて液体を除去します。一度、この手順を繰り返します。
7. バイオフィルムコロニーの脱水のために、次の手順に進みますのddH ₂ Oで2回5分。 3で2回20分0％エタノール。 50％エタノール中で20分間2倍、 70％エタノール中で20分間2倍、 96％エタノール中で20分間2倍、 2×100％エタノールで30分間。
   1. 各ステップ8.5センチ径のすべてのペトリ皿のための液体の15ミリリットルを追加し、各インキュベーション後に慎重に液体を除去します。
8. エタノールからサンプルを乾燥させるための2つの異なる方法のいずれかを使用します。
   1. エタノールからの空気乾燥の場合：
      1. 四半期中のセルロース濾紙（直径9cm）をカットします。簡単に言えば100％エタノールで1四半期水没し、その後慎重に1浮遊バイオフィルムコロニーを移します。ろ紙を敷いたペトリ皿に湿った濾紙を入れてください。ペトリ皿を覆い、バイオフィルムコロニーは、化学フード内で一晩乾燥してみましょう。
   2. 臨界点（CP）のための遷移流体として二酸化炭素（CO _2）を使用して-drying。
      1. 100％エタノールで臨界点乾燥機チャンバの75％を満たします。独自のCに、ホルダーに各サンプルを、サンプルを転送hamber。必要に応じて、小さな断片にハサミでバイオフィルムをカット。すべての処理中にエタノールに沈めたサンプルを残します。その後、チャンバー内にホルダーを転送し、しっかり室を閉じます。
      2. 7°Cに室を冷却し、攪拌を開始します。液体CO ₂で完全にチャンバーを埋めます。 7分間のインキュベーション時間の間、CO ₂とエタノールミックスをしましょう。その後、溶液の25％を放出します。
         注：サンプルのレベルより下のチャンバーを空にしないでください。
      3. 手順を繰り返し3.8.2.2 4回。
      4. 手順を繰り返し3.8.2.2のみ5分間のインキュベーション時間で5回。最後に、エタノールを完全にCO ₂に置き換えてください。
      5. 最終ラウンド、室内の空のわずか5％の間。撹拌及び冷却をオフにします。 42℃にチャンバーを加熱開始します。 31.1℃の温度および73.9バールの圧力で、液体CO _2は 、臨界点、気体のpH状態になりますASEは、溶媒²⁷の液相と同一の密度を有します。温度が42℃に達すると、10分間インキュベートします。 42℃で、チャンバー内のCO _2は超臨界ガスとして存在します。
         注：常に室の圧力を確認してください。圧力は、42℃で120バールを超えてはなりません。
      6. ゆっくりと連続加熱してガスを放出するために開始します。これは、CO ₂ガス相にサンプルを保持し、液体の表面張力を介してサンプルの形態の変形を防止することができます。微調整によって流量計を制御する計量弁を5リットル/ hrの流量計を設定します。チャンバー内のすべての圧力が解放されるまで待ってください。今すぐ室を開いて、ホルダーから慎重にサンプルを削除します。
9. コートカーボンテープで電子顕微鏡スタブ。ピンセットの助けを借りて、慎重にスタブ上にバイオフィルムコロニーを移します。車から細い橋を追加することで、スタブに各コロニーを接続します電子ビームの下で除電のために重要であるボンテープ、。彼らは非常に壊れやすいように、この段階では、注意してバイオフィルムコロニーを扱います。少なくとも24時間、又は検査までデシケーターでサンプルを保管してください。
10. 走査型電子顕微鏡で検査の日は、金 - パラジウムスパッタコーター中で60°の角度で2分間、バイオフィルムコロニーを-スパッタコート。このステップを2回繰り返し、その間に120°ずつサンプルを回転させます。終わりに、スパッタコートサンプルを一度、上から3分間。金 - パラジウムの20 nmの薄い層は、導電性を向上させ、SEMでのイメージングのための試料のコントラストを向上させます。
11. 走査型電子顕微鏡^29,30で画像化するまで、サンプル²⁸の再水和を避けるために、デシケーター内のサンプルを保管してください。

ペリクルアッセイは、Bの高度に制御し、動的プロセスを研究するための1つの方法であります枯草菌の多細胞。この他にも、ペリクルアッセイは、1つの実験において、単一の細胞培養multidishプレートに予め始動条件または小分子のいずれかの濃度の範囲を試験するのに適しています。しかし、B.枯草菌ペリクルの形成は前培養条件に敏感である（ 例えば 、前培養の増殖培地と成長期）、接種率と前培養培地を除去します。したがって、我々は、最初に、私たちは、D-ロイシンによりペリクル阻害を再現させて実験をスクリーニングしました。我々の結果は、細胞を振盪しながら4時間、37℃で3 mlのLB中で中期対数増殖期（単一コロニーを未定義、リッチLB培地中で前培養された場合、D-ロイシンによる再現ペリクル阻害が得られることを示しています）、スピンダウンし、1の前に定義されたMSgg培地に再懸濁：1,000 inoculatイオン（ 図3A）。細胞は2時間、再希釈1のための1ミリリットルLBで中期対数増殖期（単一コロニーにMSgg培地中で増殖させたとき：100 MSggミリリットル〜3、および200で振盪しながら37℃で5時間増殖させRPM）、前培養培地の除去は、D-ロイシン活性に影響を及ぼしませんでした。定常増殖期まで増殖させた細胞（2時間1ミリリットルのLBに単一のコロニー、1再希釈：100ミリリットルMSgg 3に、室温でローラーで最大20時間増殖させ）前へMSgg培地で洗浄し接種は感受性が低かったです。しかしながら、D-ロイシンのペリクル阻害効果に対する耐性の増加は、接種率を増加させる、前培養の高い細胞密度に起因し得ます。 すなわち MSgg媒体の静的成長の前培養の接種率は、1：500または1：1,000、D-ロイシンの活性領域とペリクル開発の時間（ 図3B）の影響しました。 D-ロイシンによるペリクル阻害が発生しました異なる増殖温度（23°Cと30°C、 図3C）に。 D-ロイシンに対する細胞の感受性は、前培養条件に依存しながら、重要なのは、異なる温度での現象の再現性は、小分子、D-ロイシンによるペリクル阻害が強力な機能を有していることを示しています。

D-ロイシンによるペリクル阻害に対する種々の前培養条件の効果を示す図3の例の結果 、いくつかのパラメータを含む、堅固な実験を得るために評価されなければならない：前培養増殖からの汚染物質の（A）除去（洗浄対洗浄しない）培地、前培養の増殖培地（リッチ、未定義のLB培地または定義されたバイオフィルム誘導MSgg媒体）（、（定常成長期対対数）、および前培養の成長状態を最終の薄膜成長培地に前培養の500）、および（C）成長温度（30℃対23℃）B.：B）接種比（1：1,000対1。 枯草菌 NCIB 3610細胞を洗浄（揺れ、および示された場合は前培養培地はMSggに交換したと（O / N）37℃で一晩または室温で4時間（LBまたはMSgg）示された培地中で成長させたりしました。洗浄していません）。特に明記しないとペリクルを3日間23℃で静的条件下で増殖させていない場合：1,000最後に、スターター培養物1を接種しました。トップダウンの写真はカメラで取得しました。まあ直径は22ミリメートルである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

前培養条件の同定およびDの再現可能な活性範囲に許可実験後薄膜形成のロイシン（MSggで洗浄中期対数増殖期にLB中で増殖させた前培養、1希釈：1,000、3日間23℃で成長させた）を、効果は、そのロバスト性を試験しました。そのためには、薄膜形成にD-ロイシンの活性は、種々の変形MSgg培地（ 図4）で評価しました。ペリクル阻害D-ロイシンの活性範囲は、試験した5培地中で一貫し、かつ薄膜形成に対するD-ロイシンの効果がロバストであることを示しています。同様の傾向は濃度のペリクル阻害は最大2μMは、いくつかの改変MSgg培地（低い鉄濃度及び塩化アンモニウム又はグルコースを炭素源、データではないと窒素源の交換で一致していた範囲D-チロシン、観察されました示されています）。

D-ロイシンに図4感度がで発生します様々な増殖培地。B.のトップダウンの写真をも示されています定義された、バイオフィルム誘導MSgg培地または異なる修飾MSgg培地中で、23℃で静的条件下で成長させた枯草菌 NCIB 3610ペリクル、（炭素源、0.5％グルコース、窒素源、0.5％（NH _4）2 SO _4、高い鉄250μM FeCl _3;低グリセロール0.125％グリセロール）3日間、ペリクルは5日間増殖させた代替窒素源媒体（）のために示した濃度のD-ロイシンなしかとのいずれかを除きます。スターター培養物は、未定義の、豊富なLB培地で振とうしながら37℃で4時間増殖させました。接種の前に、細胞を遠心分離により洗浄し、そして対応するペリクル成長培地に再懸濁しました。スターター培養を1に希釈した：1000、ウェル直径は22ミリメートルである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

B.を研究するための代替方法枯草菌の多細胞は、固体MSgg媒体上のバイオフィルムコロニーアッセイです。ペリクルと同様に、このアッセイは、時空間プロセスの研究を可能にします。小分子阻害剤の有効範囲は、ペリクルシステムで決定されると、バイオフィルムコロニー形成に及ぼす影響を研究することができます。バイオフィルムコロニーはあまり壊れやすく、固体背景に、彼らは、操作が容易であるため、本研究では、バイオフィルムコロニーは、滅菌剤に対するバイオフィルムコロニーのオン抵抗D-ロイシンの効果を評価するために使用されました。 D-ロイシンで処置されたバイオフィルムコロニーを10分間、50％エタノールにさらされているときに、生存細胞の割合は、未処理の画分（ 図5）と比較して劇的に低下します。この方法は、他の小分子阻害剤の効果及び殺菌剤に対する耐性に及ぼす影響を評価するためにさらに開発することができる（sterilizing剤又は抗生物質）。

滅菌剤に対する未処理または処理されたバイオフィルムコロニー抵抗の図5の例の結果。Bのバイオフィルムコロニーサブチリス NCIB 3610は、0.5 mMのD-ロイシンの有無にかかわらず、30℃で68時間、固体、定義された培地上で増殖させました。 2つの等しい半分にコロニーを切断した後、半分を50％エタノールまたはPBS（対照）を用いてPBS（内部対照）および他の半分で処理しました。コロニー形成単位の穏やかな音波処理、連続希釈、めっき及び計数した後、内部コントロールと比較して生存の百分率を計算しました。 2（A）または3（B、C）複製し、その標準偏差の平均値を持つ3つの独立した実験の結果が示されている。 こちらをクリックしてくださいトンOこの図の拡大版を表示します。

走査型電子顕微鏡（SEM）は、バイオフィルムコロニーしわ、EPSの存在および局在化し、単一細胞形態³¹の空間的なアーキテクチャに焦点を合わせるために使用することができる強力なツールです。 SEM画像は、高真空下で画像化することができるサンプルを必要とします。高真空条件下で試料を調査するために、すべてのバルク水分子を除去しなければならないため、SEM画像は、撮影に先立って試料の脱水を必要とします。あるいは、サンプルは、水和サンプルを穏やかに顕微鏡室で乾燥する環境型走査電子顕微鏡（ESEM）、ウェットモードの低真空条件で撮像することができます。バイオフィルムコロニーアーキテクチャ、EPS組織および細胞形態の小分子阻害剤の効果を評価するために、サンプルの脱水の3種類を比較した：湿潤MO下顕微鏡で乾燥デ条件（ESEM）、空気乾燥、溶媒または臨界点（CP）からの遷移流体として二酸化炭素を使用-dried。未処理およびD-ロイシン処理されたBの使用した方法に従って、 枯草菌のバイオフィルムコロニー異なる水和の段階を観察することができました。 ESEMにより、ウェットモードでの低真空条件下でのイメージングは​​、バイオフィルムコロニーの非常に自然な状態を維持しました。しかし、単一の細胞の形態及びEPSの存在量およびアーキテクチャに関する情報はEPSはまだ完全に水和したように、不足した細胞は、EPSに埋め込まれた（データは示さず）。脱水の点で、CP-乾燥が最も厳しい手順でした。これは、組織³²に応じて、百分の30から70の体積損失を占め、組織から最も構造的に結合およびバルク水分子を削除しました。対照的に、空気乾燥は、結合した水分子を保持しました。例えば胚組織は、CP-乾燥³²の後に、揮発性溶媒のエタノールと59％から空気乾燥した後、その容積の18％を失いました。 EPSは、水と結合し、非常に水和されているように、我々はCP-乾燥方法中の水の完全な損失を考慮することをお勧めします。本研究の試料は、エタノールと空気乾燥で脱水した場合には、バイオフィルムコロニーの3次元構造が保存された、単一の細胞が出現し、EPSを平坦化、しかし、彼らはまだ接続し、単一細胞（ 図6A）をカバーしました。エタノールおよびCP-乾燥で脱水したバイオフィルムコロニーはまた、それらの三次元構造を保存し、EPSは、クモの巣（ 図6C）のように見えました。風乾し、CP-乾燥した試料中の、バイオフィルムコロニーアーキテクチャ上の小分子阻害剤のD-ロイシンの効果は、単一細胞形態及びEPS構造（ 図6B及びD）、明らかでした。 D-ロイシンの存在下で増殖させたバイオフィルムコロニーが小さかったシワはあまり顕著でした。 D-ロイシンで処理した細胞は、OBSEある表現型を伸長し、細胞壁を標的分子³³で処理した細胞でrved。さらに、細胞は、明らかに少ないEPSで覆われ、未処理のバイオフィルムコロニー中に見られるようにしっかりとEPSを介してその隣接セルに接続されていません。提示された結果は、遷移流体は、単一細胞の形態上の小分子の効果に関する貴重な洞察力を与えるとして、バイオフィルムコロニー脱水の両方の方法は、空気乾燥エタノールまたはからだけでなく、EPSの豊富さに、二酸化炭素を使用して、CP-乾燥したことを示していますそして、アーキテクチャ。

図6.小分子は、バイオフィルムコロニーアーキテクチャの大小の規模を変更することができます。B.のバイオフィルムコロニーを枯草菌 NCIB 30℃で72時間0.5 mMのD-ロイシンの存在下での3610非存在下で増殖させた（AおよびD）または（BとD）以下のようにエタノールからのプロトコルに記載し、乾燥などの固体MSgg媒体に固定された：（A及びB）、空気乾燥し、（C及びD）CP-乾燥遷移流体として二酸化炭素を用いました。前（左、下パネル）金 - パラジウム - コーティング、低および高倍率に電子顕微鏡スタブに搭載されたトップダウンで乾燥させ、バイオフィルムコロニーの写真を、トップダウンバイオフィルムコロニーの両眼画像（左、上のパネル）も示されていますバイオフィルムコロニーしわまたは単一細胞形態/ EPS組織の3次元構造を示すために、SEMによって取得された画像。左から右にスケールバー：5ミリメートル、100ミクロン、2ミクロンこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表1に本研究で用いた最終的な1×MSgg組成物。

枯草菌フォーム堅牢で高度に構造化されたバイオフィルムの両方の液体中（ペリクル）と固体培地上（コロニー）。したがって、特定のバイオフィルム阻害剤の作用の様式を特徴付けるための理想的なモデル生物として働きます。固形培地に、細胞は、エッジに、中心から放射状にシワのようなペリクルにおいて明らかではない独特の機能を持ったものと多細胞構造を形成します。したがって、ペリクルおよびコロニーは、Bを研究するための補完的なシステムであります枯草菌の多細胞。

この研究の目的は、Bを開発することですバイオフィルム（ペリクルおよびコロニー）阻害のための枯草菌のモデルシステム。いくつかのステップは、バイオフィルムの外乱エッセイの再現のために重要です。最初の重要なステップは、バイオフィルム形成に対する効果はプランクトンライフスタイルで成長した細菌に対する一般毒性によるものではないことを確認することです。これは、所定の濃度の効果を比較することによって考慮することができますプランクトンの成長にこの分子の効果に比べてバイオフィルム阻害に対するモール分子阻害剤。バイオフィルムの開発に劇的に強い効果は、バイオフィルムの開発のために特に重要である標的メカニズムの識別を確保することができます。さらに、本明細書に記載の研究は、ペリクルの開発および小分子に対するそれらの感受性に前培養条件の重要性を示しています。その効果をテストするために、小分子、再現性と堅牢な実験条件（ 例えば 、ペリクル成長温度と培地組成物に対する感受性の欠如）の効果を特徴付ける前に定義する必要があります。このような条件を見つけるために、前培養条件の培地は、前培養前培養培地の除去、成長温度及び成長培地の増殖期を考慮すべきです。

バイオフィルム形成のための特異的阻害剤が発見されると、主要な課題は、定量的な見つけることですバイオフィルムの発達とオン抵抗これらの小分子阻害剤の効果を特徴付ける定性的方法。ここでは、2つの重要な方法は、そのような阻害剤の効果を評価するために使用できる詳細に記載されています。まず、再現性、エタノールなどの殺菌に未処理のコロニーバイオフィルム、に対して処置の耐性を調べることができる簡単な定量的な方法をご紹介します。代表的な結果は、50％エタノールにD-ロイシンで処置したバイオフィルムコロニーの感度を示しています。しかしながら、このエッセイを容易異なる殺菌剤または抗生物質を使用して変更することができます。全体構成、EPSマトリックスの組織化および存在量とそのコンポーネントを、および：第二、SEM法は、いくつかの補完レベルの小分子阻害剤によって引き起こされるバイオフィルムコロニー中の変化の高解像度の検査を可能に詳細に記載されていますバイオフィルム全体で単一細胞形態。私たちは、dehydratiの二つの方法ことに注意してください（遷移流体として二酸化炭素を用いて100％エタノールまたはCP-乾燥空気乾燥）のバイオフィルムコロニーのSEMサンプル調製中に同様に使用することができます。重要なバイオフィルムのサンプルの成功した固定は、主にバイオフィルムコロニーの疎水性に依存しています。この疎水性は、Bの本質的な特徴であります疎水性の表面層^10,34による枯草菌のバイオフィルム。

いくつかのアプローチがBとバイオフィルムアセンブリと開発を研究するために以前に使用されましたモデル生物³⁵として枯草菌 。独立した研究の数は、バイオフィルムの発達^36-38の培地組成の影響を実証しました。これまでのところしかし、バイオフィルム阻害に対する培地組成物の効果の系統的評価が不足している、私たちの知る限り、でした。この研究は、Bのことながら、ペリクル阻害を実証します小分子による枯草菌は 、ウナで、前培養条件に敏感です温度および培地組成、および小分子阻害剤の体系的スクリーニングのために有用での効果によってffected。また、私たちは現在、バイオフィルムモデル生物Bに欠け、抗菌剤への未処理または小分子阻害剤で処理したバイオフィルムコロニーの耐性を評価するために、簡単な再現性の定量法を確立しました枯草菌 。

蛍光レポーターと組み合わせて、 枯草菌のバイオフィルムは、バイオフィルム形成の特定の発達段階やバイオフィルム内の細胞の特定の亜集団のいずれかを標的とする低分子阻害剤を探すために、さらに撮影することができます。本明細書に記載される方法は、バイオフィルム内の遺伝子発現の観点から単細胞解像度を提供しません。 B.内EPSマトリックス遺伝子発現解析のための方法単一細胞レベルでの枯草菌のバイオフィルムが正常に³⁹を樹立しました。

細菌性バイオフィルムはcruciaであります、農業、工業および臨床設定におけるリットルの意義。農業関連では、バイオフィルムを形成する能力は、多くの植物の植物宿主のコロニー形成が^40を病原体、および臨床状況で、バイオフィルムは抗菌剤²¹に対して本質的に耐性があり、多くの永続的および慢性細菌感染症の中核である増加します。また、今、彼らは削除することが極めて困難であり^、41を制御^するようにバイオフィルムは、業界に大きなコストへの影響を持っていることが認められます。このように、微生物のバイオフィルム阻害剤の研究のための実験的なフレームワークを開発することが重要な農業^42,43、臨床^21,44を提供^し 、技術の^45-47進歩ます。

現在の方法は、Bに限定されています枯草菌 。我々としても、他の種でのバイオフィルム特有の小分子阻害剤を研究するための説明定量的および定性的な概念を以下の奨励します。加えて本研究は、以前に公開された¹⁷のいくつかの特定のバイオフィルム阻害剤のうち、D-ロイシンによりバイオフィルム阻害の具体例に関する。重要なことは、D-ロイシンは、すでに植物コロニー形成およびバイオフィルム形成の間の可能な類似性を提示し、植物病原体キサントモナスcitri ⁴⁸で抗バイオフィルム分子として特徴付けられました。バイオフィルム形成（ペリクルとしわコロニー形成）は、ヒトの病原体（ 例えば、 緑膿菌 ^49-51と尿路病原性大腸菌 ^52,53）にも一般的です。記載の方法は、バイオフィルム形成を阻害し、臨床研究中の抗菌剤に対するバイオフィルムにより媒介される耐性を低下させる特定の薬物を検索するためにさらに開発することができます。全体的に、ここで説明する方法は、他の種でのバイオフィルム特異的小分子阻害剤を研究するために定量的および定性的な概念を開発するための基礎として使用することができます。

The authors have nothing to disclose.

Electron microscope imaging was conducted at the Electron Microscopy Unit of the Weizmann Institute of Science, supported in part by the Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. This research was also supported by the ISF I-CORE grant 152/1, Mr. and Mrs. Dan Kane, Ms. Lois Rosen, by a Yeda-Sela research grant, by the Larson Charitable Foundation, by Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, by the Ilse Katz Institute for Materials Sciences and Magnetic Resonance Research grant, by the Ministry of Health grant for alternative research methods, and by the France-Israel Cooperation - Maimonide-Israel Research Program. IKG is a recipient of the Rowland and Sylvia Career Development Chair.