VacuSIP, um método melhorado para Inex

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Alimentadores de suspensão bentônicos desempenham um papel essencial no funcionamento dos ecossistemas marinhos ^1. Ao filtrar grandes volumes de água ^2,3, eles removem e excretar partículas (plâncton e detritos) e compostos dissolvidos ¹ (e referências) e são um importante agente de acoplamento de ^4,5 bentônica-pelágica e ciclagem de nutrientes ^6,7. Com precisão medir a partículas e compostos dissolvidos removidos e excretados pelos alimentadores de suspensão bentônicas (como esponjas, ascídias, poliquetas, e bivalves) é fundamental para compreender a sua fisiologia, metabolismo e ecologia alimentar. Juntamente com bombeamento medições da taxa, ele também permite a quantificação dos fluxos de nutrientes mediadas por estes organismos e seu impacto ecológico na qualidade da água, bem como em processos de escala do ecossistema.

Escolhendo o método adequado para medir as taxas de remoção e produção de partículas e com dissolvidalibras por filtradores de suspensão é fundamental para a obtenção de dados fiáveis ​​sobre a sua atividade alimentar ^8. Como apontado por Riisgård e outros, inadequadas metodologias viés resultados, distorcer as condições experimentais, produzir estimativas incorretas de ingestão e excreção de certas substâncias, e pode levar à quantificação errônea dos fluxos de nutrientes processados ​​por esses organismos.

Os dois métodos mais utilizados para medir partículas e fluxos de nutrientes dissolvidos em alimentadores do filtro envolver a incubação (técnicas indiretas) ou cobrança simultânea de ambiente e água expirado (técnicas diretas). Incubação técnicas baseiam-se na medição da taxa de alteração da concentração de partículas e nutrientes dissolvidos na água incubadas, e estimar as taxas de produção ou remoção comparação com os controlos adequados ^8. No entanto, encerrando um organismo em uma câmara de incubação pode alterar a sua feeding e comportamento de bombagem devido a alterações no regime de fluxo natural, devido a uma diminuição em oxigénio e / ou na concentração de alimentos, ou devido à acumulação de compostos excreção na água de incubação ^7,9 (e suas referências). Em adição aos efeitos de confinamento e de abastecimento de água modificado, uma grande tendência de técnicas de incubação decorre de efeitos de re-filtração (ver por exemplo ^10). Embora alguns destes problemas metodológicos foram superadas, utilizando o volume direito e forma do recipiente de incubação ¹¹ ou com a introdução de um sistema de redoma de recirculação ¹² in situ, esta técnica muitas vezes subestima taxas de remoção e de produção. A quantificação do metabolismo de compostos dissolvidos tais como o azoto orgânico dissolvido (DON) e o carbono (DOC) ou nutrientes inorgânicos, tem provado ser especialmente propensos a erros causados ​​por técnicas de incubação ^13.

No final dos anos 60 e início dos anos 70, Henry Reiswig^9,14,15 foi pioneira na aplicação de técnicas diretas para quantificar remoção de partículas por esponjas Caribe gigantes, por amostragem separadamente a água inspirado e expirado pelos organismos in situ. Devido à dificuldade de aplicar a técnica de Reiswig em alimentadores de suspensão menores e em condições submarinas mais desafiadoras, a maior parte da investigação neste campo foi restrito ao laboratório (in vitro) empregando principalmente técnicas de incubação indiretos ^16. Yahel e colegas reaparelhado Reiswig do direta técnica in situ a trabalhar em condições de menor escala. Seu método, denominado Inex ^16, é baseado em amostragem subaquática simultânea da água inalado (In) e expirado (Ex) por organismos não perturbadas. A concentração diferente de uma substância (por exemplo, bactérias) entre um par de amostras (iNEX) proporciona uma medida da retenção (ou produção) de substância que pelo animal. A técnica Inex emprega tubos abertas ebaseia-se no jacto excurrente produzido pela actividade de bombeamento do organismo estudado para substituir passivamente a água ambiente no tubo de recolha. Enquanto Yahel e colegas aplicaram com sucesso esta técnica no estudo de mais de 15 suspensão alimentadores diferentes taxa (por exemplo, ^17), o método é limitado pelo alto nível de prática e experiência necessários, pelo tamanho minúsculo de alguns orifícios excurrentes, e por condições do mar.

Para superar esses obstáculos, desenvolvemos uma técnica alternativa baseada na sucção controlada da água amostrada através de tubos hora (diâmetro externo <1,6 mm). Nosso objetivo era criar um dispositivo simples, confiável e de baixo custo que permitiria limpo e controlado de amostragem de água situ a partir de um ponto muito específico, como o orifício excurrent de alimentadores de suspensão bentônicos. Para ser eficaz, o método tem de ser não-intrusivo, de modo a não afectar o regime de fluxo ambiente ou modificar o behavior dos organismos estudados. O dispositivo apresentado aqui é denominado VacuSIP. É uma simplificação do sistema desenvolvido pelo SIP Yahel et ai. (2007) ¹⁸ para amostragem por pontos baseado em ROV no fundo do mar. O VacuSIP é consideravelmente mais barato do que a SIP original e foi adaptado para o trabalho baseado em mergulho. O sistema foi projetado de acordo com os princípios apresentados e testados por Wright e Stephens (1978) ¹⁹ e Møhlenberg e Riisgård (1978) ²⁰ para ambientes de laboratório.

Embora o sistema VacuSIP foi concebido para estudos in situ do metabolismo dos alimentadores de suspensão bentônicos, ele também pode ser usado para os estudos de laboratório e onde é necessária, uma amostra de água de ponto fonte controlada e limpo. O sistema é especialmente útil quando a integração ao longo de períodos prolongados (mínimo de-horas) ou em filtrações in situ são obrigatórios. O VacuSIP tem sido utilizado com sucesso no laboratório Yahel desde 2011, e tem tambémsido empregado em dois estudos recentes de fluxos de nutrientes mediadas por espécies de esponjas das Caraíbas e Mediterrâneo ²¹ (Morganti et al. apresentado).

O uso de samplers específicas, a duração de amostragem prolongada, e as condições de campo, em que VacuSIP é aplicado, implicará alguns desvios protocolos oceanográficos padrão para coletar, filtrar, analisar e armazenar amostras de analitos sensíveis. Para reduzir o risco de contaminação pelo sistema VacuSIP ou o risco de modificação da água amostrada por actividade bacteriana após a recolha, foi testada em vários procedimentos de filtração e de armazenamento in situ. Diferentes dispositivos de filtragem, recipientes de recolha, armazenamento e procedimentos foram examinados a fim de alcançar a técnica mais adequada para a análise de dissolvido inorgânico (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ^+, SiO ₄₎ e orgânico (DOC + DON) compostos e ultra-plâncton (<1081; m) e partículas orgânicas (POC + PON amostragem). Para reduzir ainda mais o risco de contaminação, especialmente em condições de campo, o número de passos de manipulação foi reduzida ao mínimo. O formato visual no qual o método é apresentado é orientada para facilitar a reprodutibilidade e a reduzir o tempo necessário para aplicar a técnica de forma eficiente.

Visão geral do sistema

Para obter a amostra em água in situ bombeada de alimentadores de suspensão com orifícios exhalant tão pequenas quanto 2 mm, a actividade de bombagem de cada espécime é primeiramente visualizada através da libertação filtrada fluoresceína tingido água do mar junto ao orifício de inalação (s) e observando-se o seu fluxo a partir da abertura excurrente ¹⁶ (ver também a Figura 2B em ^18). A água inspirado e expirado pelo espécimen do estudo (incurrent e excurrentes) são então amostrados simultaneamente com a utilização de um par de tubos instalados na hora manipulador-construído sob encomenda ou em dois dos "ARMS "de um tripé portátil flexível de cabeça para baixo (Figura 1 e suplementares Vídeo 1). A água inalado pelo organismo estudo é recolhido por posicionando cuidadosamente a extremidade proximal de um tubo no interior ou perto da abertura de inalação do organismo estudo. Um idêntico tubo é então posicionado no interior do orifício excurrente. Esta operação requer o cuidado de evitar o contacto ou perturbação do animal, por exemplo, por ressuspensão do sedimento. para iniciar a amostragem, um mergulhador perfura um septo no recipiente de recolha com uma agulha de seringa ligado à extremidade distal de cada tubo, permitindo que a pressão de água externa para forçar a água amostrada para dentro do recipiente através do tubo de amostragem. a sucção é iniciada pelo vácuo criado previamente nos frascos e pela diferença de pressão entre a água externa e o recipiente da amostra evacuada .

Para garantir uma coleção de água limpa exalado e evitar aspiração acidental de ambiágua ent ^16, a taxa de amostragem da água deve ser mantida a uma taxa significativamente mais baixa (<10%) do que a taxa de fluxo excurrent. A taxa de sucção é controlada pelo comprimento do tubo e o seu diâmetro interno (ID). O diâmetro interno pequeno também garante um volume morto insignificante (<200 ul por metro de tubo). Recolha de amostras durante períodos prolongados (minutos a horas) faz com que seja possível integrar o patchiness inerente da maioria das substâncias de interesse. Para garantir que as amostras sejam adequadamente preservadas em sessões de amostragem subaquáticas prolongadas, bem como para o transporte para o laboratório, uma filtração em situ é recomendado para analitos sensíveis. A seleção dos vasos de amostragem, montagem de filtração, e tubos são ditadas pelos organismos de estudo e a questão de pesquisa específica. O protocolo descrito abaixo assume que um perfil metabólico completo é de interesse (para um resumo ver Figura 2). No entanto, a natureza modular do protocolo permite Fou modificação fácil para acomodar esquemas de amostragem simples ou até mesmo muito diferentes. Para um perfil metabólico completo, o protocolo de amostragem deve incluir os seguintes passos: (1) A visualização de fluxo; (2) alimentação amostragem ultra-plâncton (plâncton <10 mm); (3) A amostragem absorção de nutrientes inorgânicos e excreção (usando filtros em linha); (4) Amostra dissolvida absorção orgânica e excreção (usando filtros em linha); (5) a alimentação de partículas e excreção (usando filtros em linha); (6) Repita o passo 2 (alimentação ultra-plâncton como verificação de qualidade); (7) O fluxo de visualização.

Quando logisticamente viável, recomenda-se que as medições de perfil metabólicas são combinados com a taxa de bombeamento (por exemplo, o método a velocidade da frente de corante, em ^16), bem como com as medições de respiração. Estas medições são as melhores tomadas no início e no final da sessão de amostragem. Para a medição da respiração, optodes subaquáticas ou micro-eletrodos são preferíveis.

1. Passos de preparação e limpeza Procedimentos

1. Solução de limpeza
   1. Usar equipamento de proteção, um jaleco e luvas em todos os momentos. Realizar estas etapas preparatórias em um espaço limpo livre de poeira e fumaça.
   2. Preparar uma solução clorídrico 5-10% de ácido (HCl) com frescos, de alta qualidade, água bidestilada.
   3. Prepare a 5% de mistura de base altamente solúvel da solução de surfactante aniónico e não iónico (Veja Lista de Materiais) com frescos, de alta qualidade, água bidestilada.
   4. Armazenar todas as soluções em limpo, lavado com ácido recipientes.
2. Etapas preparatórias e procedimentos de limpeza (no laboratório)
   NOTA: Se os compostos de fósforo não são de interesse, a lavagem de HCl pode ser substituído pelo ácido fosfórico alta qualidade (H ₃ PO ₄₎ lavagem (8% de H ₃ PO ₄ a concentração final).
   1. Usar equipamento de proteção, um jaleco e luvas em todos os momentos.
   2. lavaro aparelho de amostragem (excluindo de aço inoxidável porta-filtro in-line Swinney) com uma ampla quantidade de água de alta pureza. Deixar o aparelho de imersão em solução de HCl a 5-10% durante a noite. Lavar o aparelho novamente com uma ampla quantidade de alta qualidade de água bidestilada.
   3. Lave os aço inoxidável porta-filtros Swinney em linha com uma ampla quantidade de água de alta pureza. Deixar os porta-filtros de imersão em 5% mistura básica altamente solúvel da solução de tensoativos aniônicos e não iônicos durante a noite. Lave-os novamente com amplo alta qualidade de água bidestilada.
   4. Secar todo o aparato de amostragem, envolvê-los em papel alumínio e manter em uma caixa limpa até à sua utilização.
3. Controle de taxa de sucção
   1. Controlar a taxa de amostragem, ajustando o comprimento e o diâmetro interno do tubo de entrada de acordo com a profundidade de trabalho planeado e temperatura da água. Utilizar a seguinte equação (derivado a partir da equação de Hagen-Poiseuille usado para totalmente desenfluxo laminar tubo de desen-) como um guia: em que F = caudal (cm ³ min ^-1), AP = Pressão diferencial (bar), r = raio interno da tubagem de entrada (cm), K = 2,417 x 10 ^-9 (seg ^-2), L = comprimento do tubo (cm ), v = viscosidade da água (g ^{cm-1 seg-1).} Ver Tabela 1 para obter mais detalhes.
   2. Manter a taxa de amostragem inferior a 1% do caudal de bombagem do animal estudado.
      NOTA: Usando recipientes evacuados, às vezes com vácuo desconhecida coloca complicações adicionais. Portanto, um teste de campo é altamente recomendado. Aos 10 m de profundidade e 22 ° C, a água do mar ~ (40 PSU), um tubo de entrada de 50 cm com um diâmetro interno de 254 uM proporciona uma taxa média de sucção de ~ 26 seg ^-1 ul (1,56 mL min ^-1).
4. vasos de amostragem
   1. Para amostras de pequeno volume (3-20 ml, por exemplo, ultra-plâncton para cit fluxoometry) usam tubos de plástico pré-aspirado estéreis.
      NOTA: Pré-aspirado tubos de plástico estéril, que são rotineiramente utilizados para exames de sangue padrão em seres humanos; certifique-se de usar os tubos estéreis, sem aditivos. Estes tubos plásticos estéreis aspirados são mais bem amostrado com o uso do suporte tubo estéril, de uso único com off-center Luer. Embora este seja o aparelho de amostragem mais segura e mais eficiente, que tem um volume morto ligeiramente maior em comparação com uma agulha simples.
   2. Para amostras de água maiores, como nutrientes e matéria orgânica dissolvida, use 40 ou 60 ml frascos de vidro que atendem aos critérios Environmental Protection Agency (EPA) para análises orgânicos voláteis. Estes frascos incluem uma tampa de polipropileno com um septo de silicone com cara de PTFE.
   3. Para volumes ainda maiores, usar garrafas de penicilina com tampas de borracha ou garrafas térmicas.
   4. Use frascos de polietileno de alta densidade (HDPE) frascos para amostras de sílica.
   5. Para aumentar o volume da amostra e para reduzir o risco de desalojar o bujãodurante a subida, evacuar itens (vácuo) 1.4.2-1.4.4 antes do mergulho com uma bomba de vácuo. Vácuo manualmente, utilizando uma bomba de vácuo ou até mesmo lado sugando o ar com uma seringa. No entanto, para obter os melhores resultados, uma boa bomba de vácuo é recomendada. liofilizadores padrão fornece alto vácuo.
      NOTA: Preste atenção especial ao usar grandes frascos aspirado para garantir que a taxa de sucção mais rápido inicial não iria contaminar as amostras de água exalados.
5. Procedimentos de limpeza navio
   1. Para orgânicos dissolvidos e NH ₄ ⁺ análise, utilizar novos frascos pré-limpas EPA.
   2. Lavar os frascos (vidro e PEAD) para a análise de outros nutrientes como segue:
      1. Lavar os frascos (vidro e PEAD) e as tampas de polipropileno com alta qualidade de água bidestilada. Instale um novo septo de silicone.
      2. Mergulhe os frascos (em vidro e PEAD) em 10% dos HCl por pelo menos 3 dias e enxaguar com amplo alta qualidade da água bidestilada.
      3. Combust os frascos de vidro a 450 ° C durante 4 horas e deixa-se arrefecer no forno. Instale a tampa e embrulhe em papel alumínio até o uso.
6. filtros
   1. Use filtros de fibra de vidro sem pasta para a filtragem de todas as amostras orgânicas dissolvidas (por exemplo, DOC, DON) e para a recolha de orgânicos particulados (eg, POC, PON). Embale cada filtro de vidro em um envelope de papel alumínio separado. Combustão a 400 ° C durante 2 horas para volatilizar resíduos orgânicos e armazenar em um recipiente limpo e seco até a sua utilização.
   2. Use um filtro de fibra de vidro sem aglutinantes como acima, ou membranas de policarbonato de 0,2 um para amostragem nutrientes inorgânicos (por exemplo, PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ^+). Limpar o último, uma vez instalado no suporte do filtro, como explicado abaixo (1.7.3).
   3. Use 0,2 mm filtros membranas de policarbonato para a amostragem de sílica. Limpá-los uma vez installed no suporte do filtro, como explicado abaixo (1.7.3).
7. Preparação de conjunto de filtração
   1. Filtra-se a mistura de base altamente solúvel aniónico e de solução de agente tensioactivo não iónico e a água bidestilada alta qualidade através de um filtro de 0,2 um antes de os usar para limpar o conjunto de filtração.
   2. conjunto de filtração de nutrientes e outros que a sílica orgânicos dissolvidos:
      1. Coloque um queimados filtros de fibra de vidro sem pasta no interior de aço inoxidável porta-filtro limpo em linha Swinney.
      2. Usar uma seringa limpa-ácido para executar 100 ml de 5% de mistura de base altamente solúvel aniónico e de solução de agente tensioactivo não iónico e, em seguida, 100 ml de alta qualidade da água destilada duas vezes através de todo o conjunto.
   3. Conjunto de filtração para SiO _4:
      1. Coloque o filtro de policarbonato dentro do porta-filtro de policarbonato a limpas (porta-filtro PC).
      2. Use uma seringa limpa-ácido para run 30 ml de HCl 5% e 30 ml de água de alta qualidade destilada duas vezes através de todo o conjunto.
8. montagem do sistema
   1. Montar o sistema para o trabalho debaixo de água utilizando tubagem de PEEK (poliéter éter cetona) com um diâmetro externo (OD) de 1,6 mm e um diâmetro interno (ID) de 254 uM ou 177 uM.
   2. Com uma faca ou PEEK cortador afiada para cortar os tubos para o comprimento requerido.
   3. Na sua extremidade distai (lado do recipiente da amostra), encaixam cada tubo com um conector Luer macho ligado a uma agulha de seringa. Certifique-se de que você siga as instruções do fabricante e alinhe o lado liso azul ferrolho flange com a extremidade do tubo antes de apertar a porca verde.
   4. Conecte o tubo PEEK ao tripé "braços" ou manipulador custom-built, utilizando uma fita isolante.
   5. Anexar uma agulha de seringa descartável ao conector Luer macho. Mantenha a agulha com a tampa de protecção para evitar ferimentos.
   6. Claramente rotular o código da arte de amostragem e cor todos os componentes inalados e exalados (por exemplo, verde = In, vermelho = Ex).
   7. Da mesma forma código de cor os vasos de amostragem com conjuntos de vasos de amostragem emparelhados numeradas sequencialmente.

2. Underwater Trabalho

1. A preparação do local de trabalho
   1. Levantamento preliminar e seleção de espécimes
      Nota: Devido à natureza complexa do protocolo de amostragem subaquática, dedicando o tempo necessário para a preparação irá garantir um mergulho de amostragem eficiente.
      1. O levantamento do local de trabalho e fazer os preparativos necessários antes do tempo.
      2. Selecionar e marcar organismos visados ​​adequados que podem ser acessados ​​de forma relativamente fácil. Como nem todos os organismos podem necessariamente ser ativo no momento do mergulho de amostragem, prepare mais postos de trabalho do que o esperado para amostra.
   2. A instalação de suportes de base
      1. wheN trabalhando no substrato nivelado:
         1. Montar o clipe de liberação rápida original do tripé flexível em 1 pesos kg de mergulho e simplesmente posicioná-lo próximo ao animal-alvo.
      2. Ao trabalhar em paredes verticais:
         1. Montagem de placas de suporte de base para o sistema VacuSIP, ganchos para engrenagem acessório, e cabides para o recipiente de recolha levando a bandeja durante a fase de local de trabalho de preparação (2.1.1).
         2. Quando são usados ​​tripés portáteis flexíveis, utilize parafusos ou resina epóxi bi-componente para fixar placas de 10x10 cm de PVC ao lado de cada animal-alvo. Cada placa tem de ter um buraco para anexar os clipes de liberação rápida do tripé portátil flexível.
         3. Uma vez que a resina curada e as placas de base estão solidamente fixado à parede, o parafuso nos clipes de libertação rápida, que serve como um ponto de fixação firme para o tripé flexível portátil para o sistema VacuSIP.
2. Instalando o VaCUSIP
   1. Verificar se o espécime é de bombagem através da libertação de corante de fluoresceína filtrado ao lado do orifício de inalação e confirmar que o corante está a emergir através do orifício exhalent como descrito no Yahel et al. (2005) ^16.
   2. Instalar o dispositivo VacuSIP e colocar o tubo de inalantes (IN) amostragem dentro do orifício de inalação ou simplesmente ao lado dele (dentro de ~ 5 mm). Certifique-se de que o tubo de inalação não está na proximidade de um outro orifício exhalant.
   3. Cuidadosamente dirigir o tubo de amostragem exhalant (EX) para o osculum / sifão exhalant e muito gentilmente insira-o, até que ele seja posicionado 1-5 mm dentro do osculum / sifão exhalant (ver Figura 1 e Suplementar Video 1). Tome muito cuidado para não fazer contato com ou interrompa o organismo amostrados.
   4. Antes e durante a amostragem verifique a localização de ambos os tubos.
   5. Após a verificação de amostragem se o espécime ainda está bombeando como descrita acima (2.2.1).
      Observação: Como o movimento de um braço do tripé ao manipular o outro pode ocorrer, certifique-se de colocar em primeiro lugar o tubo de amostragem inalantes e em segundo lugar o tubo exhalant, o que exige a manipulação mais precisa. Seguindo esta ordem, mesmo se a manipulação do tubo de amostragem exhalant pode fazer com que o movimento do tubo de inalação, que não afectará a amostragem.
3. Procedimento de amostragem subaquática Modular
   NOTA: Na pendência na questão de pesquisa, cada uma das etapas experimentais abaixo podem ser realizados como uma experiência stand-alone. O protocolo de amostragem perfil metabólico completo descrito abaixo é um processo demorado, exigindo até 8 horas por amostra (para uma visão geral veja a Figura 2 e Tabela 2). Como as condições e regulamentos de mergulho diferentes entre locais de amostragem, regiões e instituições, planos de mergulho não estão incluídos neste protocolo. No entanto, dedicar um cuidado extremo e metiplanejamento culous para o plano de mergulho. Preste especial atenção para evitar saturação e yoyo perfis de mergulho. Quando possível, é conveniente realizar estas experiências a pouca profundidade (<10 m). rebreathers de circuito fechado pode ser muito útil para tais esquemas de amostragem prolongados.
   1. Antes de amostragem real começa, certifique-se há traços visíveis de resíduo de fluoresceína permanecem e que sedimentos em suspensão foram resolvidos ou têm flutuou para longe.
      
   2. Ultra-plâncton, (sem filtro é instalado nesta etapa!)
      1. Use a agulha para perfurar a IN (inalada) e EX (exalado) aspirado tubos de plástico estéril septos. Verifique se a água está pingando na à taxa planejada e recolher amostras 2-6 ml de água.
      2. Em recuperação, manter as amostras em uma caixa de frio no gelo. No laboratório, preservar com paraformaldeído a 1% + 0,05% de glutaraldeído grau EM (concentração final), ou 0,2% de glutaraldeído grau EM. Congelar criotubos em azoto líquido e armazenar a -80 &# 176; C até à análise.
   3. Silicato de amostragem e armazenamento
      1. Instalar o suporte de filtro de PC pré-limpos em-linha de aço inoxidável contendo uma membrana de policarbonato de 0,2 um entre a agulha e o conector Luer macho na extremidade distai do tubo.
      2. Pierce a tampa de septo de os frascos de polietileno de alta densidade pré-limpeza (frascos de HDPE) para iniciar a amostragem. Verificar se ambos os amostradores são gotejamento e recolher 15 ml de água em cada frasco.
      3. Manter as amostras refrigerado (4 ° C) até à análise. Se a análise não pode começar dentro de duas semanas, armazenar a -20 ° C. Para a análise, certifique-se de que as amostras são descongeladas a 50 ° C durante pelo menos 50 min para dissolver o gel de sílica.
         NOTA: A membrana pode ser preservado por microscopia ou análise de DNA, conforme necessário.
   4. Inorgânicos dissolvidos (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ⁺⁾
      1. Substitua tele conjunto de filtro PC com um suporte de filtro pré-limpos em-linha de aço inoxidável, que contém um filtro de vidro pré-combustão.
      2. Antes da amostragem, assegurar que, pelo menos, 20 ml de amostras de água do mar foram passados ​​através de todo o sistema de filtração através da utilização de EPA, frascos de polietileno de alta densidade ou outro recipiente de vácuo a iniciar a sucção. Medir o volume da água recolhida antes de serem descartados.
      3. Pierce a tampa de septo dos frascos de vidro da EPA apropriadas para iniciar a amostragem, verifique se ambos os samplers estão pingando, e recolher 25-30 ml de nitrato e fosfato análise.
      4. Mudar para novos frascos de vidro EPA para análise de amônia, verifique se ambos os samplers estão pingando, e recolher 20 ml em cada frasco.
      5. Manter as amostras em um quadro de frio em gelo e armazenar a -20 ° C até a análise.
         NOTA: Se apenas o filtrado é de interesse, filtros de seringa descartáveis ​​pode ser usado para passos 2.3.3 e 2.3.4.
   5. Orgânicos dissolvidos amostragem e st (DOC + DON)o anel
      NOTA: Mantenha as amostras o mais vertical possível em toda a manipulação de modo que a água amostra não entram em contato com os septos de silicone.
      1. Continue a utilizar o conjunto de filtro de aço inoxidável e recolher 20 ml de amostras de água do mar em novos frascos de vidro de EPA, tal como descrito acima.
      2. Após a recuperação, manter as amostras em uma caixa de frio no gelo. No laboratório, utilizar uma pipeta de Pasteur de vidro pré-combustão para fixar as amostras com ácido ortofosfórico (adicionar 5-6 gotas de ácido de grau de vestígios metálicos em 25% a 20 ml da amostra, concentração final 0,04%) ou ácido clorídrico (2 gotas adicionar de metais traço grau concentrada em ácido de uma amostra de 20 ml, concentração final 0,1%) e manter refrigerado.
      3. Manter as amostras refrigerado (4 ° C) até à análise. Se as amostras não são analisadas dentro de uma semana de recolha, armazenar a -20 ° C até a análise.
   6. Partículas de matéria orgânica (POC, PON, POP)
      1. Continue usando o stainless conjunto de filtro de aço e filtro de pelo menos 500 ml de água do mar em um balão de 250 ml de vácuo evacuados. Substitua frascos, se necessário.
      2. Em recuperação, use uma seringa cheia de ar para evacuar toda a água do mar restante do suporte do filtro, envolvê-la em papel de alumínio e guarde em uma caixa de frio no gelo. No laboratório, remover os filtros a partir dos suportes de filtro e armazenar a -20 ° C até a análise.

Figura 1. Um exemplo de instalações correctas do VacuSIP: (a) A amostragem da ascídia Polycarpa mytiligera (Golfo de Aqaba, Mar Vermelho), utilizando um manipulador custom-built com o código de cores usado verde para inalado e amarelo para amostras de água no ar exalado (foto por Tom Shelizenger e Yuval Yacobi); (B) a amostragem dos oroides esponja Agelas (NW MediterrâneoMar) com uma largura osculum de 3 mm, usando o dispositivo VacuSIP. O código de cores usado é amarelo por inalação e vermelho para amostras de água no ar exalado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Vista geral da técnica VacuSIP descrito na secção protocolo. O trabalho de laboratório é representado em caixas amarelas, o trabalho de campo em caixas azuis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. As taxas de amostragem média global (ml min ^-1) obtido com recipientes diferentesusados ​​para conjuntos de água e diferentes níveis de vácuo: os balões não foram aspirado (nenhum); frascos de vidro de EPA e frascos de PEAD foram aspirado metade do seu volume (½ volume); tubos de plástico estéreis já foram aspirados pelo fabricante. Trabalhando a 5-8 m de profundidade, temperatura da água de 18-22 ° C, utilizando tubos PEEK de comprimento 79 cm, e de 25 um diâmetro interno.

Tabela 2. Resumo do recipiente de amostragem, do conjunto do filtro fixador, em linha, de armazenamento e métodos analíticos descritos na secção protocolo. Os compostos analisados ​​são: abundância ultra-plâncton (plâncton <10 mm), silicato (SiO _4), fosfato (PO ₄ ^3-), nitrito + nitrato (NO ₂ ^- + NO ₃ ^-), dissolvido matéria orgânica (DOM), de amónio _(NH4 ⁺⁾ e matéria orgânica em partículas(POM). Todos os utensílios de amostragem têm tampa de septo de silicone e são aspirados antes da amostragem. Os fixadores são: paraformaldeído + glutaraldeído (Glut + Parafor), ácido ortofosfórico (H ₃ PO ₄₎ e ácido clorídrico (HCl). Os conjuntos de filtro in-line utilizados são: suportes de filtros de policarbonato e policarbonato de membrana de 0,2 mm filtros (porta-filtro PC + membrana PC) e suportes de filtros de aço inoxidável e fibra de vidro livre de ligante filtros GFF.

Otimização dos métodos de coleta de água do mar

Seleção de frascos de coletor e procedimento de limpeza

vasos de coleta VacuSIP compatíveis devem ter um septo que permite amostragem a ser iniciada por perfuração com uma agulha de seringa. Eles devem suportar a pressão debaixo d'água elevada (2-3 bares no scuba típicos profundidades de trabalho), e deve manter um vácuo. Muitos (mas não todas as marcas) de frascos aprovados pela EPA para a análise de compostos orgânicos voláteis atender a esses critérios. frascos de pré-limpeza aprovados para DOC e análise DON também estão disponíveis. Para testar a adequação destes frascos para a coleta e análise de nutrientes e otimizar procedimentos de limpeza, água duas vezes destilada de alta qualidade foi recolhido em tubos de polipropileno limpo de ácido (tubos PP), recém-adquirido, em umfrascos de polietileno de alta densidade feita-cid (frascos de HDPE), em frascos de vidro e da EPA, todos equipados com uma tampa de septo de politetrafluoroetileno (PTFE). Os frascos de polietileno de alta densidade e tubos de polipropileno foram limpos tal como descrito na secção 1.5.2, supra, e os frascos de vidro de EPA foram limpos pelo fabricante.

A quantidade de _NH4 ⁺ encontrado em frascos de vidro de EPA era relativamente mínima (≤ 0,1 mol L ^-1) e depende da qualidade bidestilada padrão de água de alta qualidade. Em contraste, NH ₄ ⁺ as concentrações aumentou significativamente (até 3 e 7 vezes, respectivamente) e exibiu uma variabilidade mais elevada em tubos de polipropileno limpos com ácido e em frascos de polietileno de alta densidade (ANOVA F _(5,53) = 7,183, p < 0,001, Figura 3). Não houve efeito de alta qualidade double contato com a água destilada com o septo de silicone na análise de amónio.

Comparação de novos frascos de vidro contra frascos de vidro limpos / reciclados

Para testar se os frascos de vidro de EPA pode ser utilizado para a análise de nutrientes mais do que uma vez, o NO _x ^-, PO ₄ ^3-, e NH ₄ ⁺ as concentrações em amostras de água do mar recolhidos em novos frascos de vidro EPA foram comparados com os dados recolhidos em frascos de vidro de EPA usados. Os novos frascos de vidro EPA foram pré-limpos por o fabricante, enquanto que os frascos de vidro reciclado foram limpos tal como descrito acima (1.5.2). Reciclados frascos tinham significativamente mais elevada concentração _de NH ₄ ^+, até 1,5 vezes o nível encontrado em novos frascos de vidro (teste t, p <0,001, n = 5). Nenhuma diferença significativa foi encontrada em NO _x ^- e PO ₄ ^3- conteúdo entre as amostras coletadas em frascos reciclados e as amostras coletadas em vidro novofrascos (Figura 4).

Recolha de silicato e os procedimentos de armazenamento

Para determinar a melhor recipiente de amostragem para a análise de silicato, água bidestilada alta qualidade foi recolhido em (frascos de HDPE) não limpa e em tubos de polipropileno limpo de ácido (tubos PP), em frascos de polietileno de alta densidade feita de ácido, e em frascos de vidro de EPA. A concentração de silicato esperado era próximo de zero, então valores que desviaram a concentração esperado foram considerados contaminados. A concentração de silicato diferiram significativamente entre as amostras coletadas em diferentes frascos (ANOVA, F _(3,19) = 210,047, p <0,001), mostrando a menor concentração SiO ₄ nos frascos de PEAD limpa-ácidos. Frascos de vidro de borosilicato contaminado as amostras, com a concentração final SiO ₄ aumento de até 7 mol^L-1 (Figura 5).

Seleção de aparelho de filtração para a matéria orgânica dissolvida (MOD) e análise de nutrientes

Para determinar qual o aparelho de filtro produz o menor em branco na análise de orgânico dissolvido (DOC e DON) e nutrientes inorgânicos (NO _x ^-, NH ₄ ^+, PO ₄ ^{3-), os} suportes de filtro de aço inoxidável foram comparados com policarbonato em-linha Swinney suportes dos filtros. Com cada tipo de suporte de filtro testamos ambos membrana de policarbonato e pré-combustão filtro de fibra de vidro. A combinação de suporte de filtro de aço inoxidável e queimado filtro de fibra de vidro desde os menores espaços em branco, enquanto porta-filtro policarbonato Swinney equipado com membrana de policarbonato claramente contaminado as amostras em até 9 vezes. O aumento dos volumes de lavagem fez não resolver este problema (Figura 6).

Figura 3. concentração de amônio (mmol L ^-1, média ± SD) coletadas com frascos diferentes: (1) frasco HDPE contaminadas; (2) frasco HDPE Limpo; (3) frasco HDPE Limpo + Parafilm; (4) frasco de vidro EPA; (5) frasco de vidro EPA + Parafilm; (6) Limpo tubo PP. O parafilme foi colocado para testar se o septo de silicone podem contaminar as amostras de água. Para cada tratamento, foram analisados ​​9 amostras de alta qualidade de água destilada duas vezes. As amostras foram analisadas fresco. Foram encontradas diferenças significativas entre os quatro navios de amostragem (ANOVA, F _(5,53) = 7,183, p <0,001, teste de potência = 0,992). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5. concentração de silicato (mmol L ^-1, média ± SD) na alta qualidade de água bidestilada coletadas em frascos diferentes: tubos PP limpa-ácido, tubos PP, frascos de PEAD limpa-ácidos, novos frascos de vidro da EPA. Foram encontradas diferenças significativas entre os quatro materiais amostrador (ANOVA, F _(3,19) = 210,047, p <0,001, teste de potência = 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Examinando o efeito de diferentes conjuntos de filtração e lavar volumes em nitrito + nitrato (NO _x ^- mmol L ^-1). As amostras para NO _x ^- foram obtidos através da filtragem das amostras de água do mar com aço inoxidável (SS ftitular ILTER) ou policarbonato in-line porta-filtros Swinney (porta-filtro PC) equipado com uma membrana de policarbonato (filtro PC) ou um pré-combustão filtros de fibra de vidro. Para os filtros de PC, diferentes volumes (10, 30, 60, 90 e 120 mL) de HCl a 5% e de alta qualidade da água duplamente destilada foram usadas para lavar o conjunto do filtro, o volume de lavagem é dado entre parênteses na legenda da figura. Os valores são expressos como média ± desvio padrão (n = 5). A água do mar foi recolhido no Experimental Aquaria Zona do Instituto de Ciência Marinha e as amostras foram analisadas fresco após a filtração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Exemplo de resultados experimentais: inalado (IN, pretoconcentrações das amostras de água círculo) e exalados (EX, triângulo vermelho) emparelhado (mmol L ^-1) de diferentes substâncias processadas pela esponja Chondrosia reniformis no mar Mediterrâneo: (A) amónio _(NH4 ^+); (B) + nitrito de nitrato (NOx ^-); (C) fosfato (PO ₄ ^3-); (D) de silicato (SiO _4); (E) de carbono orgânico dissolvido (DOC); (F) dissolvido nitrogênio orgânico (DON); (G) carbono orgânico planctônicas (LPOC); (H) nitrogênio orgânico planctônicas (LPON). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. Um exemplo de um fluxo cytometry análise de amostras de água emparelhados retiradas da água inalado (A, C, E, G) e exalado (B, D, F, H), mediante a esponja Chondrosia reniformis: (A, B, C, D) populações de fitoplânctons; (E, F, G, H) bactérias heterotróficas. Em AB e EF a amostragem foi limpo e preciso (todos os grupos planctônicos foram eficientemente retidos). CD e GH são exemplos de contaminação da água exalado, mostrando baixa remoção de todos os grupos planctônicos. Syn:. Synechococcus sp, pico: picoeukariotes autotróficos, nano: nanoeukaryotes autotróficos, alta: bactérias heterotróficas com alto teor de DNA, baixa:. Bactérias heterotróficas com baixo teor de DNA Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figur suplementare 1. celular eficiência de retenção de diferentes presas planctônicas pela clam Chama pacifica: Prochlorococcus sp. (Pro), Synechococcus sp. (SYN), pico-eucariontes (Pico EUK), nano-eucariontes (Nano EUK). As barras de erro = IC 95%. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

Suplementar vídeo 1. A amostragem da ascídia Polycarpa mytiligera usando um manipulador custom-built com o código de cores usado verde para inalado e amarelo para amostras de água no ar exalado. Tubos de ensaio (PEEK, ID 54 mm, 75 cm de comprimento) são cuidadosamente colocados nas exhalant e inalantes sifões da ascídia. A água é de colhidas em tubos evacuados a uma taxa de ~ 1 ml min ^-1. Nesta demonstração fluoresceína corante é usado para visualizar a jacto exhalant. Note-se que o tubo de amostragem é colocado exhalant Wi bemdiluir o jet exhalant. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

etapas preparatórias

Frascos de colector para os DOM e análise de nutrientes

Uma vez que os navios de colector podem interagir com micro-constituintes dissolvidos e as paredes do amostrador pode ser um substrato para as bactérias de crescimento ^30-34, diferentes frascos de DOM e recolha de nutrientes foram testados. Borosilicato não é recomendado para a quantificação de sílica ^33,35, uma vez que as garrafas de vidro podem aumentar a concentração inicial de sílica por duas vezes até se as amostras não são rapidamente congeladas ^30. Nossos resultados demonstram que o uso de frascos pré-limpas EPA resulta em espaços de baixa concentração para DOC, DON, e nutrientes inorgânicos, principalmente para amónio.

Filtração e armazenamento de DOC

A filtração é um necessária e, em muitos casos, é a primeira etapa em química analítica e marinhomicrobiologia. Embora seja possível filtrar as amostras após a coleta no laboratório, este procedimento não é recomendado para in situ de trabalho, onde as amostras são coletadas subaquática, muitas vezes em locais remotos, horas ou dias longe de instalações laboratoriais adequadas. O uso de-linha em, na filtração in situ minimiza o manuseamento da amostra e, assim reduz o risco de contaminação. Na filtração situ também remove a maior parte das bactérias e reduz o risco de que a composição da amostra irá ser alterada pelo metabolismo das bactérias durante a colheita prolongado e transporte Tempo. O conjunto de filtração aumenta o volume morto do dispositivo de amostragem e pode também ser uma fonte de contaminação. Uma selecção dos menores possível detentores de filtro (por exemplo, em linha Swinney suporte de filtro de 13 mm) e a tubagem de PEEK minutos (por exemplo, 254 pM ID) reduz o volume morto e o risco de contaminação por água ambiente.

Se o filtro adequado não éusado ou se ele não é lavado com cuidado, artefatos e contaminação das amostras de água são susceptíveis de ocorrer ^32,36-39. Estudos de análise DOC mostrou que filtros e suportes de filtros feitos de compostos orgânicos (policarbonato e PFA-PTFE) pode resultar na contaminação DOC grave ^32,37, especialmente quando não bem limpa com alta qualidade de água bidestilada ^38. O presente protocolo e os resultados siga estas orientações e também indicam que suportes de filtros de policarbonato devem ser evitados.

No trabalho situ e interoperação

O sistema VacuSIP é uma técnica de amostragem directa que facilita o estudo do metabolismo dos alimentadores de suspensão não perturbadas no seu ambiente natural e a quantificação do seu papel no sistema ecológico. Para mergulhadores experientes e equipados, a aplicação do método VacuSIP é simples e requer apenas curtos training. Experimentos Inex VacuSIP são projetados para uma "análise estatística-design within' (ou seja, a análise de medida emparelhado ou repetida), portanto, o controle para a maioria dos artefatos analíticos, incluindo altos espaços em branco. O uso de sucção controlada garante taxas de amostragem lenta e ajustáveis, evitando assim a contaminação acidental da água exalou com água ambiente. Sempre que possível, a selecção de locais de trabalho com baixa turbidez atual e baixa é recomendado e irá garantir resultados mais limpas e mais precisos. O tempo de amostragem prolongada (minutos a horas) permite a integração da alta patchiness que caracteriza a camada limite bentônica. Todas estas características asseguram que, quando devidamente aplicado o método VacuSIP é altamente robusto, proporcionando resultados confiáveis ​​e reprodutíveis, mesmo quando se trabalha com um pequeno número de repetições. Um exemplo dos resultados típicos obtidos a partir de uma esponja do Mediterrâneo e espécies de moluscos Indo-Pacífico é mostrado na Figura 7 e supletary Figura 1.

Como acontece com qualquer técnica, o VacuSIP não está livre de armadilhas potenciais. O problema mais comum é a contaminação da amostra de água exalado com água ambiente. As razões para estes artefatos incluem alta taxa de sucção, dislodgments tubo e comportamento animal. A seleção adequada da taxa de amostragem correcta depender de estimativas anteriores da velocidade de fluxo excurrent. Estas estimativas podem ser obtidos usando o método de velocidade corante frontal ^16. Idealmente, a taxa de aspiração deve ser mantida abaixo de 1% da taxa de bombeamento (por exemplo, 1 ml min ^-1 para uma G 6 horas ^-1 taxa de bombeamento). Para evitar a contaminação com a água do ambiente, taxa de amostragem não deve ser maior do que 10% da taxa de bombagem.

Para controlar a taxa de amostragem, o comprimento eo diâmetro interno do tubo de admissão deve ser ajustada de acordo com a profundidade de trabalho planejado e temperatura da água. A Lei de Poiseuille (ver secção 1.3.1 acima) pode ser utilizado como um guia. No entanto, esta equação deve ser considerada como uma aproximação de primeira ordem desde o AP e diminuição da taxa de amostragem ao longo do tempo de amostragem e em da linha de filtração adiciona incertezas. A utilização de recipientes de vácuo, por vezes com pressões de vácuo desconhecidos, introduz complicações posteriores. Um exemplo de como as taxas de amostragem varia em função de diferentes recipientes de vácuo com vácuo diferente, é mostrada na Tabela 1.

Reduzir a taxa de amostragem é facilmente conseguido ajustando o comprimento do tubo e ID, sem limitações técnicas para essa redução (taxas de amostragem de alguns microlitros por hora são viáveis). No entanto, os experimentadores devem estar cientes da taxa de amostragem lenta ditada por esta limitação para animais com taxa de bombeamento lento e de pequenos organismos ou espécimes. A implicação imediata da taxa de amostragem lenta é o volume limitado de água que podem ser recolhidos durante uma única Sessi amostragemem. Este baixo volume de limitar o número de repetições e análises que podem ser executados com estas amostras, e, assim, também limitam a informação que pode ser obtida a partir destas populações.

dislodgement tubo pode ser facilmente detectada e amostragem pode ser abortada ou reiniciado, desde que um mergulhador está mantendo vigilância constante. Em contraste, cessação de bombagem durante a amostragem nem sempre é fácil de detectar. Isto é verdade não só para esponjas, mas também para tunicados, bivalves, e poliquetas. Na verdade, ao contrário da crença comum, os eventos em que um ascidian ou um bivalve parou de bombear foram documentados, sem qualquer alteração visível na geometria sifão (Yahel, dados não publicados). Além disso, em alguns casos, pode manter tunicados bombagem activa sem secreção de malha (isto é, não está a ter lugar a filtração).

Controlando a taxa de amostragem é crítica. A este respeito o VacuSIP é melhor do que outros métodos, especialmente quando os animais em estudo são relativEly pequena ou quando eles lentamente bomba. Seringas são particularmente difíceis de controlar ^2. Por exemplo, Perea-Blazquez e colegas (2012a) ⁴⁰ utilizado uma seringa para provar a água exalado por várias espécies de esponjas temperado e surpreendentemente não encontrou um padrão geral de ingestão / excreção de nutrientes específicos (NO ₂ ^-, NO ₃ ^-, NH ₄ ^+, PO ₄ ^3-, SiO _4). A falta de um padrão claro é provavelmente um resultado de contaminação das amostras de ar exalado com água do ambiente devido ao uso de uma seringa. A contaminação é evidente a partir da eficiência extremamente baixa retenção de plâncton Pico relatado por Perea-Blázquez e colegas (2012b) ⁴¹ para as esponjas: 40 ± 14% das bactérias heterotróficas e 54 ± 18% de Synechococcus sp. Para comparação, usando o VacuSIP, Mueller et ai. (2014) ²¹ relataram uma eficiência de remoção de bactérias heterotróficas de72 ± 15% em Siphonodictyon sp. e 87 ± 10% em Cliona delitrix.

Para verificar a qualidade da amostra e assegurar que nenhuma contaminação da água do ambiente ocorre, recomendamos que primeiro analisar as amostras de pico e plâncton nano utilizando citometria de fluxo. Esta análise rápida, confiável e barato irá fornecer informação imediata da qualidade da amostra. É muito comum para alguns taxa presas, como Synechococcus sp. para ser removido em cerca de 90% de eficiência ^14,42 por esponjas e ascídias. Desvios significativos deste valor de referência sugerem que a contaminação pode ter ocorrido (Figura 8).

Para a amostragem confiável e limpo, certifique-se o experimento satisfaz projeto sete regras simples: (1) realizar um levantamento preliminar (incluindo bombeamento estimativas de taxa) e preparar o local de trabalho bem; (2) conhecer os animais estudados; (3) verificar que o espécime estudado tem uma abertura excurrent bem definida umand local acessível; (4) verificar que o espécime estudado está bombeando antes e depois de cada coleta de amostra; (5) colocar o tubo para a recolha da água exalado ligeiramente dentro da abertura excurrent (Figura 1); (6) utilizar taxa de amostragem <10% da taxa de fluxo excurrente, 1% é altamente recomendada; (7) definir um critério de qualidade e omitir suspeitos pares Inex.

Seguindo estas regras simples, o sistema VacuSIP oferece um método prático e confiável de medir partículas processo de alimentadores de suspensão como ativo e compostos dissolvidos em condições naturais, permitindo estimativas precisas e comparáveis ​​que podem ser usados ​​para avaliar o papel funcional dos alimentadores do filtro em diferentes ecossistemas ao redor o mundo.

The authors have nothing to disclose.

Agradecemos Manel Bolivar por sua ajuda no trabalho de campo. Somos gratos ao "Parc Natural del Montgrí, les Illes Medes i el Baix Ter" por seu apoio às nossas pesquisas e amostragem permissões. O manipulador submarino foi projetado por Ayelet Dadon-Pilosof e fabricado pelo Sr. Pilosof. Este trabalho foi apoiado pelo projecto Governo espanhol CSI-Coral [número de concessão CGL2013-43106-R para RC e MR] e por uma bolsa FPU do "Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD)" a TM. Esta é uma contribuição do Biogeoquímica Marinha e grupo Pesquisa em Mudanças Globais financiado pelo Governo Catalão [número de concessão 2014SGR1029] e ISF concessão 1280/13 e BSF concessão 2.012.089 para G. Yahel.