Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

Este protocolo descreve a quantificação rápida e altamente sensível dos dados do sensor Förster transferência de energia de ressonância (FRET), usando um analisador de FRET portáteis feitos sob medida. O dispositivo foi utilizado para detectar a maltose dentro de uma gama de temperatura crítica que maximiza a sensibilidade de detecção, permitindo a avaliação prática e eficiente do teor de açúcar.

As recentes melhorias no Förster transferência de energia de ressonância (FRET) sensores permitiram a sua utilização para detectar várias moléculas pequenas, incluindo íons e aminoácidos. No entanto, a fraca intensidade do sinal dos sensores de FRET inato é um grande desafio que impede a sua aplicação em vários campos e torna o uso de caro, de ponta fluorómetros necessário. Anteriormente, nós construímos, um analisador de FRET relação custo-benefício de alto desempenho que podem especificamente medir a razão de duas bandas de comprimento de onda de emissão (530 e 480 nm) para alcançar alta sensibilidade de detecção. Mais recentemente, descobriu-se que os sensores traste com proteínas de ligação periplasmática bacteriana detectar ligandos com a máxima sensibilidade na gama da temperatura crítica de 50 - 55 ° C. Este relatório descreve um protocolo para avaliar teor de açúcar em amostras de bebidas disponíveis comercialmente usando o nosso analisador FRET portátil com um sensor de FRET específicas de temperatura. Os nossos resultados mostraram que o pré-aquecimento adicionaldo processo do sensor de FRET aumenta significativamente a relação sinal de FRET, para permitir uma medição mais precisa do teor de açúcar. O analisador e o sensor de FRET feito por encomenda foram aplicadas com sucesso para quantificar o teor de açúcar, em três tipos de bebidas comerciais. Prevemos que reforçar ainda mais a redução de tamanho e desempenho do equipamento vai facilitar o uso de analisadores portáteis em ambientes onde o equipamento high-end não está disponível.

Förster transferência de energia de ressonância (FRET) tem sido amplamente utilizado como um sensor biométrico para detectar pequenas moléculas tais como os açúcares, os iões de cálcio, e os aminoácidos ^1-4. biossensores FRET contêm proteínas fluorescentes, proteínas fluorescentes ciano (CFP) e proteínas fluorescentes amarelas (YFPs), que estão fundidos a ambas as extremidades de proteínas de ligação a periplásmicas (PBPs). Açúcares se ligar a PBP situadas no meio do sensor de FRET, causando alterações estruturais do sensor que, posteriormente, alterar a orientação e a distância transição dipolo das duas proteínas fluorescentes em cada extremidade da PLP. Esta alteração permite uma análise quantitativa do teor de açúcar através da medição da razão entre os comprimentos de onda de emissão de EYFP (530 nm) e ECFP (480 nm). Devido à alta sensibilidade, especificidade, capacidade de monitoramento em tempo real e tempo de resposta rápido de biossensores preocupe, esses sensores são amplamente utilizados em aplicações ambientais, industriais e médicos ^5. Além disso, Raciommedição etric utilizando biossensores FRET tem benefícios práticos importantes, uma vez que pode ser utilizada para medir componentes em amostras biológicas complexas, em que a concentração do sensor não pode ser facilmente controlada e a fluorescência de fundo está sempre presente.

Apesar destas vantagens dos sensores baseados em FRET para visualização quantitativa, pequenas mudanças estruturais com domínio incompleta movimento de transferência para as proteínas fluorescentes produzem inerentemente fraca intensidade do sinal. Este sinal fraco limita a aplicação de sensores baseados em FRET para in vitro ou in vivo na análise ^6. Consequentemente, a maioria FRET biossensores exigir a utilização de equipamento dispendioso e altamente sensível. Anteriormente, foi desenvolvido um analisador de FRET barato e portátil, com capacidades semelhantes às dos analisadores de fluorescência ⁷ existentes. Neste dispositivo, de baixo custo 405 nm ultravioleta banda-díodo emissor de luz (LED), foi usada como fonte de luz para excitação de causar thsinal de fluorescência e, a substituição de uma lâmpada ou laser caro. O sistema de detecção do analisador concentra-se eficientemente a dissipação de sinal de fluorescência em dois fotodetectores com um fotodiodo de silício. Num estudo mais recente, que mostrou que a optimização da temperatura de detecção, a 50 - 55 ° C poderia aumentar significativamente o sinal FRET raciométrica ^8. Este aumento do sinal específico da temperatura, juntamente com o analisador de FRET feito por medida, permite o uso de sensores de FRET em aplicações de diagnóstico mais gerais com sensibilidade elevada e rápida.

Neste protocolo, demonstramos a aplicabilidade geral do analisador FRET em condições ideais de temperatura FRET por meio da quantificação do teor de açúcar das bebidas disponíveis comercialmente. Este protocolo fornece os detalhes do funcionamento do dispositivo de FRET, bem como uma breve descrição do sensor e a preparação da amostra. Prevemos que este relatório irá promover a aplicação potencial do portátilanalisador em ambientes de laboratório de pequena escala e fornecer uma base para o desenvolvimento de um dispositivo de baixo custo no local de diagnóstico com biosensores baseados em FRET.

1. Preparação de Biosensor

1. Construir o plasmídeo pET21a (+) - PCP-MBP-YFP-His6, seguindo o protocolo estabelecido ^{anteriormente-2.}
2. Inocular 5 ml de caldo Luria (LB) com uma única colónia de uma estirpe de Escherichia coli DE3 e incubar a 37 ° C durante 16 horas com agitação.
3. Transferir 1 ml da cultura D / N para um balão de 500 ml contendo 100 ml de LB e incubar a 37 ° C num incubador com agitação, até a densidade óptica a 600 nm (DO ₆₀₀₎ atingir de 0,5 (cerca de 3 h).
4. Colher as células num tubo cónico de 50 ml por centrifugação a 1000 × g durante 20 min a 4 ° C.
5. Ressuspender o sedimento rapidamente em cada tubo com 50 ml de água gelada destilada (DW) e centrifugar a 1000 × g durante 20 min a 4 ° C.
6. Ressuspender o sedimento em 50 ul de DW gelada com 10% (v / v) de glicerol por agitação suave até que a solução (células electrocompetentes) atinge uma _DO600 de 100.
7. Coloque a mistura de células electrocompetentes (50 ul de células a um OD ₆₀₀ de 100) e 10 ng do plasmídeo pET21a (+) - PCP-MBP-YFP-His6 num electroporação cuvete arrefecida com gelo em um dispositivo de electroporação e electroporar a mistura (18 kV / cm, 25 uF).
8. Rapidamente adicionar 1 ml de meio SOC para a cuvete e ressuspender as células suavemente, seguindo-se a recuperação a 37 ° C durante 1 h com agitação suave, em um tubo de 15 ml de fundo redondo.
9. Espalhe as células em uma placa de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina e incubar a 37 ° C durante 12 h.
10. Isolar uma única colónia utilizando uma ansa e inocular a colónia em 10 ml de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina a 37 ° C num agitador durante 12 h.
11. Adicionam-se 5 ml da cultura de sementeira para 500 ml de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina e incubar a cultura num incubador com agitação a 37 ° C.
12. Adicionar 0,5 mM de isopropil-d β-tiogalactósido (IPTG), quando a _DO600 atinge0,5 e incuba-se a cultura numa incubadora com agitação a 37 ° C durante 24 h.
13. Centrifugar as células a 4500 × g durante 20 minutos (4 ° C) e suavemente remover o sobrenadante.
14. Ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão de ligação (Tris-HCl a 20, pH 8,0, PMSF 1 mM, EDTA 0,5 mM e DTT 1 mM).
15. Sonicate as células no gelo com seis rajadas de 10 seg a 200-300 W, seguindo cada rajada com 10 segundos de resfriamento.
16. Centrifuga-se o lisado a 10.000 × g durante 30 min a 4 ° C para sedimentar os detritos celulares. Transferir o sobrenadante (proteína solúvel) em um novo tubo de recolha.
17. Para conseguir a purificação por afinidade das proteínas do sensor de FRET, carga de 4 ml do lisado celular foi afastada numa coluna de afinidade de Ni-NTA (volume de 5 ml) e realizar um ensaio de cromatograf ia usando cromatograf ia líquida rápida de proteína (FPLC) ^18.
18. Lava-se a coluna uma vez com cinco volumes de coluna de tampão de lavagem I (tampão fosfato 50 mM, cloreto de sódio 300 mM, imidazol 10 mM, pH 7,0).
19. Repetir o passo de lavagem com cinco volumes de coluna de tampão de lavagem II (tampão fosfato 50 mM, cloreto de sódio 300 mM, imidazole 20 mM, pH 7,0).
20. Eluir a proteína sensor com cinco volumes de coluna de tampão de eluição (tampão fosfato 50 mM, cloreto de sódio 300 mM, imidazol 500 mM, pH 7,0).
21. Para concentrar e dessalinizar a amostra eluída, encher concentrador (tamanho da membrana de 10.000 MW) com um máximo de 20 ml de amostra e centrifuga-se durante 10 min a 3000 x g. Recarga concentrador com solução salina a 0,8% tamponada com fosfato (PBS). Repetir este passo duas vezes, em primeiro lugar enchendo o concentrador com 20 ml de amostra, e, em seguida, reenchimento com PBS.
22. Recuperar a proteína sensor de concentrado e salgado-de e armazená-lo a -80 ° C.

2. Medição de conteúdo de açúcar usando o Analisador de FRET

NOTA: Os detalhes da construção FRET analisador foram descritos no nosso trabalho anterior ^7.

1. Prepara-se uma solução de detecção de 0,8% de PBS contendo 0,2uM das proteínas do sensor.
2. Ligue o analisador de FRET. Pressione o botão "UP" durante 2 segundos para calibrar a temperatura ideal. Ajuste a temperatura para 53 ° C usando as "Up" e botões "DOWN" e pressione o botão "SET".
3. Para a calibração, pressione e segure o "UP" e os botões "DOWN" simultaneamente por 2 segundos. Confirmar que o painel LED exibe "CALIB" e pressione o botão "SET".
4. Coloque um 12,5 × 12,5 × 45 mm (comprimento x largura x altura) navio paralelepípedo rectangular (tina) contendo apenas tampão PBS em um suporte de cuvete do analisador e pressione o botão "SET".
5. Substitua a tina com um contendo apenas a solução de detecção (ver 2.1), sem açúcar (maltose / sucrose) e pressione o botão "SET" para calibrar a linha de base.
6. Substitua a tina com um contendo a solução de detecção com açúcar 10 mM e pressione o botão "SET"botão.
7. Para determinar o conteúdo de açúcar de uma amostra de bebida, colocar uma amostra de bebida ml num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugar a 16000 x g durante 1 min.
   NOTA: A medição de fluorescência baseado em sensor de FRET tem a vantagem de não exigir pré-tratamento especial da amostra, porque apenas 1% (v / v) da amostra está incluído no volume total. No entanto, recomendamos a remoção de qualquer material que possa afetar a medição de fluorescência (por exemplo, células, partículas insolúveis, lipídios, gordura, ou qualquer material com autofluorescência). Além disso, se um ácido forte, base forte, agente de limpeza (detergente), ou um agente emulsionante (emulsionante) está presente a uma concentração mais elevada e pode afectar as propriedades do sensor biológico FRET, ela deve ser removida usando um solvente orgânico ou numa neutralizador. Por exemplo, quando a gordura do leite e os emulsionantes são eliminados lanches congeladas, as amostras são centrifugadas num tubo de microcentrifuga a 16000 × g durante 30 min, e o líquido entrn o sedimento de fundo e a camada superior de gordura do leite é extraído. Uma quantidade igual de hexano, em seguida, é adicionado, seguido por centrifugação a 15.000 x g durante 30 min para eliminar os lípidos.
8. Remover o sobrenadante com uma seringa de 1-ml e filtrar através de um filtro de seringa (tamanho de poro de 0,2 um).
9. Colocar 0,1 mL da amostra filtrada bebida num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 0,9 ml de PBS e agitar com vortex suavemente.
   NOTA: É crítico para diluir a amostra de bebida adequada. Neste caso, a diluição de 1000 vezes foi executada de modo a que a concentração de açúcar cairia dentro da gama dinâmica do dispositivo. Recomendamos estimar a concentração de açúcar meta antecipadamente, referindo-se o teor de açúcar no rótulo da bebida.
10. Adicionam-se 5 ul da amostra de bebida diluída (1%, v / v) a uma cuvete contendo 0,495 ml da solução de detecção.
11. Coloque a cuvete num suporte da cuveta de o analisador de FRET e pré-aquecer a solução de amostra a 53 ° C.
12. Pressione o botão "SET" para medir o teor de açúcar.
    Nota É possível avaliar a medição de FRET utilizando um leitor de placas multilabel ou um espectrofotómetro de fluorescência equipado com um dispositivo de Peltier para controle de temperatura através da leitura da relação de 488/535 nm ^{de 7,8.} Para a detecção de sacarose, siga os passos 1,1-2,12 com um sensor de CSY-LH ^2.

Para realizar a análise quantitativa do conteúdo de açúcar usando o analisador de FRET, que é necessário para construir uma curva ajustada a estimativa da concentração de açúcares alvo a partir da razão observada FRET. Seja r definir a razão entre a intensidade de emissão de PCP a 480 nm e a intensidade de emissão de YFP gerado a 530 nm (Eq. 1).

A curva de dose-resposta do biossensor FRET (CMY-BII a 53 ° C) pode ser gerado através da observação da proporção de FRET, R, em diferentes concentrações de açúcar. A curva pode então ser expressa como uma curva sigmoidal em forma de S, como se segue:

onde r _max e r _min representar a relação sinal com concentrações de açúcar de 0 e saturada (1.000 mm), respectivamente; x ₀ representa a concentração de açúcar na resposta de 50%; e o símbolo p representa o declive da resposta, o que é próximo de 1 ou -1. No presente estudo, _rmax, R _min, x _0, e p são 4,256, 2,672, 71,779, e 1, respectivamente. O intervalo de concentração de 1 uM a 1000 uM foi utilizado no modelo de ajustamento.

Usando Equações 1 e 2, o teor de açúcar de bebidas disponível no mercado foi quantificada com o analisador de FRET. Dois sensores de FRET maltose foram examinados para testar o sinal, R, dependendo de várias temperaturas ^2,8. O primeiro sensor de FRET, CMY-0, é um sensor de base à base de FRET consistindo de PCP, proteína de ligação a maltose (MBP), e YFP, com no peptídeos vinculador. O segundo sensor, o CMY-BII, tem um ligante Ser-Arg entre MBP e as duas proteínas de fluorescência ^2. Como mostra a Figura 1A, CMY-0 não é observada a temperaturas de medição abaixo de 50 ° C, como não há nenhuma diferença de sinal entre 0 e 1 mM de concentração de maltose. As diferenças de sinal de ambos os sensores foram maximizadas FRET entre 50 e 55 ° C (Figura 1) ^8. A fim de quantificar o teor de açúcar dos três tipos de bebidas disponíveis comercialmente, uma curva dose-resposta do sensor de CMY-BII a 53- ° C foi gerado (Figura 2A) e o teor de maltose das três amostras foi identificado pela convertendo o rácio de FRET para a concentração de maltose.

Como amostra A é feita de grãos, como arroz e cevada, que são fontes de maltose importantes, era esperado que a amostra para conter conteúdo relativamente alto de maltose (média de 11.892 g / 235 ml) ( Figura 2A). Em contraste, a amostra C é uma bebida desportiva, que teve a mais baixa de maltose (0,29 g / 250 ml) entre as três bebidas. Estes resultados sugerem que o analisador de FRET pode ser utilizado a temperaturas óptimas para maximizar a quantificação do teor de açúcar, eliminando a necessidade de um dispositivo de detecção de alta-FRET final caro.

Figura 1. A diferença de sinal de FRET entre 0 e 1 mM de maltose utilizando o Analisador de FRET a várias temperaturas. (A) O sensor de CMY-0 mostrou nenhuma diferença de sinal em diferentes concentrações de maltose a temperaturas inferiores a 50 ° C. (B) O CMY-BII Sensor foi capaz de distinguir a diferença entre o sinal de FRET maltose 0 e 1 mM em uma ampla gama de temperaturas. Em ambos os casos, o sinal de diferença aumentou dramaticamente num intervalo específico de temperatura (50 - 55 ° C). o ebares rror representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. A maltose Quantificação conteúdo em três bebidas. (A) A curva dose-resposta comercialmente disponível para CMY-BII. (B) o conteúdo de maltose de três amostras de bebidas foi quantificada. Note-se que "açúcar total" indica a quantidade de todos os açúcares (incluindo a maltose) relatado pelo fabricante de bebidas no rótulo bebida. A barra de erro indica o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo permite a quantificação rápida e eficiente do teor de açúcar em amostras de bebidas, utilizando um feito por medida de FRET analisador de ⁷ a uma temperatura óptima para sensores de FRET. O analisador foi projetado com um recém-desenvolvido, barato banda de 405 nm de ultravioleta do LED como fonte de luz e dois fotodetectores com um fotodiodo de silício. Este dispositivo é mais rentável do que outras fluorímetros comparáveis. O dispositivo mostrou alta sensibilidade de detecção, especialmente quando se mede a proporção de duas bandas de comprimento de onda de emissão (530 nm e 480 nm) em uma faixa de temperatura ideal para sensores traste. A sua sensibilidade e a intensidade na detecção de vários açúcares foram superiores às de um dispositivo de fluorescência espectrofotómetro ^7.

O principal objectivo deste protocolo é apoiar a ampla aplicabilidade dos sensores baseados em traste com o analisador de FRET feitos sob medida. Enquanto o analisador mede indiretamente teor de açúcar através de sensores preocupe, it é claro que o dispositivo inclui um certo número de benefícios os sensores de FRET, incluindo amplamente extensível especificidade geneticamente modificada ligando, desenho modular, independente da concentração sinais do sensor, e uma segmentação precisa de pequenas moléculas subcelulares. Sensores de FRET são efectivamente utilizados para detectar uma grande variedade de pequenas moléculas, incluindo iões de ^{9, 10,} heme e outros. Além disso, mais de 20 tipos de construções de FRET pode ser facilmente encontrado e ordenou através do depositário sem fins lucrativos AddGene ^11.

Apesar da ampla aplicabilidade do analisador de FRET, há dois problemas principais com o funcionamento do dispositivo. Em primeiro lugar, porque o funcionamento do dispositivo é relativamente simples, o pré-processamento da amostra é o passo crítico que afecta a qualidade da detecção, salvo em caso de mau funcionamento do dispositivo. Neste protocolo, a um passo (diluição da amostra) foi suficiente para processar amostras líquidas que foram claramente transparente e não continha nenhuma parti insolúvelCles. No entanto, outras amostras podem requerer um processamento adicional para remover os materiais insolúveis, tais como componentes celulares ou de lípidos. Quaisquer partículas autofluorescentes que podem afectar o sinal de FRET também devem ser removidos, como observado a seguir ao Passo 2.7. Em segundo lugar, controle de qualidade e conectividade interface com sistemas de informação hospitalar precisam ser abordadas, como com todos os tipos de testes point-of-care (POCT) ferramentas ^12. Uma vez que a qualidade do sinal do analisador de FRET depende em grande parte a qualidade do sensor de FRET e nas etapas de pré-processamento, controlos de qualidade regulares são necessárias para assegurar que as medições se mantenham dentro do alcance do sinal padrão para a análise de dados de controlo de qualidade regular. O período de estabilidade e armazenamento do sensor de FRET, ambas as quais são essenciais para outras aplicações confiáveis, devem ser investigados durante as verificações de controle de qualidade. Criação de diretrizes e desenvolvimento de software adequado também pode resolver a limitação de conectividade. As versões atuais doanalisador de FRET são equipados com conectividade RS232 para controle de linha de comando remoto, mas a comunicação sem fio pode ser uma característica da próxima versão do analisador, que terá uma interface melhorada para sistemas de informação hospitalar.

No entanto, os sensores de FRET foram projetados para especificidade de substrato, uma abordagem que normalmente permite especificidade mais ampla ^2. Por conseguinte, o sinal de FRET pode encontrar interferência indesejada a partir de outros ingredientes, incluindo outros tipos de açúcares em bebidas comerciais. Novas investigações devem explorar como sensores FRET responder a várias misturas de açúcar para quantificar com precisão a quantidade de açúcar. A colaboração com empresas que produzem as bebidas vão ajudar a confirmar o teor de açúcar para calibrar do analisador de FRET.

Prevê-se que o dispositivo portátil de FRET proposto com vários sensores FRET vai ser utilizado em aplicações POCT. POCT é utilizada para avaliar a gravidez, sangueos níveis de glucose, proteínas de biomarcadores, bactérias infecciosas, vírus infecciosos e. métodos POCT têm tempos de resposta rápidos e geralmente exibem baixas taxas de erro, devido ao pequeno número de etapas de processamento. Estas são vantagens importantes do POCT sobre a abordagem central de testes de laboratório. dispositivos POCT portátil de mão, tais como o dispositivo aqui descrito, têm atraído cada vez mais atenção por causa de suas aplicações potenciais em avaliação de alimentos e monitoramento de açúcar no sangue. Em particular, monitoramento de glicose de amostras de sangue em pacientes com diabetes requer um método POCT rápida, precisa e rentável ^13. Após a equipe de pesquisa Ames desenvolveu a primeira tira de teste de glicose no sangue em 1965 (usando uma faixa que contém glicose oxidase), várias tecnologias foram propostos para fins de monitoramento de glicose no sangue ^12. O analisador de FRET também está disponível para a detecção de glicose em amostras de sangue com o pré-processamento apropriado do sangue e protei periplasmáticas de ligação de glicoseN (MglB) ¹⁴ com base na proteína de FRET.

são necessários simples, métodos rápidos de avaliação de qualidade dos alimentos. O consumo de bebidas contendo açúcar está associada com uma variedade de doenças e síndromes, como índice de aumento da massa corporal durante a infância ^15, obesidade pediátrica ^16, e o risco de acidente vascular cerebral ^17. Compreender esta conexão requer uma medição precisa de componentes de açúcar em bebidas. Portanto, as concentrações de glicose e frutose de bebidas são de interesse para os cientistas preocupados com a saúde humana. Este protocolo demonstra o desempenho altamente sensível do analisador traste com um óptimo controlo da temperatura. O dispositivo pode ser usado com vários sensores de FRET para detectar vários pequenos molecules- incluindo glicose e frutose ^14,15. O nosso dispositivo portátil e recarregável, que tem uma vida de bateria de 10 - 20 horas, dependendo do protocolo de aquecimento, é aplicável para POCT. Sua mak protocolo operacional simpleses o dispositivo fácil de usar e elimina a necessidade de treinamento de pessoal complicada. Com melhorias técnicas, incluindo a redução do tamanho do equipamento, a minimização dos passos de pré-tratamento, e identificação de requisitos práticos para uso em campo, este dispositivo irá promover o desenvolvimento de pesquisa baseada em FRET em ambientes de laboratório de pequena escala.

Os autores não têm nada para revelar.

Esta pesquisa foi apoiada por doações do Centro de Biologia Sintética Inteligente de Projeto de fronteira global (2011-0031944) e do Programa de Iniciativa KRIBB Research.