Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET

Este protocolo describe la cuantificación rápida y altamente sensible de Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) datos de sensor utilizando un analizador de FRET portátil a medida. El dispositivo se utilizó para detectar la maltosa dentro de un rango de temperatura crítico que maximiza la sensibilidad de detección, lo que permite la evaluación práctica y eficiente de contenido de azúcar.

Las recientes mejoras en la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) sensores han permitido su uso para detectar varias moléculas pequeñas, incluyendo iones y aminoácidos. Sin embargo, la intensidad de señal débil innata de sensores FRET es un reto importante que impide su aplicación en diversos campos y hace que el uso de los caros, de alta gama fluorómetros necesario. Anteriormente, hemos construido un analizador de FRET de alto rendimiento rentable que puede medir específicamente la relación de dos bandas de longitud de onda de emisión (530 y 480 nm) para lograr una alta sensibilidad de detección. Más recientemente, se descubrió que los sensores FRET con las proteínas de unión periplásmicas bacterianas detectar ligandos con una sensibilidad máxima en el rango de temperatura crítica de 50 - 55 ° C. Este informe describe un protocolo para evaluar el contenido de azúcar en muestras de bebidas disponibles en el mercado utilizando nuestro analizador de FRET portátil con un sensor FRET-temperatura específica. Nuestros resultados mostraron que el precalentamiento adicionalproceso del sensor FRET aumenta significativamente la señal de relación de FRET, para permitir la medición más precisa de contenido de azúcar. El analizador y el sensor FRET medida se han aplicado con éxito para cuantificar el contenido de azúcar en tres tipos de bebidas comerciales. Anticipamos que mejora aún más la reducción del tamaño y el rendimiento de los equipos va a facilitar el uso de analizadores portátiles en entornos en los equipos de gama alta no está disponible.

Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) se ha utilizado ampliamente como un sensor biométrico para detectar moléculas pequeñas tales como azúcares, iones de calcio, y los aminoácidos ^1-4. biosensores FRET contienen proteínas fluorescentes, proteínas fluorescentes cian (CFP), y proteínas fluorescentes amarillas (YFPs), que están condensados ​​a ambos extremos de proteínas de unión periplásmicas (PBP). Los azúcares se unen a las PBP ubicadas en el medio del sensor FRET, causando cambios estructurales en el sensor que posteriormente altera la orientación y distancia de transición de dipolo de las dos proteínas fluorescentes en cada extremo de la PBP. Este cambio permite el análisis cuantitativo de contenido de azúcar mediante la medición de la relación de las longitudes de onda de emisión de EYFP (530 nm) y ECFP (480 nm). Debido a la alta sensibilidad, la especificidad, la capacidad de monitorización en tiempo real, y rápido tiempo de respuesta de los biosensores FRET, estos sensores son ampliamente utilizados en aplicaciones medioambientales, industriales, médicas y ^5. Por otra parte, ratiommedición etric utilizando biosensores FRET tiene importantes beneficios prácticos, ya que puede ser usado para medir componentes en muestras biológicas complejas en las que la concentración de sensor no se puede controlar fácilmente y la fluorescencia de fondo está siempre presente.

A pesar de estas ventajas de los sensores basados ​​en FRET para la visualización cuantitativa, los pequeños cambios estructurales con dominio incompleto de movimiento de transferencia de las proteínas fluorescentes producen una intensidad de señal inherentemente débil. Esta señal débil limita la aplicación de sensores basados en FRET para el análisis in vitro o in vivo en ^6. En consecuencia, la mayoría FRET biosensores requieren el uso de equipos costosos y altamente sensible. Anteriormente, hemos desarrollado un analizador de FRET barato y portátil con capacidades similares a las de los analizadores de fluorescencia existentes ^7. En este dispositivo, de bajo costo, de 405 nm banda ultravioleta diodo emisor de luz (LED) se utilizó como fuente de luz para provocar la excitación de THseñal de fluorescencia e, en sustitución de una lámpara o láser caro. El sistema de detección del analizador se centra de manera eficiente la señal de fluorescencia de disipación en dos fotodetectores con un fotodiodo de silicio. En un estudio más reciente, se demostró que la optimización de la detección de la temperatura a 50 - 55 ° C podría ampliar significativamente la señal de FRET radiométrica ^8. Esta mejora de la señal-temperatura específica, junto con el analizador de FRET a medida, permite el uso de sensores FRET en aplicaciones de diagnóstico más generales con la rápida y alta sensibilidad.

En este protocolo, hemos demostrado la aplicabilidad general del analizador de FRET en condiciones óptimas de temperatura FRET mediante la cuantificación del contenido de azúcar de las bebidas disponibles en el mercado. Este protocolo proporciona los detalles de la operación del dispositivo FRET, así como una breve descripción de sensor y preparación de la muestra. Anticipamos que este informe promueva la aplicación potencial de la portátilanalizador en entornos de laboratorio a pequeña escala y proporcionar una base para el desarrollo de un dispositivo de diagnóstico de bajo costo en el lugar con biosensores basados ​​en FRET.

1. Preparación de biosensor

1. Construir el plásmido pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6, siguiendo el protocolo establecido ^{previamente-2.}
2. Inocular 5 ml de caldo de Luria (LB) con una única colonia de una cepa de Escherichia coli DE3 y se incuba a 37 ° C durante 16 horas con agitación.
3. Transferencia de 1 ml de la cultura O / N en un matraz de 500 ml que contiene 100 ml de LB y se incuba a 37 ° C en una incubadora con agitación hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ alcanza 0,5 (aproximadamente 3 horas).
4. Recoger las células en un tubo cónico de 50 ml mediante centrifugación a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C.
5. Resuspender el precipitado rápidamente en cada tubo con agua 50 ml de hielo-fría destilada (DW) y se centrifuga a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C.
6. Resuspender el precipitado en 50 l de DW enfriado en hielo con 10% (v / v) de glicerol girando suavemente hasta que la solución (células electrocompetentes) alcanza una DO ₆₀₀ de 100.
7. Colocar la mezcla de células electrocompetentes (50 l de las células a una DO ₆₀₀ de 100) y 10 ng del plásmido pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 en una cubeta de electroporación enfriada con hielo en un dispositivo de electroporación y electroporar la mezcla (18 kV / cm, 25 mF).
8. Rápidamente añadir medio SOC 1 ml a la cubeta y volver a suspender las células suavemente, seguido de la recuperación a 37 ° C durante 1 hora con agitación suave en un tubo de 15 ml de fondo redondo.
9. Difundir las células en una placa de LB que contiene 100 mg / ml de ampicilina y se incuba a 37 ° C durante 12 horas.
10. Aislar una sola colonia utilizando un bucle e inocular la colonia en 10 ml de LB que contiene 100 mg de ampicilina / ml a 37 ° C en un agitador durante 12 hr.
11. Añadir 5 ml del cultivo de siembra a 500 ml de LB que contienen 100 mg / ml de ampicilina y se incuba el cultivo en una incubadora de agitación 37 ° C.
12. Añadir 0,5 mM isopropílico β-D-tiogalactósido (IPTG) cuando la OD ₆₀₀ alcances0,5 y se incuba el cultivo en un incubador con agitación 37 ° C durante 24 horas.
13. Centrifugar las células a 4500 × g durante 20 min (4 ° C) y eliminar cuidadosamente el sobrenadante.
14. Resuspender el precipitado en tampón 5 ml de unión (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, PMSF 1 mM, EDTA 0,5 mM, y DTT 1 mM).
15. Sonicar las células en hielo con seis ráfagas de 10 segundos a 200-300 W, después de cada ráfaga con 10 segundos de enfriamiento.
16. Se centrifuga el lisado a 10.000 × g durante 30 min a 4 ° C para sedimentar los restos celulares. Transferir el sobrenadante (proteínas solubles) en un nuevo tubo de recogida.
17. Para lograr la purificación por afinidad de las proteínas de sensores FRET, la carga 4 ml del lisado celular aclarado sobre una columna de afinidad Ni-NTA (volumen 5 ml) y llevar a cabo un ensayo de cromatografía usando cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) ^18.
18. Lavar la columna una vez con cinco volúmenes de columna de tampón de lavado I (tampón fosfato 50 mM, cloruro de sodio 300 mM, imidazol 10 mM, pH 7,0).
19. Repetir la etapa de lavado con cinco volúmenes de columna de tampón de lavado II (tampón fosfato 50 mM, cloruro de sodio 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,0).
20. Eluir la proteína sensor con cinco volúmenes de columna de tampón de elución (tampón fosfato 50 mM, cloruro de sodio 300 mM, imidazol 500 mM, pH 7,0).
21. Para concentrar y desalar la muestra eluida, llenar concentrador (tamaño de la membrana de 10.000 MW) con hasta 20 ml de la muestra y se centrifuga durante 10 min a 3.000 x g. Vuelva a llenar concentrador con solución salina tamponada con fosfato 0,8% (PBS). Repita este paso dos veces, primero llenar el concentrador con 20 ml de muestra, y luego volver a llenar con PBS.
22. Recuperar el sensor de proteína concentrada y salada de-y almacenarla a -80 ° C.

2. Medición del contenido de azúcar utilizando el Analizador de FRET

NOTA: Los detalles de la construcción analizador de FRET se describe en nuestros trabajos anteriores ^7.

1. Preparar una solución de detección de 0,8% de PBS que contenía 0,2M de las proteínas de los sensores.
2. Encienda el analizador de FRET. Presione el botón "UP" durante 2 segundos para calibrar la temperatura óptima. Ajuste la temperatura a 53 ° C usando los botones "UP" y "DOWN" y presione el botón "SET".
3. Para la calibración, pulse y mantenga pulsado el botón "DOWN", "arriba" y simultáneamente durante 2 seg. Confirmar que el panel de pantallas LED "CALIB" y presione el botón "SET".
4. Coloque un 12,5 × 12,5 × 45 que contiene solamente tampón PBS en un soporte de la cubeta del analizador y presione el botón "SET" mm (longitud x anchura x altura) recipiente de paralelepípedo rectangular (cubeta).
5. Vuelva a colocar la cubeta con una solución que contiene sólo la detección (ver 2.1) y sin azúcar (maltosa / sacarosa) y pulse el botón "SET" para calibrar la línea de base.
6. Vuelva a colocar la cubeta con una solución que contiene el azúcar de detección con 10 mM y pulse la tecla "SET"botón.
7. Para determinar el contenido de azúcar de una muestra de la bebida, se puso 1 ml de la muestra de bebida en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 16.000 xg durante 1 min.
   NOTA: la medición de fluorescencia basada en sensores FRET tiene la ventaja de no requerir un tratamiento previo especial de la muestra debido a que sólo 1% (v / v) de la muestra se incluye en el volumen total. Sin embargo, se recomienda eliminar cualquier material que pueda afectar a la medición de fluorescencia (por ejemplo, células, partículas insolubles, lípidos, grasas o cualquier material con autofluorescencia). Además, si un ácido fuerte, base fuerte, agente de limpieza (detergente), o un agente emulsionante (emulsionante) está presente en una alta concentración y puede afectar a las propiedades del sensor biológico FRET, se debe eliminar el uso de un disolvente orgánico o una neutralizador. Por ejemplo, cuando la grasa láctea y emulsionantes se eliminan de aperitivos congeladas, las muestras se centrifugaron en un tubo de microcentrífuga a 16.000 xg durante 30 min, y el líquido between el sedimento del fondo y la capa superior de grasa láctea se extrae. A continuación se añade una cantidad igual de hexano, seguido de centrifugación a 15.000 × g durante 30 min para eliminar los lípidos.
8. Eliminar el sobrenadante con una jeringuilla de 1 ml y filtrar a través de un filtro de jeringa (tamaño de poro 0,2 micras).
9. Colocar 0,1 ml de muestra filtrada bebida en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 0,9 ml de PBS y agitar suavemente.
   NOTA: Es fundamental para diluir la muestra de bebidas correctamente. En este caso, la dilución 1.000 veces se llevó a cabo de manera que la concentración de azúcar caería dentro del rango dinámico del dispositivo. Recomendamos la estimación de la concentración de azúcar de destino de antemano, haciendo referencia al contenido de azúcar en la etiqueta de la bebida.
10. Añadir 5 l de la muestra de bebida diluido (1%, v / v) a una cubeta que contiene 0,495 ml de la solución de detección.
11. Colocar la cubeta en un soporte de la cubeta del analizador de FRET y precalentar la solución de la muestra a 53 ° C.
12. Presione el botón "SET" para medir el contenido de azúcar.
    Nota Es posible evaluar la medición de FRET usando un lector de placas multietiqueta o un espectrofotómetro de fluorescencia equipado con un dispositivo Peltier para control de temperatura mediante la lectura de la relación a 488/535 nm ^7,8. Para la detección de sacarosa, siga los pasos de 1.1 a 2.12 un sensor CSY-LH ^2.

Para llevar a cabo el análisis cuantitativo de contenido de azúcar utilizando el analizador de FRET, es necesario construir una curva ajustada la estimación de la concentración de azúcar blanco a partir de la relación de FRET observada. Sea r definir la relación de la intensidad de emisión de CFP en 480 nm y la intensidad de emisión de YFP genera en 530 nm (Ec. 1).

La curva de dosis-respuesta del biosensor FRET (CMY-BII a 53 ° C) puede ser generado mediante la observación de la relación de FRET, r, a diferentes concentraciones de azúcar. La curva a continuación, se puede expresar como una curva sigmoidal en forma de S de la siguiente manera:

donde r r _max y _min representan la relación de la señal con la concentración de azúcar de 0 y saturado (1.000 M), respectivamente; x ₀ representa la concentración de azúcar en la respuesta del 50%; y p representa la pendiente de la respuesta, que es cerca de 1 o -1. En el presente estudio, r _{max, min} r, x _0, y p son 4.256, 2.672, 71.779, y 1, respectivamente. Se utilizó el intervalo de concentración de 1 M a 1,000 M en el modelo apropiado.

Utilizando las ecuaciones 1 y 2, el contenido de azúcar de bebidas disponibles comercialmente se cuantificó con el analizador de FRET. Dos sensores FRET maltosa se examinaron para comprobar la señal, r, dependiendo de diferentes temperaturas ^2,8. El primer sensor de FRET, CMY-0, es un sensor de base a base de FRET consiste en CFP, la proteína de unión a maltosa (MBP), y YFP, con no péptidos conectores. El segundo sensor, CMY-BII, tiene un enlazador Ser-Arg entre MBP y las dos proteínas de fluorescencia ^2. Como muestra la Figura 1A, no se observa CMY-0 a temperaturas de medición por debajo de 50 ° C, ya que no hay diferencia de señal entre 0 y 1 mM de concentración de maltosa. Las diferencias de señal de ambas FRET sensores se maximizaron entre 50 y 55 ° C (Figura 1) ^8. Con el fin de cuantificar el contenido de azúcar de los tres tipos de bebidas comercialmente disponibles, se generó una curva de dosis-respuesta del sensor CMY-BII a 53- ° C (Figura 2A) y el contenido de maltosa de las tres muestras fue identificado por convertir la relación de FRET en la concentración de maltosa.

Como muestra A está hecho de granos como el arroz y la cebada, que son importantes fuentes de maltosa, se esperaba que la muestra contiene relativamente alto contenido en maltosa (promedio de 11.892 g / 235 ml) ( Figura 2A). Por el contrario, la muestra C es una bebida deportiva que tenía la maltosa más baja (0,29 g / 250 ml) entre las tres bebidas. Estos resultados sugieren que el analizador de FRET se puede utilizar a temperaturas óptimas para maximizar la cuantificación de contenido de azúcar, eliminando la necesidad de un dispositivo de detección de FRET de gama alta caro.

Figura 1. Diferencia FRET señal entre 0 y 1 mM de maltosa utilizando el analizador de FRET a diversas temperaturas. (A) El sensor CMY-0 no mostró diferencia de señal a diferentes concentraciones de maltosa a temperaturas inferiores a 50 ° C. (B) El CMY-BII sensor fue capaz de distinguir la diferencia entre la señal de FRET maltosa 0 y 1 mM en una amplia gama de temperaturas. En ambos casos, la diferencia de la señal se incrementó dramáticamente en un rango específico de temperatura (50-55 ° C). el correobares RROR representan la desviación estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Cuantificación maltosa contenido en tres bebidas. (A) una curva de dosis-respuesta comercialmente disponible para CMY-BII. (B) contenido en maltosa de tres muestras de bebidas se cuantificó. Tenga en cuenta que "Azúcar total" indica la cantidad de todo el azúcar (incluyendo maltosa) reportado por el fabricante de bebidas en la etiqueta de la bebida. La barra de error indica la desviación estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este protocolo permite la cuantificación rápida y eficiente del contenido de azúcar en las muestras de bebidas, utilizando un analizador de FRET a medida ⁷ a una temperatura óptima para sensores FRET. El analizador se ha diseñado con un LED ultravioleta de bajo costo banda de 405 nm recientemente desarrollado como fuente de luz y dos fotodetectores con un fotodiodo de silicio. Este dispositivo es más rentable que otros fluorómetros comparables. El dispositivo mostró alta sensibilidad de detección, especialmente cuando la medición de la relación de dos bandas de longitud de onda de emisión (530 nm y 480 nm) en un intervalo óptimo de temperatura para los sensores FRET. Su sensibilidad y la intensidad en la detección de varios azúcares fueron superiores a las de un dispositivo de espectrofotómetro de fluorescencia ^7.

El principal objetivo de este protocolo es apoyar la amplia aplicabilidad de los sensores basados ​​en FRET con el analizador de FRET a medida. Mientras que el analizador mide indirectamente el contenido de azúcar a través de sensores FRET, it es claro que el dispositivo incorpora una serie de los beneficios de los sensores FRET, incluyendo ampliamente extensible especificidad ingeniería genética ligando, el diseño modular, las señales independiente de la concentración de sensores, y una orientación precisa de pequeñas moléculas subcelulares. Sensores FRET se utilizan realmente para detectar una amplia gama de moléculas pequeñas, incluyendo iones ^9, heme ^10, y otros. Por otra parte, más de 20 tipos de construcciones de FRET se pueden encontrar fácilmente y se les ordenó a través del depositario sin fines de lucro Addgene ^11.

A pesar de la amplia aplicabilidad del analizador de FRET, hay dos cuestiones principales en el funcionamiento del dispositivo. En primer lugar, porque el funcionamiento del dispositivo es relativamente simple, el preprocesamiento de la muestra es el paso crítico que afecta a la calidad de la detección, salvo en caso de mal funcionamiento del dispositivo. En este protocolo, un paso (dilución de la muestra) era suficiente para procesar muestras líquidas que eran claramente transparente y no contenía parti insolublesculos. Sin embargo, otras muestras pueden requerir procesamiento adicional para eliminar los materiales insolubles, tales como los componentes celulares o de lípidos. Cualquier partícula autofluorescent que pueden afectar a la señal de FRET también deben ser eliminados, como se ha señalado que siguen al paso 2.7. En segundo lugar, es necesario abordar, al igual que con todos los tipos de pruebas en los puntos de atención (POCT) ¹² herramientas de control de calidad y la conectividad de interfaz con los sistemas de información hospitalarios. Dado que la calidad de la señal del analizador de FRET depende en gran medida de la calidad del sensor FRET y en los pasos de preprocesamiento, se requieren controles periódicos de control de calidad para garantizar que las mediciones se mantienen dentro del rango de señal estándar para el análisis de datos de control de calidad regular. El período de estabilidad y almacenamiento del sensor FRET, ambos de los cuales son esenciales para otras aplicaciones fiables, debe investigarse durante los controles de calidad. Creación de directrices y el desarrollo de software adecuado también puede hacer frente a la limitación de la conectividad. Las versiones actuales delanalizador de FRET están equipados con conectividad RS232 para control de línea de comandos a distancia, pero la comunicación inalámbrica puede ser una característica de la próxima versión del analizador, el cual tendrá una interfaz mejorada para los sistemas de información hospitalarios.

Sin embargo, los sensores FRET han sido diseñados para la especificidad de sustrato, un enfoque que normalmente permite más amplia especificidad ^2. En consecuencia, la señal de FRET puede encontrar interferencia no deseada de otros ingredientes, incluyendo otros tipos de azúcares en bebidas comerciales. Otras investigaciones deben explorar cómo los sensores FRET responder a varias mezclas de azúcar para cuantificar con precisión la cantidad de azúcar. La colaboración con las empresas que producen las bebidas le ayudará a confirmar el contenido de azúcar para calibrar el analizador de FRET.

Se prevé que el dispositivo de FRET portátil propuesto con varios sensores FRET se puede utilizar en aplicaciones POCT. POCT se utiliza para evaluar el embarazo, la sangrelos niveles de glucosa, proteínas biomarcadores, bacterias infecciosas y virus infecciosos. POCT métodos tienen tiempos de respuesta rápidos y generalmente exhiben bajas tasas de error debido al pequeño número de pasos de procesamiento. Estas son ventajas importantes de POCT sobre el enfoque central de pruebas de laboratorio. dispositivos POCT portátil de mano, tales como el dispositivo descrito en este documento, han despertado un interés creciente debido a sus potenciales aplicaciones en la evaluación de los alimentos y el control de azúcar en la sangre. En particular, monitorización de la glucosa de muestras de sangre en pacientes con diabetes requiere un método POCT rápida, precisa y rentable ^13. Después de que el equipo de investigación Ames desarrolló la primera tira de prueba de glucosa en sangre en 1965 (usando una tira que contiene glucosa oxidasa), se propusieron varias tecnologías para fines de monitoreo de glucosa en sangre ^12. El analizador de FRET también está disponible para detectar la glucosa en muestras de sangre con procesamiento previo apropiado de la sangre y protei periplásmicas de unión de glucosa-n (MglB) ¹⁴ basado en FRET proteína.

Se necesitan métodos simples, rápidos, para la evaluación de calidad de los alimentos. El consumo de bebidas que contienen azúcar se asocia con una variedad de enfermedades y síndromes, como el aumento del índice de masa corporal en la infancia ^15, la obesidad pediátrica ^16, y el riesgo de accidente cerebrovascular ^17. La comprensión de esta relación requiere una medición precisa de componentes de azúcar en las bebidas. Por lo tanto, las concentraciones de glucosa y fructosa de las bebidas son de interés para los científicos que se ocupan de la salud humana. Este protocolo demuestra el rendimiento de alta sensibilidad del analizador de FRET con un control óptimo de la temperatura. El dispositivo puede ser utilizado con diversos sensores FRET para detectar varias pequeñas moléculas depende incluyendo glucosa y fructosa ^14,15. Nuestro dispositivo portátil y recargable, que tiene una duración de la batería de 10 a 20 horas, dependiendo del protocolo de calentamiento, es aplicable para POCT. Su sencillo MAK protocolo operativoes el dispositivo fácil de usar y elimina la necesidad de formación del personal complicada. Con las mejoras técnicas, incluida la reducción del tamaño de los equipos, la reducción al mínimo de etapas de pretratamiento, y la identificación de los requerimientos prácticos para uso en el campo, este dispositivo promoverá el desarrollo de la investigación basada en FRET en entornos de laboratorio a pequeña escala.

Los autores no tienen nada que revelar.

Esta investigación fue apoyada por las subvenciones del Centro de Biología sintética inteligente del Proyecto Global Frontier (2011 a 0.031.944) y el Programa de Iniciativa de Investigación KRIBB.