Um Protocolo de vídeo de infecção retroviral na Primária Intestinal organóide Cultura

Este protocolo explica cultura organóide Lgr5-positve primário eo desempenho subseqüente de transdução retroviral. Isto permite que a sobre-expressão de Cre-indutível ou knockdown do transgene entregue e permite estudos funcionais a serem realizadas no novo em organotípica vitro sistema modelo.

Células-tronco Lgr5-positivo pode ser complementado com o crescimento essencial fatores EGF, Noggin, e R-espondina, o que nos permite cultura cada vez maior estruturas epiteliais 3D primários in vitro. A arquitetura e fisiológicas propriedades desses "mini-coragem", também chamados de Organóides, se assemelham os seus homólogos em vivo. Isso os torna um sistema modelo atraente para o pequeno epitélio intestinal. Usando transdução retroviral, genética funcionais podem agora ser realizadas por superexpressão de genes condicional ou knockdown. Este vídeo demonstra o processo de cultura organ�de, a geração de retrovírus, e a transdução retroviral de Organóides para auxiliar na análise fenotípica do epitélio do intestino delgado in vitro. Este sistema modelo organotípico romance, em combinação com a expressão de genes mediada retroviral fornece uma ferramenta valiosa para a análise rápida das funções de genes in vitro, sem a necessidade de costlGeração Y e demorado para animais transgênicos.

Genética funcional de alto rendimento é necessário para aumentar a nossa compreensão biológica do corpo, para melhorar a ciência básica atual e medicina. Mouse genética tem sido o padrão ouro para investigar a função do gene in vivo, embora seja tanto demorado e caro. As linhas celulares, sendo a outra opção comum, tem uma capacidade de produção mais elevada, enquanto ser menos dispendioso. No entanto, elas são impedidos pela sua incapacidade para reproduzir o microambiente adequado e deste modo, as respostas fisiológicas in vivo visto. Assim, existe uma necessidade para um sistema sem ambiguidade modelo fácil de manusear, que permite que o custo / eficiente em termos de tempo de análise de alto rendimento, enquanto imitando as respostas fisiológicas observadas em experimentos in vivo transgênicos (Tg) do mouse.

Para o epitélio endodermal um tal sistema modelo apareceu em 2009 ^1. Entre os conhecimentos adquiridos a partir da descoberta de células-tronco intestinais Lgr5-positivos foiInformações sobre o nicho correspondente aos factores de crescimento e da matriz extra-celular necessárias para a manutenção de células estaminais. Utilizando esta informação, tornou-se possível estabelecer 'mini-intestinos', também conhecidos como Organóides ^2. Recentemente, uma nomenclatura de consenso para culturas in vitro, onde Organóides são referidos como 'enteroids', foi sugerido ^3. Como linhas celulares, os Organóides estão em constante expansão e fácil de tratar com ligantes e inibidores. No entanto, em vez de ser bidimensional são estruturas tridimensionais auto-organização que retêm a organização cripta-vilosidade, assim como as células estaminais e as linhagens de células diferenciadas do intestino delgado (SI). Organóides constituído por uma única camada de células epiteliais que circundam a área luminal. Salientes estruturas brotamento correspondem a criptas do intestino delgado, contendo compartimento de células estaminais. A partir da ponta da estrutura de brotamento células progenitoras diferenciam em que miralar para o revestimento epitelial, onde as células terminalmente diferenciadas são derramadas para o lúmen. Em comparação com as linhas celulares, este sistema ex vivo recapitula mais de perto a fisiologia normal e, portanto, é um sistema modelo interessante para o epitélio do intestino delgado.

Neste protocolo vídeo de transdução retroviral, apresentamos um método que permite estudos ex vivo a função do gene, neste novo sistema de cultura organóide. Começamos descrevendo organ�de cultura de um modo passo-a-passo, e continuam a demonstrar a geração de retrovírus, seguido pelo procedimento de transdução. Finalmente, há uma seção para conselhos adicionais para solução de problemas. Uma vantagem desta técnica é que ele pode ser combinado com a imagem ao vivo ou rastreio de drogas, para o estudo da homeostase decisões destino celular e as interacções célula-célula no epitélio do intestino. Devido à sua arquitetura simples e taxa de rotatividade rápida, Organóides representam um modelo ideal sistema para o estudo da biologia de células-tronco de adultos. Além transdução retroviral pode ser aplicada a Organóides derivadas de ratinhos transgénicos pré-estabelecidas, assim como amostras de pacientes humanos. Com a aproximação do knock-in e knock-out não pode ser estendido para os seres humanos, os Organóides humano SI constituem uma alternativa atraente.

Em resumo, a manipulação genética por meio de transdução retroviral permite a análise fenotípica em pequenas Organóides intestinais derivadas de camundongos ou amostras de tecidos humanos, complementando assim a genética do rato e linhas celulares ao abrir novos caminhos para estudos em tecidos de origem humana. Transdução retroviral permite gain- e perda de função de estudos para ser executada no sistema de cultura organ�de ^4. Isto o torna um recurso valioso para investigar a função do gene, a biologia de células-tronco adultas e doença estando em conformidade com os três Rs (redução, refinamento e substituição).

Todos os ratos utilizados no seguinte protocolo foram mantidos em condições livres de patógenos específicos, e todos os procedimentos foram realizados de acordo com os regulamentos do Reino Unido Home Office.

1 Preparação

1. Prepare a mídia de 1 hora antes do uso (ver Quadro 1 e Lista de Materiais para mais detalhes) e pré-aquecido em um banho de água C ​​37 °, pelo menos, 10 minutos antes de usar.

2 A cultura do Intestino Delgado (SI) Organóides

NOTA: A menos que indicado de outra forma, todas as incubações são realizadas a 37 ° C, 5% de CO _2, num incubador humidificado. Equipamento e reagentes que entram em contacto com as células vivas têm de ser estéreis.

Pré-aquecimento da placa de cultura de tecidos é importante, pois evita que a matriz de cave (Matrigel ou BME) gotas de se espalhar para fora quando a semeadura. Além disso, a matriz deve ser porão mantida em gelo durante todo o tempo. Armazenar a -20 ° C e descongelamentoem gelo antes do uso.

1. Isolando criptas
   1. Para o isolamento do intestino delgado sacrificar o mouse de acordo com as normas e regulamentos nacionais, em seguida, colocar o animal em suas costas e lavar o abdômen com etanol 70%. Realize uma incisão mediana longitudinal desde a virilha até o esterno. Em primeiro lugar, cortar a pele e, em seguida, o tecido subcutâneo. Remover o intestino delgado a partir do ceco para o estômago. Isoladas a partir de criptas do duodeno, jejuno e íleo pode ser utilizado para a cultura organ�de.
   2. Lave o intestino delgado isolado com pré-resfriado Phosphate-Buffered Saline sem cálcio ou magnésio (PBS0).
   3. Corte o tecido em 3-5 cm de comprimento peças e use uma tesoura para cortá-la aberta longitudinalmente. Espalhar o tecido, utilizando fórceps.
   4. Raspe vilosidades usando uma lamela. Cuidado, muita força fará com que o tecido de rasgar e irá reduzir o rendimento de criptas em passos seguintes.
   5. Transferir o tecido para um tubo de 50 ml, contendo pré-arrefecida usin PBS0fórceps g. Lave os fragmentos de tecido através de agitação vigorosa e mudar o PBS0. Repita 2-3x ou até o PBS0 gira menos nublado.
   6. Incubar o tecido em um tubo de 50 ml contendo 30 ml de PBS0 com 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) durante 30 min a 4 ° C em um tubo de rolo.
   7. Agitar vigorosamente o tubo e transferir o tecido para outro tubo de 50 ml contendo 30 ml de PBS0 com 5 mM de EDTA. A solução de EDTA a 1 mM (previamente contendo o tecido) irá conter uma mistura de criptas e vilosidades. Esta fração não é adequado para a semeadura de Organóides como muitas vezes contém uma elevada percentagem de vilosidades.
   8. Incubar o tecido ainda durante 1 hora a 4 ° C em um tubo de rolo.
   9. Agitar vigorosamente o tubo e recolher a solução em um tubo de 50 ml limpo. Confirmar a presença de criptas e estimar o número, por exemplo, através da contagem das criptas em 50 ul por microscopia de luz. Calcula-se o volume necessário para se obter 50-100 criptas e transferi-lo para um 1,5 ml de tube.
   10. Gire a 300 xg por 5 min. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 50 mL de matriz de porão, e sementes de uma pré-aquecido placa de 24 poços. Incubar a placa numa incubadora de cultura de tecidos de 5-15 minutos de modo que a matriz de porão polimeriza.
   11. Sobreposição com 500 ul ENR médio (ver Tabela 1). Aproximadamente 24 horas após a semeadura das Organóides irá mostrar uma pequena forma cística redonda e após mais 2-3 dias brotamento estruturas tornam-se visíveis. Mude a mídia ENR frescas a cada 3 dias.
   12. Passage organóide culturas a cada 7 dias.
2. Passaging e Organóides Manutenção
   1. Manter os Organóides atualizando os meios de comunicação a cada 3 dias e passagem 1: 3 ou 1: 5 como o lúmen se enche de células mortas, aproximadamente a cada sete dias.
   2. Quebre a matriz cúpula porão com meio com 1 ml ponta PIPETMAN e transferi-lo do poço para um tubo de 1,5 ml.
   3. Mecanicamente dissociar os Organóides através de uma pipetapproximately 50x usando uma multa (por exemplo, 200 mL) de ponta.
   4. Gire a 300 xg por 5 min.
   5. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 150-250 mL de matriz porão. Semente de uma pré-aquecido placa de 24 poços (50 ul de matriz basal / poço). Antes de semear pipeta da matriz basal para cima e para baixo uma vez, para o revestimento de parede da ponta. Pipeta-se lentamente para evitar as bolhas e as sementes no meio do poço para evitar a matriz basal se espalhe para fora. É desejável para obter uma matriz de cúpula do porão, no centro do poço.
   6. Incubar numa incubadora de cultura de tecidos de 5-15 minutos de modo que a matriz de porão polimeriza. Overlay com 500 mL de mídia ENR por poço.

3 Pré-Tratamento de infecção SI Organóides

NOTA: A Figura 1 ilustra o procedimento de transdução.

1. Taxas ENR para ENRWntNic (ver Tabela 1) médio e crescer os Organóides em tseu meio para um mínimo de 3 dias ou até que eles adotaram uma morfologia cística. Wnt3a aumenta o número de células estaminais e de Paneth enquanto nicotinamida (NIC) melhora a eficiência da cultura.

4 Vírus Produção

1. É necessário 150 mm prato de células Platinum-E por infecção. Semente de aproximadamente 5 x 10 ⁶ células, com 15-18 ml de meio (DMEM + FBS 10%), na presença de puromicina (1 jag / mL) e blasticidina (10 ug / ml). Transfecção de células após 2-3 dias, depois de terem atingido 70-80% de confluência. Mudar o meio de DMEM + 10% FBS sem �puromicina e blasticidina antes da transfecção.
2. Adicionar 30 mg de construção de ADN retroviral e 240 mL de polietilenimina (PEI) para separar os tubos, contendo 1 ml de Opti-MEM. Misturar e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
3. Reunir as duas soluções e incuba-se à temperatura ambiente durante 20-30 min. Adicione a mistura completa para o meio de células Platinum-E e agitar cuidadosamente o plate para assegurar uma distribuição equitativa dos complexos DNA-PEI.
4. Incubar as células E-platina com a mistura de transfecção durante a noite e refrescar o meio no dia seguinte. Manter as células em meio novo durante 2 dias.
5. Recolhe apenas a forma de um tubo Falcon de 50 ml, que passam através de um filtro de 0,45 um e de centrifugação a 8000 xg, a 4 ° C durante 12-16 horas. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 250 ul de meio de transdução (ver Tabela 1).

5. organóide Fragmento Preparação

1. Para uma infecção de um poço de uma placa de 24 cavidades é necessário. Quebre a matriz cúpula porão com meio com 1 ml ponta pipeta e transferir para um tubo de 1,5 ml.
2. Utilizar um volume de ponta fina (por exemplo, de 200 pontas ul) para romper mecanicamente os Organóides através de pipetagem (30-50x). A solução torna-se turva e não Organóides integrais devem ser visíveis.
3. Centrifuga-se a temperatura ambiente, 900 x g durante 5 min .
4. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de protease recombinante de grau de cultura de células (por exemplo, TrypLE). Incubar a 37 ° C durante 5 min. Após a incubação, verificar o tamanho dos fragmentos por meio de microscopia de luz organ�de, contando o número de células por fragmento. Fragmentos contendo 5-10 células são ideais. Se a maioria dos fragmentos de conter um maior número de células do tempo de incubação pode ser aumentado por 2 minutos de cada vez.
5. Terminar o processo de dissociação, adicionando 500 mL de meio de ENR.
6. Centrifuga-se a temperatura ambiente, 900 x g durante 5 min. Remover o sobrenadante e o sedimento de manter em gelo ou a 4 ° C.

6. Transdução retroviral

1. Combinar fragmentos organ�de com 250 ul da solução retroviral (de secção 4.5) em um poço de uma placa de 48 poços. Misture delicadamente por pipetagem lento usando uma pipeta de ponta ml.
2. Selar a placa com Parafilm.

1. Centrifugar a placa a 32 ° C, 600 x g, durante 1 hora. Retire cuidadosamente o Parafilm e incubar a placa em uma cultura de tecidos incubadora durante 6 horas.

8 Sementeira de infectados organóide Fragments

1. Transferir os fragmentos organ�de infectadas e media a transdução do poço para um tubo de 1,5 ml, e de centrifugação a 900 xg durante 5 min.
2. Descartar o sobrenadante e colocar o tubo contendo o sedimento em gelo durante 5 minutos para arrefecer. Adicione 100 ml de matriz porão e colocar o agregado pipetando lentamente para cima e para baixo.
3. Gotas de semente de matriz 'porão -cell misturar' 50 ul de uma nova placa de 24 poços. Incubar a placa a 37 ° C, durante 5-15 min, até que os solidifica matriz basal.
4. Adic transdução sem polibreno aos poços e incuba-se a placa numa incubadora de cultura de tecidos. Mudança de mídia a cada 2-3 dias.

9 Seleção

1. Comece seLection após 2-3 dias, adicionando �puromicina (1 mg / ml) para a mídia.
2. Quando os fragmentos estão começando a formar Organóides substituir os meios de comunicação com os meios Transdução ENR suplementados com puromicina (1 jag / ml).

10 pós-infecção Tratamento de SI Organóides

1. Cultura transduzidas Organóides de acordo com o "Passaging e manter Organóides" protocolo (seção 2.2.1). Depois de 1-2 semanas, os Organóides SI vai recuperar as suas estruturas de brotamento.
2. Após o aparecimento de estruturas de brotamento induzir a expressão de miARN ou ADNc por adição de 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) em uma concentração de trabalho de 1 uM. Note que este passo só é válida se estiver usando vetores retrovirais de Addgene (pMSCV-loxP-dsRed-loxP-EGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-dsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32.703), e pMSCV -FLIP-puro-dsRed-GFP-miRNA (32704)) e Organóides expressam Cre-ERT2.

11. confirmação da infecção e Expressão / Supressão do gene de interesse

1. Se utilizar os vectores retrovirais da Addgene (32702, 32703 e 32704) eficiência de transdução pode ser confirmado pela observação da expressão dsRed. Além disso, a expressão ou a repressão do gene de interesse pode ser confirmada através de Western Blot, utilizando o GFP ou 3xHA epitopo (para a sobre-expressão do gene) e de qPCR (para knockdown do gene), conforme exemplificado na Koo et al ^4.

Organóides está pronto para ser dividida quando o lúmen central é escurecido devido à presença de células mortas (Figura 2). Depois de 2-3 dias de Organóides de pré-tratamento devem adotar uma morfologia cística redonda (Figura 3). Isto aumenta o número de células estaminais, aumentando as possibilidades de obtenção de integração estável. O tamanho do pelete do vírus pode variar após a centrifugação do sobrenadante viral, mais provavelmente, devido à variação de contribuição de restos celulares com o tamanho da pelota. Não foi observada correlação clara a eficiência de transdução. Durante o processo de selecção Organóides não transduzidas vai morrer, enquanto que os que tem uma integração estável permanecerá. A proteína fluorescente de retrovírus MSCV-eGFP pode ser observada em células originárias de Organóides sobreviventes, que têm uma morfologia cística, dentro de 2-3 dias após a transdução (Figura 4).

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Figura 1 Uma representação esquemática do procedimento de transdução retroviral. Antes Organóides infecção são pré-tratados com ENRWntNic até adoptarem uma estrutura cística (passo 1). As células E-platina são utilizadas como a linha celular de empacotamento, e são cultivadas até atingirem uma confluência de 70-80%. Posteriormente são transfectadas com a construção retroviral usando PEI. Os vírus são recolhidos 2 dias mais tarde (passo 2). Organóides são tripsinizadas para obter fragmentos que contenham 1-10 células (passo 3), e, em seguida, são infectadas (passo 4). Seguindo spinoculation para aumentar a eficiência de infecção (passo 5), os fragmentos organ�de infectadas foram semeadas (passo 6) e 2-3 dias mais tarde para a selecção de clones positivos com a integração estável pode ser realizada (passo 7).

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Figura 2 Imagem representativa de Organóides após 4-6 dias de cultura. O lúmen é preenchido com células mortas, fazendo parecer escuro. Organóides nesta fase estão prontas para serem passadas.

Figura 3 Imagem representativa de pequenos Organóides intestinais cultivadas em meio ENRWntNic por 3-4 dias. Os Organóides adotar uma morfologia cística.

Figura 4 Imagem representativa de pequenos Organóides intestinais (a) que mostram a expressão do transgene viral (b, eGFP).

Tabela 1 Mídia composição for Advanced DMEM / F12 +++, médio ENRWntNic, médio Transdução, médio ENR e meio para as células Platinum-E.

Para atingir alta eficiência de transdução de certos aspectos são fundamentais. Um deles é o pré-tratamento de Organóides com a mídia ENRWntNic até que adotar uma forma cística rodada. Isto aumenta o número de células estaminais e, assim, a possibilidade de obter uma integração estável do transgene, bem como aumentar a taxa de sobrevivência dos Organóides SI durante todo o procedimento de transdução. Outro parâmetro é o tempo de incubação seguinte spinoculation. Resultados de incubação muito curto ou muito longo em baixa eficiência de transdução e baixa sobrevida dos Organóides, respectivamente. O passo spinoculation não é essencial, embora ele aumenta significativamente a percentagem de Organóides transduzidas. Finalmente, vírus de título elevado é a chave para a transdução de sucesso. Isto é dependente do tipo de linha de células de empacotamento e vírus. A combinação de uma linha celular de platina-E e vírus de células estaminais de murino (MSCV), verificou-se produzir um título suficientemente elevado para a transdução de Organóides.

A técnica é restrito para os fenómenos epiteliais do sistema organ�de. No futuro, pode ser possível estudar as doenças infecciosas ou imuno-mediada através da co-cultura de agentes patogénicos ou a reconstituição com componentes derivadas do sistema imune, respectivamente. Além disso, os retrovírus só pode efectuar inserções de um tamanho relativamente pequeno. Por conseguinte, as regiões reguladoras de ocorrência natural têm de ser excluídos e, portanto, a expressão do transgene não pode imitar o deo gene endógeno. Como mencionado acima, a eficiência de knockdown depende do gene alvo e miARN. Se não miARN com eficiência knockdown adequado pode ser encontrado, pode limitar o uso da técnica em que o gene alvo em particular.

Teoricamente, Organóides são compatíveis com todas as técnicas de manipulação padronizados utilizados para linhas celulares. Transdução retroviral foi o primeiro método a ser relatado ^4, e, recentemente, BAC (cromossomo artificial bacteriano) -transgenesis tornou-se disponível ^5. Com um tempo de geração total de 2-3 semanas, após a transfecção do plasmídeo virai na linha celular de empacotamento, que é significativamente mais rápida do que a geração de um transgénicos (tg) do rato. Através da manutenção da arquitectura cripta-vilosidade in vivo, enquanto que contém as células estaminais, bem como todas as linhagens de células diferenciadas do epitélio intestinal, o sistema de cultura organ�de preenche a lacuna entre tg e cultura de células de animais utilizadas anteriormente.

Após o estabelecimento de pequenas Organóides intestinais, adaptação do protocolo de cultura original permitiu cultura de pâncreas, fígado, cólon e estômago epitélios ^9-11. Além disso, Organóides intestinal humana e Organóides tumorais foram extraídos de biópsias humanas normais, aden primáriooma e câncer colorretal biópsias ^10. O protocolo de infecção viral pode ser facilmente estendido para estes tipos de Organóides e fornece uma forma sem precedentes de realização de estudos funcionais em tecidos de origem humana.

Tomados em conjunto, transdução retroviral de pequenas Organóides intestinal é um recurso valioso para a investigação de manutenção de células estaminais, a diferenciação ea decisão destino celular, bem como a sinalização celular e de células célula-interações.

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

Koo BK e Mustata RC são suportados pelo Sir Henry Dale Fellowship do Wellcome Trust e Andersson-Rolf A é apoiada pelo Conselho de Pesquisa Médica (MRC). Fink J é apoiado pelo Programa de Doutoramento-4-year Wellcome Trust.