Un protocole de vidéo infections rétrovirales dans intestinale primaire Organoid Culture

Ce protocole explique culture organoïde primaire LGR5-positve et la performance ultérieure de transduction rétrovirale. Cela permet la surexpression Cre inductible ou effet de choc du transgène livré et permet des études fonctionnelles à réaliser dans le roman en organotypique in vitro système modèle.

Cellules souches LGR5 positifs peuvent être complétées par la croissance facteurs essentiels VO, caboche, et R-Spondin, ce qui nous permet à la culture en pleine expansion structures épithéliales 3D primaires in vitro. Les deux propriétés de l'architecture et physiologiques de ces «mini-tripes», également appelés organites, ressemblent beaucoup à leurs homologues in vivo. Cette eux un système de modèle attractif pour le petit épithélium intestinal fait. Utilisation de transduction rétrovirale, génétique fonctionnelle peuvent désormais être effectuées par la surexpression du gène conditionnelle ou effet de choc. Cette vidéo montre la procédure de culture organoïde, la génération de rétrovirus, et la transduction rétrovirale des organites à faciliter l'analyse phénotypique de la petite épithélium intestinal in vitro. Ce système modèle organotypique nouveau en combinaison avec l'expression de gènes à médiation rétrovirale fournit un outil précieux pour l'analyse rapide de la fonction des gènes in vitro sans qu'il soit nécessaire de costlgénération y et chronophage pour les animaux transgéniques.

Haut-débit génétique fonctionnelle est nécessaire pour accroître notre compréhension de la biologie du corps, afin d'améliorer la science fondamentale et la médecine actuelle. la génétique de la souris a été l'étalon-or pour étudier la fonction des gènes in vivo, même si elle est à la fois long et coûteux. Les lignées cellulaires, qui constitue l'autre choix commun, ont une capacité de débit supérieure, tout en étant moins cher. Cependant, ils sont gênés par leur incapacité à reproduire le microenvironnement approprié et par conséquent, les réponses physiologiques vu in vivo. Ainsi, il existe un besoin non ambiguë d'un système de modèle facile à manipuler, ce qui permet de coût / temps efficace analyse à haut débit tout en imitant les réponses physiologiques observés in vivo transgéniques expériences dans (tg) de souris.

Pour l'épithélium endodermique un tel système de modèle apparu en 2009 ^1. Parmi les connaissances acquises à partir de la découverte des cellules souches intestinales LGR5-positifs a étédes informations sur le créneau correspondant à la matrice et des facteurs de croissance extra-cellulaire nécessaires pour le maintien de cellules souches. En utilisant cette information, il est devenu possible d'établir des «mini-tripes» également connu sous le organites ^2. Récemment, une nomenclature de consensus pour les cultures in vitro, où organites sont appelés «enteroids», a suggéré ^3. Comme les lignées cellulaires, les organites sont en pleine expansion et facile à traiter avec des ligands et inhibiteurs. Cependant, au lieu d'être à deux dimensions sont des structures tridimensionnelles d'auto-organisation qui conservent l'organisation crypte-villosité ainsi que les cellules souches et lignées de cellules différenciées de l'intestin grêle (SI). Organites sont constitués d'une seule couche de cellules épithéliales qui entourent une zone luminale. Structures en herbe en saillie correspondent à de petites cryptes intestinales contenant le compartiment des cellules souches. A partir de la pointe de la structure naissante cellules souches se différencient car ils MIgrille vers l'épithélium, où les cellules différenciées sont excrétés dans la lumière. Par rapport à des lignées cellulaires, ce système ex vivo récapitule plus étroitement la physiologie normale et est donc un système de modèle prometteur pour le petit épithélium intestinal.

Dans ce protocole vidéo de transduction rétrovirale, nous présentons une méthode qui permet ex vivo des études de la fonction des gènes dans ce nouveau système de culture organoïde. Nous commencerons par décrire organoïde culture d'une manière pas-à-pas, et continue en démontrant la production de rétrovirus, suivie par la procédure de transduction. Enfin, il ya une section pour des conseils supplémentaires pour le dépannage. Un avantage de cette technique est qu'elle peut être combinée avec l'imagerie en direct ou le criblage de médicaments à étudier l'homéostasie, les décisions du destin cellulaire et interactions cellulaires dans l'épithélium intestinal. En raison de leur architecture simple et taux de rotation rapide, organites représentent un modèle idéal deystème pour l'étude des cellules souches adultes de la biologie. En outre transduction rétrovirale peut être appliquée à organites dérivées de souris transgéniques pré-établies ainsi que des échantillons de patients humains. À l'approche de knock-in et knock-out ne peut être étendue à l'homme, les organites humain SI constituent une alternative intéressante.

En résumé, la manipulation génétique par transduction rétrovirale permet l'analyse phénotypique de petits organites intestinales provenant de souris ou des échantillons de tissus humains, complétant ainsi la génétique de la souris et des lignées cellulaires tout en ouvrant de nouvelles voies pour des études dans les tissus humains dérivée. Transduction rétrovirale permet intensité forte et la perte de fonction des études à effectuer dans le système de culture organoïde ^4. Cela en fait un outil précieux pour étudier la fonction des gènes, adulte biologie des cellules souches et de la maladie, tout en étant en conformité avec les trois R (réduction, raffinement et remplacement).

Toutes les souris utilisées dans le protocole suivant ont été conservés dans des conditions exempts d'organismes pathogènes spécifiques, et toutes les procédures ont été effectuées conformément à la réglementation Royaume-Uni du Home Office.

Préparation 1

1. Préparez le support 1 heure avant utilisation (voir le tableau 1 et la liste des matériaux pour plus de détails) et pré-chaud dans un bain d'eau à 37 ° au moins 10 minutes avant utilisation.

2 La culture de l'intestin grêle (SI) organoïdes

REMARQUE: Sauf indication contraire, toutes les incubations sont réalisées à 37 ° C, 5% de CO ₂ dans un incubateur humidifié. L'équipement et les réactifs venir en contact avec des cellules vivantes doivent être stériles.

Pré-chauffer la plaque de culture de tissus est important, car il évite la matrice de sous-sol (Matrigel ou BME) à partir de gouttes d'étalement lors de l'ensemencement. En outre, la matrice de sous-sol doit être conservé sur la glace à tout moment. Conserver à -20 ° C et dégelsur la glace avant utilisation.

1. Isoler Cryptes
   1. Pour l'isolement de l'intestin grêle sacrifier la souris selon les règles et réglementations nationales, puis placez l'animal sur son dos et laver l'abdomen avec 70% d'éthanol. Effectuer une incision médiane longitudinale de l'aine jusqu'au sternum. Tout d'abord, couper la peau et du tissu sous-cutané. Retirer l'intestin grêle à partir du caecum à l'estomac. Cryptes isolées du duodénum, ​​le jéjunum et l'iléon peuvent être utilisés pour la culture organoïde.
   2. Laver le petit intestin isolé avec pré-refroidi une solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ou magnésium (PBS0).
   3. Coupez le tissu dans de longs morceaux de 3-5 cm et utiliser des ciseaux pour couper ouvrir longitudinalement. Étaler le tissu en utilisant une pince.
   4. Grattez villosités l'aide d'une lamelle. Attention, trop de force provoque le tissu à déchirer et permettra de réduire le rendement des cryptes dans les étapes suivantes.
   5. Transférer le tissu dans un tube de 50 ml contenant usin PBS0 pré-refroidiPince g. Laver les fragments de tissus par une agitation vigoureuse et changer le PBS0. Répétez 2-3 fois ou jusqu'à ce que le PBS0 tourne moins trouble.
   6. Incuber le tissu dans un tube de 50 ml contenant 30 ml de PBS0 avec 1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pendant 30 min à 4 ° C sur un rouleau de tube.
   7. Agiter vigoureusement le tube et transférer le tissu à un autre tube de 50 ml contenant 30 ml de PBS0 avec EDTA 5 mM. La solution d'EDTA 1 mM (contenant le tissu précédemment) contient un mélange de cryptes et villosités. Cette fraction ne convient pas pour le semis des organites, car il contient souvent un fort pourcentage de villosités.
   8. Incuber le tissu supplémentaire pendant 1 heure à 4 ° C sur un rouleau de tube.
   9. Agiter vigoureusement le tube et recueillir la solution dans un tube de 50 ml propre. Confirmer la présence de cryptes et estimer le nombre, par exemple, en comptant cryptes 50 pi par microscopie optique. Calculez le volume nécessaire pour obtenir 50-100 cryptes et le transférer à un 1,5 ml tube.
   10. Tourner à 300 g pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre le culot dans 50 ul de matrice de sous-sol, et les graines dans une plaque de 24 puits pré-chauffé. Incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu de 5 à 15 minutes de sorte que la matrice de sous-sol polymérisé.
   11. Superposition avec 500 ul moyen ENR (voir le tableau 1). Environ 24 heures après l'ensemencement des organites affiche une petite forme kystique ronde et après un autre 2-3 jours herbe structures deviennent visibles. Changer de médias ENR frais tous les 3 jours.
   12. Passage Organoid cultures tous les 7 jours.
2. Repiquage et organites maintien
   1. Maintenir les organites en actualisant les médias tous les 3 jours et 1 passage: 3 ou 1: 5, comme la lumière se remplit de cellules mortes, environ tous les 7 jours.
   2. Casser la matrice sous-sol dôme avec un milieu en utilisant 1 ml de pointe Pipetman et transférer du bien à un tube de 1,5 ml.
   3. Dissocier mécaniquement les organites par pipetage unenviron 50x à l'aide d'une amende (par exemple, 200 pi) pointe.
   4. Tourner à 300 g pendant 5 min.
   5. Jeter le surnageant et remettre le culot en 150-250 pi de matrice de sous-sol. Graine d'une pré-chauffé plaque à 24 puits (50 ul de matrice de sous-sol / puits). Avant le semis pipette la matrice de sous-sol de haut en bas une fois pour enrober la paroi de la pointe. Pipette lentement afin d'éviter les bulles et les semences dans le milieu du puits pour empêcher le sous-sol à partir de la matrice de dispersion. Il est souhaitable d'obtenir un dôme de matrice de sous-sol dans le centre du puits.
   6. Incuber dans un incubateur de culture de tissu pour 5-15 min si la matrice de sous-sol polymérise. Superposition avec 500 ul médias ENR par puits.

3 Pré-infection Traitement des SI organites

REMARQUE: La figure 1 illustre la procédure de transduction.

1. Bourse ENR à ENRWntNic (voir le tableau 1) moyen et grandir les organites dans tson milieu pendant un minimum de 3 jours ou jusqu'à ce qu'ils aient adopté une morphologie kystique. Wnt3a augmente le nombre de cellules souches et de Paneth tout Nicotinamide (Nic) améliore l'efficacité de la culture.

4. Virus production

1. Un plat de 150 mm de cellules Platinum-E est nécessaire par l'infection. Graine d'environ 5 x 10 ⁶ cellules par ml de milieu de 15 à 18 (DMEM + 10% de FBS) en présence de puromycine (1 ug / ml) et de la blasticidine (10 ug / ml). Transfecter des cellules au bout de 2-3 jours, lorsqu'elles ont atteint 70-80% de confluence. Changer le support de DMEM + 10% de FBS sans puromycine et blasticidine avant la transfection.
2. Ajouter 30 mg de construction d'ADN rétroviral, et 240 ul de polyéthylène-imine (PEI) pour séparer des tubes contenant 1 ml d'Opti-MEM. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min.
3. Réunir les deux solutions et laisser incuber à la température ambiante pendant 20 à 30 min. Ajouter le mélange complet au milieu de cellules Platinum-E et agiter prudemment la platee pour assurer une répartition égale des complexes ADN-PEI.
4. Incuber les cellules Platinum-E avec le mélange de transfection nuit et rafraîchir le milieu de la journée suivante. Maintenir les cellules dans le nouveau moyen pendant 2 jours.
5. Ne recueillir que le milieu dans un tube Falcon de 50 ml, passer à travers un filtre de 0,45 um et centrifuger à 8000 g à 4 ° C pendant 12-16 h. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 250 pi de milieu de transduction (voir le tableau 1).

5. Organoid Fragment Préparation

1. Pour une infection par un puits d'une plaque à 24 puits sont nécessaires. Casser la matrice sous-sol dôme avec un milieu en utilisant 1 ml de pointe Pipetman et le transférer dans un tube de 1,5 ml.
2. Utilisez une pointe de volume plus fine (par exemple, 200 conseils de pi) de perturber mécaniquement les organites par pipetage (30-50x). La solution devient trouble et sans organites entiers doit être visible.
3. Centrifuger à température ambiante, 900 g pendant 5 min .
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 pl de qualité culture cellulaire protéase recombinante (par exemple, TrypLE). Incuber à 37 ° C pendant 5 min. Après incubation vérifier la taille des fragments organoïdes utilisant la microscopie optique, compter le nombre de cellules par fragment. Fragments contenant 5-10 cellules sont idéales. Si la majorité des fragments contenant un nombre plus élevé de cellules le temps d'incubation peut être augmentée en deux minutes à une heure.
5. Terminer le processus de dissociation en ajoutant 500 pi de milieu ENR.
6. Centrifuger à température ambiante, 900 g pendant 5 min. Enlever le surnageant et garder le culot sur la glace ou à 4 ° C.

6. rétrovirale transduction

1. Moissonneuse fragments organoïdes avec 250 ul de la solution rétroviral (à partir de la section 4.5) dans un puits d'une plaque à 48 puits. Mélanger doucement par pipetage lent en utilisant 1 ml de pointe Pipetman.
2. Sceller la plaque avec du parafilm.

1. Centrifuger la plaque à 32 ° C, 600 xg, pendant 1 heure. Retirez délicatement le parafilm et incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu pendant 6 heures.

8. semis de fragments Organoid infectés

1. Transférer les fragments organoïdes infectées et les médias de la transduction du bien à un tube de 1,5 ml, et de spin à 900 g pendant 5 min.
2. Jeter le surnageant et remettre le tube contenant le culot sur de la glace pendant 5 minutes pour refroidir. Ajouter 100 ul de matrice de sous-sol et remettre en suspension le culot lentement par pipetage de haut en bas.
3. gouttes de semences de «sous-sol matrice -Chargeur mix '50 pi dans une nouvelle plaque de 24 puits. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 5 à 15 min jusqu'à ce que la solidification de la matrice de sous-sol.
4. Ajouter des médias de transduction sans polybrene dans les puits et incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu. Changer de support tous les 2-3 jours.

9 Sélection

1. Lancer soilection au bout de 2-3 jours en ajoutant à la puromycine (1 pg / ml) dans les médias.
2. Lorsque les fragments commencent à former des organites remplacer le support de transduction avec des milieux ENR supplémenté avec de la puromycine (1 ug / ml).

10 post-infection Traitement des SI organites

1. Culture transduction organites selon le «repiquage et de maintenir organoïdes" protocole (section 2.2.1). Après 1-2 semaines, les organites SI retrouveront leurs structures en herbe.
2. Suite à l'apparition de structures en herbe induire l'expression de miARN ou d'ADNc par addition de 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) à une concentration de travail de 1 uM. Notez que cette étape n'est valable que si vous utilisez des vecteurs rétroviraux de Addgene (pMSCV-loxp-DsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxp-DsRed-loxp-3xHA-Puro-WPRE (32703), et pMSCV -flip-puro-DsRed-GFP-miARN (32704)) et organites exprimant Cre-ERT2.

11 Confirmation des maladies infectieuses et Expression / répression du gène d'intérêt

1. Si vous utilisez des vecteurs rétroviraux de Addgene (32702, 32703 et 32704) efficacité de transduction peut être confirmée par l'observation d'expression DsRed. En outre, l'expression ou la suppression du gène d'intérêt peut être confirmée par Western Blot, en utilisant la GFP ou de l'épitope 3xHA (pour la surexpression du gène) et la PCR quantitative (par knock-down de gènes), comme illustré en ⁴ Koo et al.

Organites sont prêts à être divisé lorsque la lumière centrale est obscurcie par la présence de cellules mortes (figure 2). Après 2-3 jours de organoïdes pré-traitement devrait adopter une morphologie ronde kystique (Figure 3). Cela augmente le nombre de cellules souches, en améliorant les chances d'obtenir une intégration stable. La taille de la pastille virale peut varier suivant la centrifugation du surnageant viral, probablement en raison de la contribution variant de débris cellulaires de la taille des pellets. Aucune corrélation claire de l'efficacité de transduction a été observé. Au cours de la procédure de sélection organites non transduites vont mourir, tandis que ceux ayant une intégration stable est conservé. La protéine fluorescente à partir de rétrovirus MSCV-eGFP peut être observée dans des cellules provenant de survivants organites, qui ont une morphologie kystique, dans les 2-3 jours après transduction (figure 4).

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Figure 1: Une représentation schématique de la procédure de transduction rétrovirale. Organites Avant d'infection sont pré-traitées en utilisant ENRWntNic jusqu'à ce qu'ils adoptent une structure kystique (étape 1). Platine cellules-E sont utilisées comme la lignée cellulaire d'encapsidation, et sont mises en culture jusqu'à ce qu'elles atteignent 70-80% de confluence. Par la suite, ils sont transfectées avec la construction rétrovirale utilisant PEI. Les virus sont récoltées 2 jours plus tard (étape 2). Organites sont traitées à la trypsine pour obtenir des fragments contenant 1-10 cellules (étape 3), et sont ensuite infectées (étape 4). À la suite de spinoculation à augmenter l'efficacité de l'infection (étape 5), les fragments sont ensemencées organoïdes infectés (étape 6) et 2-3 jours après la sélection de clones positifs avec intégration stable peut être réalisée (étape 7).

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Figure 2: Représentant l'image de organoïdes après 4-6 jours de culture. La lumière est remplie de cellules mortes, faisant apparaître sombre. Organites à ce stade sont prêts à être des passages.

Figure 3 images représentant des petits organites intestinales cultivées en ENRWntNic médias pendant 3-4 jours. Les organites adopter une morphologie kystique.

Figure 4 images représentant des petits organites intestinales (a) qui montrent l'expression du transgène viral (b, eGFP).

Tableau composition 1. Médiathèque avancée DMEM / F12 +++, moyen ENRWntNic, le milieu de transduction, moyen ENR, et moyen pour les cellules Platinum-E.

Pour atteindre à haute efficacité de transduction certains aspects sont essentiels. L'un est le pré-traitement des organites avec ENRWntNic médias jusqu'à ce qu'ils adoptent une forme kystique ronde. Cela augmente le nombre de cellules souches et de ce fait la probabilité d'obtenir une intégration stable du transgène, ainsi que l'augmentation du taux des organites SI de survie tout au long de la procédure de transduction. Un autre paramètre est le temps d'incubation suivant spinoculation. Résultats trop courtes ou trop longues incubation à faible efficacité de transduction et faible taux de survie des organites, respectivement. L'étape de spinoculation n'est pas indispensable bien qu'elle augmente de manière significative le pourcentage des organites transduites. Enfin, le virus à titre élevé est essentiel pour la transduction succès. Cela dépend du type de lignée cellulaire d'encapsidation et virus. La combinaison de platine-E lignée cellulaire et le virus de la cellule souche murine (MSCV), a été trouvée pour produire un titre suffisamment élevé pour la transduction des organites.

La technique est limitée à des phénomènes épithéliales du système organoïde. Dans le futur, il pourrait être possible d'étudier les maladies infectieuses ou auto-immunes à travers la co-culture des agents pathogènes ou des composants dérivés de reconstitution du système immunitaire, respectivement. Par ailleurs, les rétrovirus ne peuvent effectuer des inserts de taille relativement petite. Par conséquent, les régions régulatrices naturelles doivent être exclus et donc l'expression du transgène ne peuvent pas imiter celui dele gène endogène. Comme mentionné ci-dessus, l'efficacité dépend de knockdown du gène cible et miARN. Si aucun miARN avec une efficacité de knock-down approprié peut être trouvé, il peut limiter l'utilisation de la technique pour ce gène cible particulier.

Théoriquement, organites sont compatibles avec toutes les techniques de manipulation standardisés utilisés pour les lignées cellulaires. Transduction rétrovirale a été la première méthode à indiquer ^4, et récemment BAC (chromosomes bactériens artificiels) -transgenesis est devenu disponible ^5. Avec un temps de production totale de 2 à 3 semaines après la transfection du plasmide viral dans la lignée cellulaire d'encapsidation, il est nettement plus rapide que la génération d'une transgéniques (Tg) de la souris. En maintenant l'in vivo l'architecture crypte-villosité tout en contenant des cellules souches ainsi que toutes les lignées de cellules différenciées de l'épithélium intestinal, le système de culture organoïde fait le pont entre l'animal et tg culture cellulaire utilisé précédemment.

Suite à la création de petits organites intestinaux, adaptation du protocole de culture d'origine a permis la culture de pancréas, du foie, du colon et de l'estomac épithéliums ^9-11. En outre, organites intestinales humaines et organites tumorales ont été obtenues à partir de biopsies humaines normales, primaire adenoma et le cancer colorectal biopsies ^10. Le protocole d'infection virale peut facilement être étendue à ces types de organoïdes et fournit un moyen sans précédent de réaliser des études fonctionnelles dans les tissus humains dérivée.

Pris dans leur ensemble, transduction rétrovirale de petits organites intestinale est une ressource précieuse pour la recherche d'entretien sur les cellules souches, la différenciation et la décision du destin cellulaire, ainsi que les interactions de signalisation cellulaire et cellules portable.

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

Koo BK et Mustata RC sont pris en charge par le Sir Henry Dale bourse du Wellcome Trust et Andersson-Rolf A est soutenu par le Medical Research Council (MRC). Fink J est soutenu par le Programme PhD 4 ans Wellcome Trust.