Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Dieses Protokoll erklärt primären Lgr5-positve Organoid Kultur und die anschließende Leistung der retroviralen Transduktion. Dies ermöglicht Cre-induzierbare Überexpression oder Knockdown der gelieferten Transgen und ermöglicht funktionelle Studien im organotypischen neues in vitro durchgeführt werden Modellsystem.

Lgr5-positiven Stammzellen können mit der wesentlichen Wachstumsfaktoren ergänzt werden EGF Noggin, und R-Spondin, die uns die Kultur ständig wachsende primäre epitheliale Strukturen 3D in vitro ermöglicht. Sowohl die Architektur und physiologischen Eigenschaften dieser "Mini-Mumm", auch genannt Organoide, ähneln ihre in-vivo-Pendants. Dies macht sie zu einem attraktiven Modellsystem für die Dünndarm-Epithel. Verwendung von retroviralen Transduktion können funktionelle Genetik jetzt bedingten Gen-Überexpression oder Knockdown durchgeführt werden. Dieses Video zeigt den Vorgang des organoiden Kultur, die Erzeugung von Retroviren und den retroviralen Transduktion von Organoiden phänotypische Analyse Dünndarmepithels in vitro zu unterstützen. Diese neuartige organotypischen Modellsystem in Kombination mit retroviralen vermittelte Genexpression bietet ein wertvolles Werkzeug für die schnelle Analyse von Genfunktionen in vitro ohne die Notwendigkeit costly und zeitaufwendige Erzeugung transgener Tiere.

Hochdurchsatz-Genetik ist notwendig, um unsere biologische Verständnis des Körpers zu erhöhen, die Verbesserung des derzeitigen Grundlagenforschung und Medizin. Mausgenetik der Goldstandard für die Untersuchung von Gen-Funktion in vivo, obwohl es sowohl zeitaufwendig und kostspielig ist. Zelllinien, wobei die andere gemeinsame Wahl, eine höhere Durchsatzleistung, während sie weniger teuer. Sie werden jedoch durch ihre Unfähigkeit, die richtige Mikro und dadurch die physiologischen Reaktionen in vivo gesehen reproduzieren behindert. Daher besteht ein eindeutiger Bedarf an einem einfach zu handhabenden Modellsystem, das Kosten / zeiteffiziente Hochdurchsatzanalyse, während ermöglicht Nachahmung der in vivo in transgenen (tg) Mausexperimenten beobachtet physiologischen Reaktionen.

Für die endodermalen Epithel erschien eine solche Modellsystem im Jahr 2009 ^1. Unter die Erkenntnisse aus der Entdeckung der Lgr5-positiven Darm Stammzellen wurdeInformationen über die Nische, die den extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktoren für die Stammzell Wartung notwendig. Unter Verwendung dieser Informationen es möglich, "Mini-Mumm 'auch als Organoide ² bekannt zu etablieren wurde. Vor kurzem wurde ein Konsens Nomenklatur für in vitro-Kulturen, in denen Organoide werden als "enteroids" genannt, wurde ³ vorgeschlagen. Wie Zelllinien sind die Organoide ständig wachsenden und leicht, mit Liganden und Inhibitoren zu behandeln. Jedoch anstatt zweidimensional sind dreidimensionale selbstorganisierenden Strukturen, die Krypta-Zotten Organisation beizubehalten sowie Stammzellen und differenzierten Zelllinien des Dünndarms (SI). Organoide bestehen aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen, die eine luminale Fläche umgeben. Vorstehende angehende Strukturen entsprechen Dünndarm Krypten, die die Stammzellraum. Ausgehend von der Spitze des angehenden Struktur Vorläuferzellen differenzieren, wie sie miRost in Richtung des Epithels, wo terminal differenzierten Zellen in das Lumen zu vergießen. Im Vergleich zu Zelllinien, diese ex vivo-System näher rekapituliert die normale Physiologie und ist daher ein vielversprechendes Modellsystem für die Dünndarm-Epithel.

In diesem Video-Protokoll von retroviralen Transduktion, präsentieren wir eine Methode, die Ex-vivo-Studien Genfunktion in diesem Roman Organoid Kultursystem ermöglicht. Wir beginnen mit der Beschreibung organoiden Kultur in einer Schritt-für-Schritt-Weise, und weiter durch den Nachweis der Erzeugung von Retroviren, gefolgt von der Übertragungsprozedur. Schließlich gibt es einen Abschnitt für zusätzliche Hinweise für die Fehlersuche. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass sie mit Echtzeit-Bildgebung oder Drogenscreening kombiniert, um die Homöostase, Zellschicksal Entscheidungen und Zell-Zell-Interaktionen im Darmepithel zu untersuchen. Aufgrund ihrer einfachen Architektur und schnelle Fluktuation, Organoide stellen eine ideale Model System für das Studium der Biologie mit adulten Stammzellen. Darüber hinaus können retrovirale Transduktion zu Organoide von vorher festgelegten transgene Mäuse sowie menschliche Patientenproben abgeleitet angewendet werden. Als Knock-in-und Knock-out-Ansätze können nicht auf den Menschen ausgeweitet werden, die menschlichen SI Organoide bilden eine attraktive Alternative.

Zusammenfassend Genmanipulation durch retrovirale Transduktion ermöglicht phänotypische Analyse im Dünndarm von Mäusen Organoide oder menschliche Gewebeproben stammen, ergänzt somit Mausgenetik und Zelllinien, während die Eröffnung neuer Wege für die Studien in menschlichen Geweben abgeleitet. Retrovirale Transduktion ermöglicht GAIN- und Verlust-Funktions-Studien in der organoiden Kultursystem ⁴ durchgeführt werden. Damit ist es eine wertvolle Ressource für die Untersuchung von Gen-Funktion, mit adulten Stammzellen Biologie und Krankheit, während sie in Übereinstimmung mit den drei Rs (Reduzierung, Verfeinerung und Ersatz).

Alle Mäuse in dem folgenden Protokoll verwendet, wurden in spezifischen Pathogen-freien Bedingungen gehalten und alle Verfahren wurden nach den United Kingdom Home Office Bestimmungen durchgeführt.

1. Vorbereitung

1. Bereiten Medien 1 Stunde im Voraus zu verwenden (siehe Tabelle 1 und Werkstoffliste für weitere Details) und Pre-warm in einem 37 ° C Wasserbad mindestens 10 min vor dem Gebrauch.

2. Die Züchtung des Dünndarms (SI) Organoide

Hinweis: Soweit nicht anders angegeben, sind alle Inkubationen bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator durchgeführt. Geräte und Reagenzien in Kontakt mit lebenden Zellen müssen steril sein.

Vorwärmen der Gewebekulturplatte ist wichtig, da es verhindert, dass der Keller Matrix (Matrigel oder BME) fällt von Ausbreitung, wenn der Aussaat. Auch sollte die Keller Matrix auf Eis aufbewahrt werden. Lagerung bei -20 ° C und Auftauenauf Eis vor dem Gebrauch.

1. Isolieren Krypten
   1. Zur Isolierung des Dünndarms zu opfern Sie die Maus nach den nationalen Regeln und Vorschriften, dann das Tier auf den Rücken und den Bauch waschen mit 70% Ethanol. Durchführen einer Längsmittelschnitt von der Leiste bis zum Brustbein. Zuerst schneiden Sie die Haut und dann das Unterhautgewebe. Entfernen Sie den Dünndarm aus dem Blinddarm in den Magen. Krypten von Zwölffingerdarm, Leerdarm und Krummdarm isoliert für Organoid Kultur verwendet werden.
   2. Ohne Calcium oder Magnesium (PBS0) Waschen der isolierten Dünndarm mit vorgekühlten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung.
   3. Schneiden Sie das Gewebe in 3-5 cm lange Stücke schneiden und mit einer Schere schneiden Sie es in Längsrichtung zu öffnen. Verbreiten Sie das Gewebe mit einer Pinzette.
   4. Abkratzen Zotten mit einem Deckglas. Vorsicht, zu viel Kraft das Gewebe zu zerreißen verursachen und die Ausbeute der Krypten in folgenden Schritten zu reduzieren.
   5. Übertragen des Gewebes in ein 50 ml Röhrchen, das vorgekühlte PBS0 using Pinzette. Die Gewebefragmente durch kräftiges Schütteln waschen und ändern Sie die PBS0. Wiederholen Sie 2-3 x oder bis die PBS0 dreht sich weniger bewölkt.
   6. Inkubieren des Gewebes in einem 50-ml-Röhrchen mit 30 ml PBS0 mit 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für 30 min bei 4 ° C auf einer Rohrwalze.
   7. Kräftig schütteln das Rohr und übertragen das Gewebe zu einem anderen 50-ml-Tube mit 30 ml PBS0 mit 5 mM EDTA. Die 1 mM EDTA-Lösung (zuvor mit dem Gewebe) wird eine Mischung aus Krypten und Zotten enthalten. Diese Fraktion eignet sich nicht für die Aussaat von Organoiden, wie es enthält oft einen hohen Anteil an Zotten.
   8. Bebrüten das Gewebe weiter für 1 h bei 4 ° C auf einem Rohrwalze.
   9. Kräftig schütteln den Schlauch und sammelt die Lösung in einem sauberen 50-ml-Tube. Bestätigen das Vorhandensein der Krypten und schätzen die Zahl, beispielsweise durch Zählen Krypten in 50 ul durch Lichtmikroskopie. Berechnen Sie die benötigt wird, um 50-100 Krypten erhalten und übertragen sie in ein 1,5 ml t Volumenube.
   10. Spin bei 300 g für 5 min. Überstand verwerfen, das Pellet in 50 ul Keller Matrix und Saatgut in einem vorgewärmten Platte mit 24 Vertiefungen. Die Platte in einem Brutschrank für 5-15 Minuten, so dass die Keller Matrix polymerisiert.
   11. Overlay mit 500 ul ENR-Medium (siehe Tabelle 1). Etwa 24 Stunden nach der Aussaat der Organoide eine kleine runde zystische Form zeigen und nach weiteren 2-3 Tagen angehende Strukturen werden sichtbar. Ändern Sie die frische ENR Medien alle 3 Tage.
   12. Passage organoiden Kulturen alle 7 Tage.
2. Passagieren und Warten Organoide
   1. Pflegen Sie die Organoide durch die Aktualisierung der Medien alle 3 Tage und Durchgang 1: 3 oder 1: 5, wie das Lumen wird mit toten Zellen, etwa alle 7 Tage gefüllt.
   2. Brechen die Keller Matrix Kuppel mit Medium mit 1 ml Pipetman Spitze und überträgt es aus dem Brunnen in ein 1,5-ml-Tube.
   3. Mechanisch distanzieren die Organoide durch Pipettieren eintwa 50x mit einer feinen (zB 200 ul) Spitze.
   4. Spin bei 300 g für 5 min.
   5. Überstand verwerfen und das Pellet in 150-250 ul Keller Matrix. Saatgut in einem vorgewärmten Platte mit 24 Vertiefungen (50 ul Keller Matrix / Vertiefung). Vor der Aussaat Pipette der Keller-Matrix auf und ab, sobald die Beschichtung der Wand der Spitze. Pipette langsam auf Blasen und Saaten in der Mitte des Bohrlochs, um den Keller Matrix der Ausbreitung zu hindern. Es ist erwünscht, eine Kuppel aus Keller-Matrix in der Mitte des Bohrlochs zu erhalten.
   6. Inkubieren in einer Gewebekultur-Inkubator für 5-15 Minuten, so dass die Keller Matrix polymerisiert. Overlay mit 500 ul ENR Medien pro Vertiefung.

3. Pre-Infektion Behandlung von SI Organoide

ANMERKUNG: Abbildung 1 veranschaulicht die Übertragungsprozedur.

1. Austausch ENR zu ENRWntNic (siehe Tabelle 1) mittlere und wachsen die Organoide in tsein Medium für mindestens 3 Tage oder bis sie eine zystische Morphologie angenommen. Wnt3a erhöht die Anzahl der Stamm-und Paneth-Zellen während Nicotinamid (Nic) verbessert die Effizienz Kultur.

4. Virusproduktion

1. Ein 150-mm-Schale von Platinum-E-Zellen pro Infektion benötigt. Samen etwa 5 x 10 ⁶ Zellen mit 15-18 ml Medium (DMEM + 10% FBS) in Gegenwart von Puromycin (1 ug / ml) und Blasticidin (10 ug / ml). Transfektion von Zellen nach 2-3 Tagen, wenn sie 70-80% Konfluenz erreicht haben. Ändern das Medium DMEM + 10% FBS ohne Puromycin und Blasticidin vor der Transfektion.
2. Werden 30 ug von retroviralen DNA-Konstrukt, und 240 ul von Polyethylenimin (PEI) in Röhrchen gegeben, 1 ml Opti-MEM trennen. Mischen und bei Raumtemperatur für 5 min.
3. Bündeln die beiden Lösungen und bei Raumtemperatur für 20-30 min. Fügen Sie die komplette Mischung auf das Medium der Platinum-E-Zellen und vorsichtig schütteln plate die Gleichverteilung der DNA-PEI-Komplexe gewährleisten.
4. Die Platinum-E-Zellen mit der Transfektion Mischung über Nacht inkubieren und aktualisieren das Medium am nächsten Tag. Halten der Zellen in dem neuen Medium für 2 Tage.
5. Sammeln nur das Medium in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen, führt es durch einen 0,45 um Filter und Zentrifuge bei 8.000 × g bei 4 ° C für 12-16 Stunden. Überstand verwerfen und das Pellet in 250 ul Transduction Medium (siehe Tabelle 1).

5. Organoide Fragment Vorbereitung

1. Für eine Infektion ein gut von einer 24-Well-Platte benötigt wird. Brechen die Keller Matrix Kuppel mit Medium mit 1 ml Pipetman Spitze und überträgt es auf einem 1,5-ml-Tube.
2. Verwenden Sie ein feiner Spitze Volumen (zB 200 ul Tipps) mechanisch stören die Organoide durch Pipettieren (30-50x). Die Lösung wird trüb und keine ganze Organoide sichtbar sein soll.
3. Zentrifuge bei Raumtemperatur 900 g für 5 min .
4. Überstand verwerfen und das Pellet in 500 ul Zellkultur rekombinanten Protease (zB TrypLE). Bei 37 ° C für 5 min. Nach der Inkubation überprüfen Sie die Größe der Fragmente Organoid mittels Lichtmikroskopie, Zählen der Anzahl der Zellen pro Fragment. Fragmente mit 5-10 Zellen eignen. Wenn die Mehrheit der Fragmente eine höhere Anzahl von Zellen enthalten, die Inkubationszeit kann von 2 min zu einem Zeitpunkt erhöht werden.
5. Beenden Sie die Dissoziation durch Zugabe von 500 ul ENR Medium.
6. Zentrifuge bei Raumtemperatur 900 g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und halten das Pellet auf Eis oder 4 ° C.

6. retrovirale Transduktion

1. Kombinieren Organoid Fragmente mit 250 ul des retroviralen Lösung (aus Abschnitt 4.5) in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte. Vorsichtig mischen durch langsames Pipettieren mit 1 ml Pipetman Spitze.
2. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm.

1. Zentrifugieren Sie die Platte bei 32 ° C, 600 g, für 1 Stunde. Entfernen Sie vorsichtig das Parafilm und Inkubation der Platte in eine Gewebekultur-Inkubator für 6 Stunden.

8. Setzen von Infizierte Organoide Fragmente

1. Übertragen Sie die infizierten Organoid Fragmente und Übertragungsmedien aus dem Brunnen in ein 1,5-ml-Röhrchen und Spin bei 900 g für 5 min.
2. Überstand verwerfen, das Glas, das die Pellets auf Eis für 5 min abkühlen. 100 l Keller Matrix und das Pellet durch Pipettieren langsam auf und ab.
3. Samentropfen 50 ul "Keller Matrix -Cell mixe in einem neuen 24-Well-Platte. Die Platte bei 37 ° C für 5-15 Minuten, bis die Keller Matrix erstarrt.
4. Fügen Transduktion Medien ohne Polybren zu den Vertiefungen pipettieren und die Platte in einer Gewebekultur-Inkubator. Medien ändern alle 2-3 Tage.

9. Auswahl

1. Starten sewahl nach 2-3 Tagen durch Zugabe von Puromycin (1 ug / ml) zu den Medien.
2. Wenn die Fragmente beginnen zu bilden Organoiden ersetzen Transduktion Medien ENR Medien mit Puromycin (1 ug / ml) ergänzt.

10. Post-Infektion Behandlung von SI Organoide

1. Kultur transduziert Organoide nach dem "Passagierung und Pflege Organoide"-Protokoll (Abschnitt 2.2.1). Nach 1-2 Wochen werden die SI Organoide ihre angehenden Strukturen wieder zu erlangen.
2. Nach Auftreten der angeh Strukturen induzieren die Expression der miRNA oder cDNA durch Zugabe von 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) in einer Arbeitskonzentration von 1 uM. Beachten Sie, dass dieser Schritt ist nur gültig, wenn mit Hilfe von retroviralen Vektoren Addgene (pMSCV-loxP-DsRed-loxP-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-DsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32703) und pMSCV -flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) und Organoide exprimieren Cre-ERT2.

11. Bestätigung der Infektion und Expression / Unterdrückung der Gen von Interesse

1. Bei der Verwendung von retroviralen Vektoren Addgene (32702, 32703 und 32704) Transduktionseffizienz kann durch Beobachtung der dsRed Ausdruck bestätigt werden. Ferner kann die Expression oder Suppression des Gens von Interesse durch Western-Blot bestätigt werden, unter Verwendung des GFP oder 3xHA Epitop (für die Gen-Überexpression) und qPCR (Gene Knockdown), wie in Koo et al ⁴ veranschaulicht.

Organoide bereit zu spalten, wenn die zentrale Lumen durch das Vorhandensein von toten Zellen (Figur 2) verdunkelt werden. Nach 2-3 Tagen der Vorbehandlung Organoide sollte eine runde zystische Morphologie (Abbildung 3) erlassen. Dies erhöht die Anzahl von Stammzellen, die Verbesserung der Aussichten auf stabile Integration. Die Größe des viralen Pellet nach Zentrifugation des viralen Überstand aufgrund der unterschiedlichen Beitrag der Zelltrümmer auf die Pelletgröße zu variieren, wahrscheinlich. Keine klare Korrelation zu Transduktionseffizienz wurde beobachtet. Während des Auswahlverfahrens nicht-transduzierten Organoide sterben wird, während die, die mit einem stabilen Integration wird bleiben. Das fluoreszierende Protein von MSCV-eGFP-Retrovirus kann in Zellen überleben Organoiden, die eine cystische Morphologie innerhalb von 2-3 Tagen nach der Transduktion (Abbildung 4) Ursprung beobachtet werden.

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Abbildung 1 ist eine schematische Zeichnung der retroviralen Transduktion Verfahren. Vor der Infektion Organoide werden vorbehandelt mit ENRWntNic bis sie eine zystische Struktur (Schritt 1) anzunehmen. Platin-E-Zellen werden als Verpackungszelllinie verwendet werden, und kultiviert, bis sie 70-80% Konfluenz erreichen. Danach werden sie mit dem retroviralen Konstrukt mit PEI transfiziert. Viren gibt 2 Tage später (Schritt 2) geerntet. Organoide werden trypsiniert, um Fragmente mit 1-10 Zellen (Schritt 3) zu erhalten, und dann infiziert sind (Schritt 4). Nach spinoculation die Infektionseffizienz (Schritt 5) zu erhöhen, werden die infizierten Organoid Fragmente für positive Klone ausgesät (Schritt 6) und 2-3 Tage später die Auswahl mit stabilen Integration kann (Schritt 7) durchgeführt werden.

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Abbildung 2. Repräsentatives Bild Organoide nach 4-6 Tagen Kultur. Das Lumen ist mit toten Zellen gefüllt, so dass es zu dunkel erscheinen. Organoide in diesem Stadium sind bereit, agiert werden.

Abbildung 3. Repräsentative Bild der kleinen Darm Organoide in ENRWntNic Medien für 3-4 Tage kultiviert. Die Organoide nehmen eine zystische Morphologie.

Abbildung 4. Repräsentative Bild der kleinen Darm Organoide (a), die virale Transgen-Expression (b, eGFP) zu zeigen.

Tabelle 1. Medien Zusammensetzung für Advanced DMEM / F12 +++, ENRWntNic Medium, Transduktion Medium, ENR Medium und Medium für Platinum-E-Zellen.

Um das zu erreichen hohe Transduktionseffizienz bestimmte Aspekte sind kritisch. Eine davon ist die Vorbehandlung von Organoide mit ENRWntNic Medien, bis sie eine runde Form zystischer erlassen. Dies erhöht die Anzahl von Stammzellen, und dadurch die Möglichkeit zu erhalten, die eine stabile Integration des Transgens, sowie die Erhöhung der Überlebensrate der SI Organoiden gesamten Übertragungsverfahren. Ein weiterer Parameter ist die Inkubationszeit folgenden spinoculation. Zu kurz oder zu lange Inkubationszeit führt zu einer schlechten Transduktionseffizienz und schlechte Überleben der Organoide sind. Die spinoculation Schritt ist nicht wesentlich, obwohl es den Prozentsatz der transduzierten Organoiden deutlich erhöht. Schließlich ist mit hohem Titer Virus Schlüssel für eine erfolgreiche Transduktion. Dies ist abhängig von der Art der Verpackungszelllinie und Viren. Die Kombination von Platin-E-Zellinie murinen Stammzellvirus (MSCV), zeigte einen Titer hoch genug für die Transduktion von Organoiden zu erzeugen.

Die Technik basiert auf der epithelialen Phänomene des organoiden System beschränkt. In der Zukunft kann es möglich sein, infektiösen oder Autoimmunerkrankungen, durch Co-Kultivierung von Pathogenen oder Rekonstitution mit Komponenten des Immunsystems abgeleitet untersuchen sind. Darüber hinaus kann nur Retroviren tragen Einsätze aus einem relativ kleinen Größe. Folglich natürlich vorkommende regulatorische Regionen ausgeschlossen werden und somit die Expression des Transgens nicht zu imitieren, dass derdas endogene Gen. Wie oben erwähnt, ist der Zuschlags Effizienz abhängig von der Ziel-Gen und miRNA. Wenn keine miRNA mit geeigneten Zuschlags Effizienz gefunden werden kann es die Verwendung der Technik für diese spezielle Zielgens zu begrenzen.

Theoretisch sind mit allen standardisierten Organoide manipulative Techniken zur Zelllinien verwendet werden, kompatibel. Retrovirale Transduktion war die erste Methode gemeldet werden ^4, und vor kurzem BAC (Bacterial Artificial Chromosome) -transgenesis verfügbar geworden ^5. Mit insgesamt Generationszeit von 2-3 Wochen nach der Transfektion der viralen Plasmid in die Verpackungszelllinie, es ist deutlich schneller als die Erzeugung einer transgenen (tg) der Maus. Durch die Aufrechterhaltung der in-vivo-Krypta-Zotten Architektur, während Stammzellen enthält, sowie alle differenzierten Zelllinien des Darmepithels überbrückt die Organoid Kultursystem die Lücke zwischen Tier tg und frühere Zellkultur.

Nach der Gründung der kleinen Darm Organoide, hat die Anpassung der ursprünglichen Kultur Protokoll Kultivierung von Bauchspeicheldrüsen, Leber, Dickdarm-und Magen Epithelien ^9-11 erlaubt. Darüber hinaus haben menschlichen Darm-und Tumor Organoide Organoide aus normalen menschlichen Biopsien abgeleitet, primäre adenoma und Darmkrebs Biopsien ^10. Die virale Infektion Protokoll kann leicht auf diese Art von Organoiden verlängert und bietet eine beispiellose Möglichkeit zum Durchführen funktioneller Studien in menschlichen Geweben stammen.

Zusammengenommen ist retroviralen Transduktion von Dünndarm Organoide eine wertvolle Ressource für die Untersuchung von Stammzellen Wartung, Differenzierung und Zellschicksal Entscheidung, sowie Zellsignalisierung und Zell-Zell-Interaktionen.

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

Koo BK und Mustata RC werden von der Sir Henry Dale-Stipendium der Wellcome Trust und Andersson-Rolf A unterstützt wird von der Medical Research Council (MRC) unterstützt. Fink J wird von der Wellcome Trust 4-Jahres-PhD-Programm unterstützt.