Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

Imunohistoquímica protocolos são usados ​​para estudar a localização de uma proteína específica na retina. Técnicas de imagem de cálcio são utilizados para estudar a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axônios.

Neste artigo descrevemos as ferramentas, os reagentes e os passos práticos que são necessários para: 1) preparação bem-sucedida de retinas wholemount para imunohistoquímica e, 2) imagens de cálcio para o estudo da tensão fechado de canais de cálcio (VGCC) mediada sinalização de cálcio na retina células ganglionares. O método de imagem de cálcio que descrevem problemas contorna relativas à carga não-específica de células amácrinas deslocadas na camada de células ganglionares.

As células ganglionares da retina (RGCs) expressar L, N, P / Q e T-tipo VGCC como determinado por meio do bloqueio farmacológico desses componentes de toda a célula actual canal Ca ^1,2. VGCC são proteínas transmembrana multim�icos que estão envolvidos na liberação do transmissor, a transcrição do gene, regulação celular e sináptica ^3,4,5 plasticidade. VGCCs funcionais são compostos de pelo menos três classes distintas de subunidades: grandes, transmembrana α ₁ poro formando subunidades que estabelecem propriedades biofísicas e farmacológicas do canal, principalmente extracelular α auxiliar ₂ δ subunidades e subunidades β intracelulares. Os dois últimos formam complexos heterom�icas com diferentes α _um subunidades e alterar a cinética de propagação e tráfico de canais para a membrana plasmática ^6.

Nas últimas décadas, várias técnicas têm sido empregadas para estudar expre proteínassion, tais como imuno-histoquímica, ligada ensaio imunoenzimático, análise de Western e citometria de fluxo. Estas técnicas requerem a utilização de anticorpos específicos para a detecção de uma determinada proteína de interesse e fornecem ferramentas poderosas para a localização e distribuição de proteínas específicas em diferentes tecidos. As técnicas usadas para detectar e quantificar níveis de uma proteína particular de expressão de ARNm, tais como a análise de manchas de Northern, RT-PCR, em tempo real quantitativa de RT-PCR, hibridação in situ, de microarrays e ensaio de protecção de ribonuclease proporcionam uma abordagem alternativa, quando os anticorpos não são prontamente os níveis de expressão ou se disponíveis de uma proteína particular são baixos ^7. No entanto, uma limitação para a utilização de tais técnicas moleculares é necessária a identificação da sequência do gene.

Para localizar as proteínas na retina, imuno-histoquímica pode ser realizada em retinas wholemount. Devido à acessibilidade das CGR, a wholemountpreparação fornece uma plataforma excelente para o estudo da localização de proteínas específicas para o RGC somata e seus axónios.

Em adição à sua localização, algumas propriedades funcionais dos VGCCs em CGRs pode ser demonstrada através da utilização de técnicas de imagiologia de cálcio. Descreve-se um protocolo de imagens de cálcio para etiquetar selectivamente CGR com um corante indicador de cálcio para medir a dinâmica de cálcio intracelulares. A contribuição de diferentes VGCCs ao sinal de cálcio em diferentes compartimentos celulares podem ser isoladas com o uso de bloqueadores dos canais de Ca específicos do subtipo.

Talvez um dos aspectos mais benéficos da técnica de imagiologia de cálcio descritos aqui é a capacidade de gravar, simultaneamente e de forma independente a partir de múltiplas CGR e seus axónios. Embora muitas técnicas fisiológicas, como a correção de células gravação braçadeira todo, proporcionar gravações de alta resolução temporal das correntes de membrana, o somático ou fonte axonal de these correntes gravados não podem ser discriminados e gravações só pode ser feita a partir de um único neurónio de cada vez. Matrizes multieletrodo (AMA) são capazes de gravar simultaneamente picos de muitas células, mas podem detectar e nem discriminar a ativação de, por exemplo, diferentes subtipos de canais de cálcio. Meas preferencialmente gravar a partir de células que estão localizadas na proximidade de um determinado eletrodo ⁸ e gravar a partir de células que geram grandes picos de ^9. Métodos de imagem Optical fornecer uma estratégia alternativa para permitir que as gravações simultâneas e independentes de populações inteiras de células que podem ser integrados com as informações obtidas a partir de uma única célula de microeletrodos e remendo gravação de fixação e gravação de MEA. Embora tenham sido empregues as técnicas de imagiologia de cálcio descritos aqui para estudar a dinâmica de cálcio de CGRs, sujeição do emplastro e AAM também podem ser utilizados em paralelo para elucidar as correntes iónicas e propriedades spiking de CGRs.

Tomadas em conjunto, as técnicas estruturais e fisiológicas descritas neste artigo fornecer uma plataforma para o estudo da localização e da contribuição dos VGCCs para o sinal de cálcio no CGR e seus axônios.

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações para o bem-estar dos animais experimentais de emissão da Política de Serviço de Saúde Pública dos EUA em Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório e da Universidade da Califórnia-Los Angeles (UCLA) Comitê de Pesquisa Animal. Foram utilizados Macho e fêmea adultos ratos Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre a idade de 3-5 semanas.

1. Animais e Preparação de tecidos para Wholemount Retina e imunohistoquímica Protocolo

1. Prepare os seguintes materiais e ferramentas: um microscópio de dissecação, 2 pinças com pontas muito finas, tesouras, papel de filtro de celulose, pipeta de plástico e uma lâmina de microscópio.
2. Eutanásia o rato numa câmara fechada por profundamente anestesiar os animais com 1-3% de isoflurano seguido por decapitação com uma guilhotina. Remover os olhos com um par de tesouras e de íris lugar em uma placa de Petri contendo a solução extracelular. Hibernate A, Ames-medium ou soluções fisiológicas são recomendados.
3. [Etapa opcional se aterro de CGR com Fluo-4 é desejado]. Realizar a rotulagem de Fluo-4, conforme descrito no 2,3-2,4 passos.
4. Utilizando o microscópio de dissecação (intensidade de luz: 1,6 x 10 ⁸ fotões / mm ² ⋅sec), remover a córnea cortando a parte dianteira do globo ocular. Retirar a lente e vítreo a partir da superfície interior da retina com uma pinça. Para remover o vítreo, estabilizar o globo ocular, mantendo a esclera firmemente com uma pinça. Descascar delicadamente a base vítrea para o centro da retina com a outra pinça. A preparação nesta fase é chamada a ocular, a qual é usada para criocortes. Mais detalhes sobre criocortes podem ser encontradas em referências ^14,15.
5. Retire a retina do ocular. Em seguida, faça quatro cortes para permitir a retina para colocar o plano. Gentilmente montar a retina numa lâmina de microscópio com o fotorreceptor camada de cima. Adicionar uma gota de solução para a retina e colocar cepapel de filtro llulose na retina. Uma vez que a retina atribui ao papel de filtro, colocar a retina para trás em solução. Se necessário, achatar a retina com uma escova ou uma pinça.
6. Coloque as retinas wholemounted em PFA 4% por 10-15 min para fixação.
7. Lavam-se as retinas wholemounted três vezes durante 30 min em tampão fosfato 0,1 M (PB), pH 7,4. Bloquear as retinas com 5% de soro normal de cabra ou soro de burro em PB 0,1 contendo 0,3% de Triton X-100 a 0,1% e NaN ₃ a 4 ° C durante a noite. Recomendamos um volume final de 500 mL para todas as etapas para salvar soluções de bloqueio e anticorpos.
8. No dia seguinte, incubar as wholemounts retinas com os anticorpos primários 5-7 dias a 4 ° C. As diluições ótimas deve ser determinado pelo usuário.
9. Lava-se a retina 3 x 30 min em 0,1 M PB e incubar durante a noite a 4 ° C, em que o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo correspondente que é dirigido contra a espécie de anticorpo primário (concentração de 1: 1000).
10. Após três lavagens final de 30 min cada um com PB, montar as retinas em meio de montagem. Vedar as lamelas com unha polonês para o armazenamento prolongado. Armazene as amostras a 4 ° C e proteger da luz.

2 Rotulagem de células ganglionares e axônios Rat Wholemount Retinas com Cálcio Indicador Dye

1. Preparar 1000 ml de Ringer de mamífero contendo (em mM) 125 de NaCl, 3 de KCl, 2 _CaCl2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 1 de _MgCl2, 25 de _NaHCO3, 10 de glucose e borbulhado com 95% _{de O2} / 5% de CO ^­ _2.
2. Efectuar a dissecção como descrito no 1,2-1,4 passos.
3. Para carregar as células ganglionares da retina (RGCs) e seus axónios com um corante indicador de cálcio, injectar 0,5 ul de Fluo-4 sal pentapotássio (40 mM em H ₂ O) para o coto do nervo óptico de cerca de 1 mm posterior ao globo ocular, utilizando uma seringa . Para medir um aumento dinâmico em células ganglionares da [Ca2 ⁺ ] _i um indicador com elevada afinidade, tais como Fluo-4 com o seu K _d de 345 nM, é óptima. Fluo-4 oferece a vantagem adicional de possuir uma elevada eficiência quântica, resultando num aumento das emissões de> 100 vezes quando ligado ao cálcio.
4. Coloque a ocular no borbulhar com 95% _{de O2} / 5% de CO de Ringer de mamífero ^­ _2, durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro.

3. Cálcio imagem Protocolo de células ganglionares da retina e axônios.

1. Remover o olho, da lente e vítreo, tal como descrito nos passos 1,1-1,4. Isolar a retina do ocular e divida em quadrantes. Montagem lado de células ganglionares um quadrante se numa lâmina de vidro e usar uma grade fatia harpa para estabilizá-la. Mantenha as outras peças escuro adaptado em aeradas com 95% _{de O2} / 5% CO mamíferos de Ringer ^­ ₂ em gelo para posterior utilização.
2. Superfuse a câmara grava com solução de Ringer e mamíferosmanter a solução borbulhar continuamente com 95% _O2 / 5% de CO _2.
3. Imagem do tecido sob o microscópio. Realizar experiências à temperatura ambiente (~ 23 ° C), ou atingir temperaturas fisiológicas por aquecimento da fase, o aquecimento do banho de água por baixo da amostra, ou a aplicação de ar quente para a superfície do espécime.
   Nota: É importante notar que muitas funções celulares são regulados pela temperatura, que desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase intracelular ^16. No entanto, a introdução de medidas de aquecimento pode aumentar a taxa de fotodegradação, a evaporação do desvio médio e foco causada pela expansão térmica ^17. Utilização de temperatura ambiente diminui compartimentalização intracelular de Fluo-4 ^18.
4. Executar um controlo de dois de K ⁺ pulsos emparelhados elevados na ausência de drogas. Despolarizar RGCs e RGC axónios através do aumento da [K ^+] _o de 3 mM a 60 mM durante 33 segundos, durante cada pulso para activarVGCCs com um sistema de superfusão impulsionado oito gravidade canal. Reduzir o Na ⁺ por 57 mM para manter isosmolarity na solução de elevado K ^+.
5. Avaliar a contribuição de diferentes VGCCs ao sinal de cálcio com o uso de bloqueadores dos canais de Ca gerais ou específicas. Por exemplo, a redução no sinal de cálcio após a administração de um bloqueador do canal de cálcio não-específica, o cobalto, fornecida uma medida semi-quantitativa da contribuição dos VGCCs ao sinal -evoked cálcio de K ⁺ elevado.
6. Adquirir os valores de intensidade de fluorescência através da colocação de uma região de interesse (ROI) em torno das CGR de interesse (Figura 2).
7. Normalizar a mudança na intensidade de fluorescência produzida pelo segundo pico de K ⁺ elevado para a alteração produzida por o primeiro pico de K ⁺ elevado. Em seguida, para o teste de bloqueadores dos canais de cálcio específicos, aplicar drogas apenas durante o segundo pulso de K ⁺ elevado de um par e normalizar este pico contrao primeiro valor de pico. Para medir o efeito do fármaco sobre a K ⁺ elevado pico, dividir a amplitude do segundo pico de K ⁺ pelo que a do primeiro. A análise deve ser executada em estes valores em relação aos seus controlos correspondentes derivados de K ⁺ elevado emparelhado picos medidos na ausência de fármaco.
8. Adquira imagens em intervalos de 5 seg. Para evitar a foto-branqueamento, manter o laser de excitação o mais baixo possível. Fornecer excitação pela linha 488 nm do laser de árgon, enquanto o tubo fotomultiplicador recolhe a emissão de fluorescência através de um filtro PB de 505 nm.

Imunomarcação com anticorpos específicos proporciona uma plataforma para o estudo da localização de proteínas de interesse particular na retina e na técnica de imagiologia de cálcio permite o estudo da contribuição dos VGCCs para a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axónios.

Ao utilizar um anticorpo contra as células ganglionares RBPMS proteína (proteína de ligação de ARN com splicing múltipla) que rotula selectivamente CGRs ^19, fomos capazes de demonstrar que a rotulagem de Fluo-4 está limitada a células ganglionares (Figura 1). Stump-injeção não leva à rotulagem de todas as células ganglionares como pode ser antecipada a partir dessa técnica.

Um anticorpo policlonal de coelho foi produzido contra o N-terminal do polipeptídeo RBPMS (RBPMS _4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, por um fornecedor comercial (Tabela 1). RBPMS é altamente conservada entre mamíferos e a sequência polipeptídica utilizada para a imunização é idêntico no ratinho, rato, macaco e humano (NCBI Protein Bank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). Os soros dos coelhos após imunização foi recolhido e purificado por afinidade utilizando uma coluna de afinidade de polipéptido RBPMS. O anticorpo purificado por afinidade foi mostrado para imunocoloração de células ganglionares da retina de rato e ratinho. Para avaliar a especificidade da imunocoloração RBPMS, um controlo de pré-absorção foi realizada com o anticorpo de coelho. Resumidamente, o anticorpo RBPMS foi diluída em PB 0,1 M contendo 0,5% de Triton X-100 e mistura-se com o polipéptido RBPMS a uma concentração final de 1 ug / ml durante 2 horas à temperatura ambiente. Nenhuma imunocoloração RBPMS estava presente em secções de tecido foram incubadas com os anticorpos de coelho pré-absorvido para RBPMS e transformados por meio de técnicas de imuno-histoquímica padrão.

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Figura 1: imunocoloração post-hoc com anticorpos contra as proteína RBPMS RGC (vermelho) para mostrar Fluo-4 (verde) de localização para as células ganglionares Uma Alexa 568 anti-coelho de cabra de anticorpo secundário foi utilizado.. Barra de escala: 20 mm.

Técnicas de imagem de cálcio são usados ​​para estudar a contribuição das VGCCs ao sinal de cálcio nas CGR e seus axónios. Os valores de intensidade de fluorescência foram adquiridos através da colocação de ROIs nas CGRs de interesse (Figura 2).

Figura 2: A fim de adquirir os valores de intensidade de fluorescência, as ROI foram colocados no somata e / ou barra de escala de axónios de células do gânglio:. De 50 mm.

Fluo-4 pentapotássio sal foi utilizado para marcar CGR e seus axónios (Figura 3).

Figura 3: subtipos VGCC que contribuem para a sinalização de cálcio em células do gânglio somata e seus axónios. (A) imagem confocal de uma retina wholemount em níveis basais. RGCs e RGC axónios podem ser vistos marcado com fluo-4. (B) dos sinais fluorescentes a partir de um único somata RGC demonstrando o aumento da intensidade média de fluorescência induzida por pulsos emparelhados de alto-K ⁺ (60 mM) de solução de banho e a redução subsequente no fluorescência na presença de cobalto, durante o segundo impulso. Barra de escala para A: 20 mm.

O sistema Zeiss LM5 Pascal foi criado para capturar imagens a uma taxa de quadros de 5 segundos e cada digitalização full frame levou 1.57 segundos com as regulações utilizadas. Uma área de recolha de 318 um x 318 um foi incluído na região digitalizada de 512 x 512 pixels dando uma área de 0,385 mM ² por pixel. Essas configurações podem variar dependendo da resolução desejada. O sistema usa um laser de Árgon de 25 mW para a excitação a 488 nm. Nós usamos esta linha de 3% de energia. A saturação foi minimizado seleccionando primeiro a menor concentração do corante indicador de cálcio, o que proporcionou as respostas robustas para o estímulo de despolarização e, em seguida, através da redução de ganho de saída. Redução de potência do laser ajudou a evitar a descoloração. Concentração indicador não foi medido. Calibração de imagem não radiométrica é possível com a utilização de ionóforos de cálcio, mas a técnica de aterro pode trabalhar com corantes raciométrica bem. Para determinar a concentração indicador ideal, nós comparamos a mudança evocados despolarização da fluorescência com concentrações injetou-tronco de Fluo-4 que vão 1-40 mM. ROIs circulares e ovais foram desenhada em torno CGR e seus axônios, respectivamente, que apresentaram intensidade de fluorescência estável. CGR e axônios que vagavam defoco devido ao movimento provocado pelo superfusão não foram seleccionadas.

Neste artigo, descrevemos duas técnicas diferentes: 1) Imunohistoquímica para mostrar Fluo-4 de localização para as células ganglionares da retina em wholemounts, e 2) Imagem de cálcio para analisar a dinâmica de cálcio em células ganglionares da retina e seus axônios.

A imuno-histoquímica utilizando wholemounts foi usado para revelar a localização de proteínas no roedor retina ^20-23. No entanto, existem algumas limitações. A qualidade da coloração depende muito da capacidade do anticorpo para reconhecer o seu respectivo antigénio e a sua capacidade para penetrar no tecido da retina para a camada de interesse particular. Estes problemas podem ser melhorados através do aumento do período de incubação em que o anticorpo primário por até sete dias, aumentando a concentração de Triton-X e / ou a incubação da retina sem o papel de filtro para permitir a difusão do anticorpo através da camada de células ganglionares e os fotorreceptores. Outra limitação é a duratie na concentração de fixação. Alguns anticorpos funcionam melhor quando o tecido é fixado, durante uma hora, enquanto outros anticorpos requerem um período de fixação mais curtos. Da mesma forma, enquanto alguns anticorpos funcionam melhor em 4% PFA fixação, outros trabalham melhor em concentrações reduzidas. É recomendável que o utilizador determinar a duração óptima e da concentração de fixação, a duração de incubação, a concentração de Triton-X, bem como a concentração do anticorpo primário para resultados óptimos.

Imagem de cálcio foi utilizado para estudar a dinâmica de cálcio em células ganglionares da retina e seus axônios. Superfusão de agentes bloqueadores VGCC permitiu a avaliação da eficácia relativa do bloqueio das drogas e na presença de diferentes subtipos de canais de Ca. No caso de CGRs e axónios não respondem a K ⁺ elevado, tentar reduzir a concentração do corante indicador de cálcio, como concentrações elevadas podem levar a uma saturação. Remoção incompleta do vítreotambém pode agir como uma barreira, impedindo alto K ⁺ de alcançar as CGR e seus axônios. Além disso, a falha da montagem adequada harpas no topo da retina pode causar o movimento, o que resulta numa incapacidade para adquirir os valores de intensidade de fluorescência. Se a retina continua a se mover, retire cuidadosamente a harpa, secar a área em torno da retina e voltar a montar a harpa, adicionando mais gordura para seu perímetro. A remoção completa do movimento do vítreo e mínima do wholemount retina é crucial para o sucesso da experiência.

Os agonistas dos receptores de glutamato de cálcio-permeável expressas por CGRs, tais como N-metil-D-aspartato (NMDA), ^24,25 α amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propionato (AMPA) e do tipo cainato Os receptores de glutamato ionotrópicos ^26-29, pode ser usado para provocar a entrada directa de cálcio, bem como proporcionar um estímulo que activa VGCCs despolarizante. A utilização de tais agonistas pode conduzir a um produto nãoresposta -uniform devido à expressão diferencial dos subtipos de receptores de glutamato para os diferentes tipos de CGRs. Microscopia de dois fotões podem também ser utilizados para investigar os sinais de cálcio evocado-luz em CGRs ³⁰ e suas dendrites ^31.

Marcação selectiva de CGR foi conseguida devido às propriedades de membranas impermeabilizantes do corante indicador de cálcio Fluo-4 sal pentapotássio. Corantes indicadoras de cálcio dextrano conjugado também têm sido utilizados para etiquetar selectivamente CGR e seus axónios através de injecções intra-retinianas coelho em ³² e ³³ de rato. Em ambos os estudos, a marcação selectiva de CGR e seus axónios foi conseguida através de injecções intra-retinianas do corante indicador de cálcio dextrano conjugado, seguido de uma incubação de 2 h em ³² de coelho ou de uma incubação de 7 horas em ³³ de rato. Apesar de proporcionar um período de incubação suficiente para garantir a rotulagem uniforme na retina, estes métodos resultam num aumento da marcação das CGR e os seusaxônios mais próximas do local da injeção em relação à rotulagem escassa nas regiões distais ao local da injeção. Como discutido em Baldrige (1996), rotulagem não uniforme no local de injecção tem sido atribuída a rotulagem de difusão do soma, como resultado da absorção do corante para o (corte) dendrito exposta, enquanto a rotulagem em regiões distais é provavelmente devido a um transporte retrógrado de absorção do corante no axônio expostos ^32. A nossa técnica fornece métodos melhorados para aumentar a marcação uniforme das CGR e seus axónios e para minimizar o período de incubação.

O método de carregamento de corante presente proporciona uma estratégia alternativa com técnicas convencionais, tais como a carga a granel e electroporação que resultam em carga não específica de células amácrinas deslocadas na camada de células ganglionares. Com a disponibilidade de linhas de ratinhos transgénicos que expressam tdTomato ou EGFP sob o controlo de promotores que estão em populações específicas de células ganglionares ^34-38, applicati futurasons desta técnica pode incluir estudos de imagem de cálcio de subtipos de células ganglionares da retina específicas.

Os autores não têm divulgações.

Agradecemos ao Dr. S. Stella e Helen Vuong para contribuições para o protocolo de imagem de cálcio. Agradecemos Sheets Dr. K. para filmar as cenas de entrevista. Agradecemos ao Dr. Arlene Hirano por seus comentários sobre o manuscrito. Este projeto de pesquisa e desenvolvimento foi realizado pelos autores na Geffen de Medicina David na UCLA e é possível graças a um acordo de contrato que foi concedido e administrado pela Research & Material Médico Comando do Exército dos EUA (USAMRMC) ea Telemedicina e Tecnologia Avançada Centro de Pesquisa (TATRC), em Fort Detrick, Maryland sob Número do Contrato: W81XWH-10-2-0077. O suporte para esses estudos também vieram NIH EY04067 e uma revisão Mérito VA (NB). BCN é uma VA Carreira de Investigação Scientist.