Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

Immunoistochimica protocolli sono utilizzati per studiare la localizzazione di una specifica proteina nella retina. Tecniche di imaging di calcio sono impiegate per studiare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.

In questo documento si descrivono gli strumenti, reagenti, e le misure pratiche che sono necessarie per: 1) preparazione di successo di retine wholemount per immunoistochimica e, 2) Calcio Imaging per lo studio di tensione gated canali del calcio (VGCC) mediata segnalazione di calcio in retina cellule gangliari. Il metodo di imaging del calcio descriviamo questioni aggira in materia di non-specifico carico di cellule amacrine sfollati nello strato di cellule gangliari.

Cellule gangliari retiniche (RGC) esprimono L, N-, P / Q e T-tipo VGCC come determinato attraverso il blocco farmacologico di queste componenti della cellula intera Ca canale corrente ^1,2. VGCC sono proteine ​​transmembrana multimerici che sono coinvolte nel rilascio del trasmettitore, la trascrizione del gene, regolazione cellulare e sinaptica plasticità ^3,4,5. VGCCs funzionali sono costituiti da almeno tre classi distinte di subunità: grandi, transmembrana α ₁ formano pori subunità che stabiliscono proprietà biofisiche e farmacologiche del canale, α ausiliario principalmente extracellulare ₂ subunità δ e subunità β intracellulari. Gli ultimi due complessi di forma eteromerici con diverse subunità α ₁ e alterano la cinetica gating e il traffico dei canali alla membrana plasmatica ^6.

Negli ultimi decenni, molte tecniche sono state impiegate per lo studio delle proteine ​​espresfissione, come la immunoistochimica, enzyme-linked test immunoenzimatico, analisi occidentale e citometria a flusso. Queste tecniche richiedono l'uso di anticorpi specifici per l'individuazione di una data proteina di interesse e forniscono strumenti potenti per la localizzazione e la distribuzione di proteine ​​specifiche nei diversi tessuti. Le tecniche utilizzate per rilevare e quantificare i livelli di espressione di mRNA di una particolare proteina come l'analisi Northern blot, RT-PCR, real-time RT-PCR, ibridazione in situ, cDNA microarray e analisi di protezione della ribonucleasi forniscono un approccio alternativo quando gli anticorpi non sono facilmente livelli di espressione disponibile o se di una particolare proteina sono bassi ^7. Tuttavia, una limitazione all'uso di tali tecniche molecolari è l'identificazione desiderata della sequenza genica.

Per localizzare proteine ​​nella retina, immunoistochimica può essere eseguita su retine wholemount. A causa della accessibilità dei RGCs, la wholemountpreparazione fornisce una piattaforma eccellente per studiare la localizzazione di specifiche proteine ​​al somata RGC e dei loro assoni.

Oltre alla loro localizzazione, alcune proprietà funzionali dei VGCCs in RGC sono evidenziabili attraverso l'uso di tecniche di imaging calcio. Descriviamo un protocollo di imaging del calcio di etichettare selettivamente RGCs con un indicatore di calcio colorante per misurare la dinamica del calcio intracellulare. Il contributo di diversi VGCCs al segnale calcio in differenti compartimenti cellulari può essere isolata con l'uso di specifici del sottotipo Ca bloccanti dei canali.

Forse uno degli aspetti più positivi della tecnica di imaging del calcio qui descritta è la capacità di registrare simultaneamente e indipendentemente da più RGCs e dei loro assoni. Anche se molte tecniche fisiologiche, come ad esempio intera registrazione patch clamp cellulare, forniscono ad alta risoluzione temporale registrazioni delle correnti di membrana, il somatico o fonte assonale di thesE le correnti registrate non possono essere discriminati e registrazioni possono essere effettuate solo da un singolo neurone alla volta. Array multielettrodico (MEA) sono in grado di registrare simultaneamente punte da molte cellule, ma possono né rilevare né discriminare l'attivazione di, ad esempio, diversi sottotipi di canali del calcio. MEAS preferenzialmente registrare da cellule che si trovano in prossimità di un dato elettrodo ⁸ e registrare da cellule che generano grandi picchi ^9. Metodi di imaging ottici forniscono una strategia alternativa per consentire le registrazioni simultanee e indipendenti di intere popolazioni di cellule che possono essere integrate con le informazioni ottenute da microelettrodo singola cellula e la registrazione patch clamp e la registrazione MEA. Sebbene le tecniche di imaging del calcio qui descritti sono stati impiegati per studiare la dinamica del calcio di RGCs, patch clamp e MEA può essere utilizzato anche in parallelo per chiarire ulteriormente le correnti ioniche e spiking proprietà dei RGCs.

Nel loro insieme, le tecniche strutturali e fisiologiche descritte in questo articolo fornire una piattaforma per studiare la localizzazione e il contributo delle VGCCs al segnale calcio nel RGCs e dei loro assoni.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per il benessere degli animali da esperimento emesse dalla politica US Public Health Service on Human Care e uso di animali da laboratorio e la University of California-Los Angeles (UCLA) comitato per la ricerca degli animali. Sono stati utilizzati Maschio e femmina adulto ratti Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) tra l'età di 3-5 settimane.

1. animali e tessuti Preparazione Wholemount Retina e Immunoistochimica protocollo

1. Preparare i seguenti materiali e strumenti: un microscopio da dissezione, 2 pinze con punte molto fini, forbici, carta da filtro di cellulosa, pipetta di plastica e un vetrino da microscopio.
2. Euthanize il topo in una camera chiusa da anestetizzare profondamente l'animale con il 1-3% isoflurano seguita da decapitazione con una ghigliottina. Rimuovere gli occhi con un paio di forbici iris e posto in una capsula di Petri contenente la soluzione extracellulare. Hibernate A, Ames Mesono raccomandati dium o soluzioni fisiologiche.
3. [Passo Facoltativo se riempimento di RGCs con Fluo-4 è desiderato]. Eseguire l'etichettatura Fluo-4 come descritto nei passaggi 2,3-2,4.
4. Utilizzando il microscopio da dissezione (intensità della luce: 1,6 x 10 ⁸ fotoni / mm ² ⋅sec), rimuovere la cornea tagliando la parte anteriore del bulbo oculare. Rimuovere la lente e vitreo dalla superficie retinica interna con una pinza. Per rimuovere il vitreo, stabilizzare il bulbo oculare tenendo la sclera saldamente con una pinza. Rimuovere delicatamente la base del vitreo verso il centro della retina con l'altra pinza. La preparazione in questa fase si chiama oculare, che viene utilizzato per criosezioni. Maggiori informazioni su criosezioni possono essere trovati nei riferimenti ^14,15.
5. Rimuovere la retina dalla oculare. Quindi, fare quattro tagli per consentire la retina per distesi. Montare delicatamente la retina su un vetrino da microscopio con il fotorecettore livello verso l'alto. Aggiungere una goccia di soluzione alla retina e mettere cecarta da filtro llulose sulla retina. Una volta che la retina si attacca alla carta da filtro, posizionare la retina posteriore in soluzione. Se necessario, appiattire la retina con una spazzola o pinze.
6. Posizionare le retine wholemounted in PFA 4% per 10-15 minuti per il fissaggio.
7. Lavare le retine wholemounted tre volte per 30 min in tampone fosfato 0,1 M (PB), pH 7.4. Bloccare le retine con il 5% di siero di capra normale o siero asino in 0,1 PB contenente 0,3% Triton X-100 e 0,1% NaN ₃ a 4 ° C durante la notte. Si consiglia un volume finale di 500 ml per tutti i passi per salvare le soluzioni di blocco e anticorpi.
8. Il giorno dopo, incubare le wholemounts retine con le primarie di anticorpi 5-7 giorni a 4 ° C. Diluizioni ottimali devono essere determinati dall'utente.
9. Lavare le retine 3 x 30 min in PB 0.1 M e incubare una notte a 4 ° C nel corrispondente anticorpo secondario fluoroforo coniugato diretto contro le specie del anticorpo primario (concentrazione 1: 1.000).
10. Dopo tre lavaggi finali di 30 minuti ciascuno con PB, montare le retine di mezzo di montaggio. Sigillare il coprioggetto con smalto per lo stoccaggio prolungato. Conservare i campioni a 4 ° C e proteggere dalla luce.

2 Etichettatura delle cellule gangliari e degli assoni in Rat Wholemount retine con un calcio colorante indicatore

1. Preparare 1.000 ml di mammiferi Ringer contenente (in mM) 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 1 _MgCl2, 25 _NaHCO3 e 10 glucosio bolliti con 95% O _2/5% di CO ^­ _2.
2. Eseguire la dissezione, come descritto nella procedura 1.2-1.4.
3. Per caricare le cellule gangliari retiniche (RGC) e dei loro assoni con un indicatore di calcio colorante, iniettare 0,5 ml di Fluo-4 sale pentapotassico (40 mM magazzino in H ₂ O) nel moncone del nervo ottico di circa 1 mm posteriormente al bulbo oculare con una siringa . Per misurare gli aumenti dinamici in cellule gangliari [Ca ^{2 +} ] _ho un indicatore con alta affinità, come Fluo-4 con il suo K _d di 345 nm, è ottimale. Fluo-4 offre l'ulteriore vantaggio di avere una altissima efficienza quantica con un conseguente aumento delle emissioni di> 100 volte quando si lega al calcio.
4. Mettere il paraocchi in mammiferi di Ringer bollito con il 95% O _2/5% di CO ^­ ₂ per 1 ora a temperatura ambiente al buio.

3. Imaging di calcio Protocollo per cellule gangliari retiniche e assoni.

1. Rimuovere l'occhio, cristallino e vitreo come descritto nei passaggi 1,1-1,4. Isolare la retina dalla oculare e dividere in quadranti. Mount lato cellule gangliari un quadrante su un vetrino e utilizzare una griglia fetta arpa per stabilizzarlo. Mantenere gli altri pezzi dark-adattato in mammiferi di Ringer bollito con il 95% O _2/5% di CO ^­ ₂ su ghiaccio per un uso successivo.
2. Superfuse camera di registrazione con la soluzione di Ringer e mammiferimantenere la soluzione ribolle continuamente con il 95% O _2/5% di CO _2.
3. Immagine il tessuto al microscopio. Condurre esperimenti a temperatura ambiente (~ 23 ° C) o raggiungono temperature fisiologiche riscaldando il palco, riscaldando il bagno d'acqua sotto il campione o l'applicazione di aria calda sulla superficie del campione.
   Nota: E 'importante notare che molte funzioni cellulari sono regolate dalla temperatura, che svolge un ruolo chiave nel mantenimento dell'omeostasi intracellulare ^16. Tuttavia, l'introduzione di misure di riscaldamento può aumentare il tasso di photobleaching, evaporazione della deriva medio e fuoco causata dall'espansione termica ^17. L'uso della temperatura ambiente diminuisce intracellulare compartimentalizzazione di Fluo-4 ^18.
4. Eseguire un controllo di due K ⁺ impulsi alti appaiati in assenza di farmaci. Depolarizzare RGCs e assoni RGC aumentando la [K ^+] _o da 3 mm a 60 mm per 33 secondi durante ogni impulso per attivareVGCCs con un sistema di superfusione guidato otto gravità canale. Ridurre Na ⁺ da 57 mm per mantenere isosmolarity nella soluzione di elevata K ^+.
5. Valutare il contributo delle diverse VGCCs al segnale di calcio con l'uso di bloccanti generali o specifici del canale Ca. Ad esempio, la riduzione del segnale calcio dopo la somministrazione di un non-specifico bloccante dei canali del calcio, cobalto, purché una misura semi-quantitativa del contributo dei VGCCs all'alta K ⁺ segnale calcio -evoked.
6. Acquisire i valori di intensità di fluorescenza posizionando una regione di interesse (ROI) intorno alle RGC di interesse (Figura 2).
7. Normalizza la variazione di intensità di fluorescenza prodotta dal secondo alta K ⁺ picco alla variazione prodotta dalla prima alta K ⁺ picco. Poi, per la sperimentazione di specifici bloccanti dei canali del calcio, farmaci applicare solo nel corso del secondo alto K ⁺ impulso di una coppia e normalizzare questo picco controil primo valore di picco. Per misurare l'effetto del farmaco in alto K ⁺ picco, dividere l'ampiezza del secondo picco K ⁺ da quella del primo. L'analisi deve essere eseguita su questi valori rispetto ai loro controlli corrispondenti derivati ​​dal accoppiato alta K ⁺ picchi misurata in assenza di farmaco.
8. Acquisire immagini a intervalli di 5 sec. Per evitare foto-sbiancamento, mantenere l'eccitazione laser più basso possibile. Fornire eccitazione dalla linea 488 nm del laser argon, mentre il tubo fotomoltiplicatore raccoglie l'emissione fluorescente attraverso un filtro LP 505 nm.

Immunomarcatura con anticorpi specifici fornisce una piattaforma per studiare la localizzazione di particolari proteine ​​di interesse nella retina e la tecnica di imaging calcio permette lo studio del contributo dei VGCCs verso le dinamiche di calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.

Utilizzando un anticorpo contro le RBPMS proteine ​​delle cellule gangliari (RNA binding protein con splicing multipla) che identifica selettivamente RGCs ^19, siamo stati in grado di dimostrare che l'etichettatura Fluo-4 è limitata alle cellule gangliari (Figura 1). Stump-iniezione non comporta l'etichettatura di tutte le cellule gangliari come potrebbe essere previsto da questa tecnica.

Un anticorpo policlonale di coniglio è stata generata contro l'N-terminale del polipeptide RBPMS (RBPMS _4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, da un fornitore commerciale (Tabella 1). RBPMS è altamente conservata tra i mammiferi e la sequenza di polipeptide usato per l'immunizzazione è identico nel topo, ratto, scimmia e uomo (NCBI Protein Bank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein ). Coniglio sieri sono stati raccolti a seguito di immunizzazione e affinità purificato utilizzando una colonna polipeptide affinità RBPMS. L'anticorpo purificato affinità è dimostrato immunostain cellule gangliari nel topo e nel ratto retina. Per valutare la specificità della immunocolorazione RBPMS, un controllo preassorbimento stato eseguito con l'anticorpo di coniglio. Brevemente, l'anticorpo RBPMS è stato diluito in PB 0.1 M contenente 0,5% Triton X-100 e mescolato con il polipeptide RBPMS ad una concentrazione finale di 1 mg / ml per 2 ore a temperatura ambiente. No immunostaining RBPMS era presente in sezioni di tessuto incubate con gli anticorpi preabsorbed coniglio a RBPMS e trattati con tecniche di immunoistochimica standard.

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Figura 1: immunoistochimica post-hoc con anticorpi contro le proteine ​​RBPMS RGC (rosso) per mostrare Fluo-4 (verde) la localizzazione delle cellule gangliari Un Alexa 568 di capra anti-coniglio anticorpo secondario è stato utilizzato.. Scala barra: 20 mm.

Tecniche di imaging calcio vengono usati per studiare il contributo del VGCCs al segnale calcio nelle RGCs ei loro assoni. Valori di intensità fluorescenti sono stati acquisiti ponendo ROI sulle RGCs di interesse (Figura 2).

Figura 2: Al fine di acquisire valori di intensità fluorescenti, ROI sono stati collocati sul somata e / o assoni Scala bar cellule gangliari.: 50 mm.

Sale Fluo-4 pentapotassico è stato utilizzato per etichettare RGCs e loro assoni (Figura 3).

Figura 3: sottotipi VGCC che contribuiscono alla segnalazione di calcio in somata cellule gangliari e dei loro assoni. (A) immagine confocale di una retina wholemount a livelli basali. RGCs e assoni RGC può essere visto etichettati con fluo-4. (B) segnali fluorescenti da un singolo somata RGC dimostrare l'aumento di intensità media di fluorescenza indotta da impulsi appaiati di alta-K ⁺ (60 mm) di soluzione di balneazione e la successiva riduzione in fluorescenza in presenza di cobalto durante il secondo impulso. Bar Scala per A: 20 mm.

Il sistema Zeiss LM5 Pascal è stato impostato per catturare immagini ad un frame rate di 5 sec e ogni scansione full frame ha preso 1,57 secondi le impostazioni utilizzate. Una area di raccolta di 318 micron x 318 micron è stato incluso nella regione digitalizzata di 512 x 512 pixel dando una superficie di 0,385 micron ² per pixel. Queste impostazioni possono essere variate a seconda della risoluzione desiderata. Il sistema utilizza un laser 25 mW Argon per l'eccitazione 488 nm. Abbiamo utilizzato questa linea a potenza 3%. Saturazione è stato minimizzato selezionando prima la più bassa concentrazione del colorante indicatore di calcio che ha dato le risposte robuste allo stimolo depolarizzante e quindi riducendo il guadagno di uscita. Riduzione della potenza del laser ha contribuito a evitare sbiancamento. Indicatore di concentrazione non è stata misurata. Taratura di imaging non raziometrica è possibile con l'uso di ionofori calcio, ma la tecnica di riempimento può funzionare con coloranti raziometrici pure. Per determinare la concentrazione ottimale indicatore, abbiamo confrontato il cambiamento depolarizzazione evocata in fluorescenza con concentrazioni moncone-iniezione di Fluo-4 che vanno 1-40 mm. ROI circolari e ovali sono stati disegnati intorno RGCs e dei loro assoni, rispettivamente, che mostravano intensità di fluorescenza stabile. RGCs e assoni che scivolò fuorimessa a fuoco a causa di movimenti causati da superfusione non sono stati selezionati.

In questo articolo, abbiamo descritto due diverse tecniche: 1) L'immunoistochimica per mostrare Fluo-4 localizzazione delle cellule gangliari della retina in wholemounts, e 2) Calcio Imaging per analizzare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.

Immunoistochimica utilizzando wholemounts è stato utilizzato per rivelare la localizzazione delle proteine ​​nei roditori retina ^20-23. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni. La qualità della colorazione dipende fortemente dalla capacità degli anticorpi di riconoscere il rispettivo antigene e la sua capacità di penetrare il tessuto retinico al particolare livello di interesse. Questi problemi possono essere migliorate aumentando il periodo di incubazione dell'anticorpo primario fino a sette giorni, aumentando la concentrazione di Triton-X e / o incubando la retina senza la carta da filtro per consentire la diffusione dell'anticorpo attraverso lo strato di cellule gangliari e i fotorecettori. Un altro limite è il duratie sulla concentrazione di fissazione. Alcuni anticorpi funzionano meglio quando il tessuto è fissato per un ora, mentre altri anticorpi richiedono un periodo di determinazione più breve. Allo stesso modo, mentre alcuni anticorpi funzionano meglio in 4% PFA fissazione, altri lavorano meglio a concentrazioni ridotte. Si consiglia l'utente a determinare la durata ottimale e la concentrazione di fissaggio, la durata dell'incubazione, la concentrazione di Triton-X, nonché la concentrazione dell'anticorpo primario per ottenere risultati ottimali.

Calcio Imaging è stato utilizzato per studiare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni. Superfusione di agenti bloccanti VGCC consentito valutazione dell'efficacia blocco relativa dei farmaci e la presenza di diversi sottotipi di canale Ca. Nel caso in cui assoni RGC e non rispondono ad alto K ^+, provare a ridurre la concentrazione dell'indicatore calcio colorante, come concentrazioni elevate possono portare alla saturazione. Rimozione incompleta del vitreopuò anche fungere da barriera, impedendo alto K ⁺ di raggiungere i RGCs e dei loro assoni. In aggiunta, non installate correttamente l'arpa in cima alla retina può causare il movimento, con conseguente incapacità di acquisire valori di intensità di fluorescenza. Se la retina continua a muoversi, rimuovere con attenzione l'arpa, asciugare la zona circostante la retina e rimontare l'arpa con l'aggiunta di più grasso al suo perimetro. La rimozione completa del movimento vitreo e minimale del wholemount retina è cruciale per il successo dell'esperimento.

Agonisti dei recettori del glutammato calcio-permeabile espresse da RGC come N-metil-D-aspartato (NMDA), ^24,25 α amino-3-idrossi-5-methylisoxazole-4-propionato (AMPA) recettori e kainato tipo recettori ionotropici del glutammato ^26-29, possono essere utilizzati per evocare l'immissione diretta di calcio, oltre a fornire uno stimolo depolarizzante che attiva VGCCs. L'utilizzo di tali agonisti può portare ad un nonrisposta Uniform causa della diversa espressione dei sottotipi del recettore glutammato ai diversi tipi di RGC. Microscopia a due fotoni può essere utilizzato anche per studiare i segnali calcio-luce evocata in RGCs ³⁰ e loro dendriti ^31.

Etichettatura selettiva di RGCs è stato raggiunto a causa delle proprietà di membrana impermeant del Fluo-4 sale pentapotassico indicatore calcio colorante. Indicatore di calcio coloranti destrano coniugato sono stati utilizzati anche per etichettare in modo selettivo RGCs e loro assoni attraverso iniezioni intraretinica nel coniglio e nel ratto ^{32 33.} In entrambi gli studi, l'etichettatura selettiva dei RGCs e dei loro assoni è stata ottenuta tramite iniezioni intraretinica dell'indicatore calcio colorante destrano coniugato, seguita da una incubazione di 2 ore nel coniglio ³² o una incubazione 7 ore nel ratto ^33. Nonostante fornendo un adeguato periodo di incubazione di garantire un'etichettatura uniforme nella retina, tali metodi si traducono in una maggiore etichettatura dei RGCs e loroassoni più vicine al sito di iniezione rispetto all'etichettatura sparse nelle regioni distali al sito di iniezione. Come discusso in Baldrige (1996), l'etichettatura non uniforme al sito di iniezione è stato attribuito l'etichettatura diffusionale del soma come risultato di colorante captazione alla vista (taglio) dendrite, mentre l'etichettatura nelle regioni distali è probabilmente dovuto al trasporto retrogrado dalla captazione del colorante al assone esposto ^32. La nostra tecnica fornisce i metodi migliorati per aumentare un'etichettatura uniforme dei RGCs e dei loro assoni e per ridurre al minimo il periodo di incubazione richiesto.

L'attuale metodo di tintura di carico offre una strategia alternativa alle tecniche convenzionali come carico alla rinfusa e elettroporazione che si traducono in non specifico carico di cellule amacrine sfollati nello strato delle cellule gangliari. Con la disponibilità di linee di topi transgenici che esprimono tdTomato o EGFP sotto il controllo di promotori che si trovano in specifiche popolazioni di cellule gangliari ^34-38, Applicaz futurions di questa tecnica possono includere studi di imaging calcio di specifici sottotipi di cellule gangliari retiniche.

Gli autori non hanno informativa.

Ringraziamo il Dr. S. Stella e Helen Vuong per contributi al protocollo di imaging del calcio. Ringraziamo Fogli Dr. K. per girare le scene di intervista. Ringraziamo il Dr. Arlene Hirano per i suoi commenti sul manoscritto. Questo progetto di ricerca e sviluppo è stata condotta da presso la David Geffen School of Medicine presso la UCLA autori ed è reso possibile da un accordo di contratto che è stato assegnato e gestito dal Medical Research e Materiel Command dell'Esercito degli Stati Uniti (USAMRMC) e la Telemedicina & Advanced Technology Research Center (TATRC), a Fort Detrick, nel Maryland sotto Numero del contratto: W81XWH-10-2-0077. Il supporto per questi studi è arrivato anche dal NIH EY04067 e una recensione Merito VA (NB). BCN è un VA Career Research Scientist.