Análises população de células da pele Durante Carcinogênese

Carcinogênese é um processo que envolve as interações entre células cancerosas e microambiente do câncer. Para dissecar os eventos moleculares, é necessário para isolar populações de células diferentes em diferentes estágios durante o desenvolvimento do cancro. Usando um modelo de rato para o carcinoma basocelular, nós descrevemos um protocolo para análises celulares durante a carcinogênese.

O cancro é o desenvolvimento de um processo de múltiplas etapas, envolvendo vários tipos de células, incluindo células cancerosas precursoras, células imunes, fibroblastos e células endoteliais. Cada tipo de células sofre de sinalização e alterações funcionais durante a carcinogénese. O desafio atual para muitos pesquisadores de câncer é dissecar essas mudanças em cada tipo de célula durante o processo de várias etapas in vivo. Nos últimos anos, os autores desenvolveram um conjunto de procedimentos para isolar populações diferentes de células durante o desenvolvimento do câncer de pele usando K14creER/R26-SmoM2 camundongos ^YFP. O procedimento é dividido em seis partes: 1) gerar ratos adequados para o estudo (K14creER ⁺ e R26-SmoM2 ^{YFP +} camundongos neste protocolo), 2) indução SmoM2 expressão ^YFP na pele do rato, 3) preparando biópsias da pele do rato; 4) isolar epiderme da pele; 5) preparar uma única célula de epiderme; 6) rotulagem populações de células individuais para análise de citometria de fluxo.Geração de número suficiente de ratos com o genótipo direito é o passo limitante neste protocolo, o que pode levar até dois meses. O restante das etapas demorar algumas horas até alguns dias. Dentro deste protocolo, que também incluem uma seção para solucionar problemas. Apesar de se concentrar sobre o câncer de pele, este protocolo pode ser modificado para se candidatar a outros modelos animais de doenças humanas.

Como o tipo mais comum de câncer humano, carcinoma basocelular (CBC) afeta cerca de 2 milhões de americanos por ano ^1. Evidências indicam que a ativação anormal de hedgehog (hh) de sinalização é a força motriz subjacente desenvolvimento BCC (Avaliado em ^2,3). Alterações de sinalização Hh em CBCs incluem mutações inativadoras de PTCH1 ^4-6, mutações de função ganho de SMO ^7-9 e expressão aberrante de Hh via fatores de transcrição Gli1 ¹⁰ e Gli2 ¹¹ ou raras mutações inativados do Su regulador negativo (Fu ) ^12. Através de todos estes e outros estudos, a Federal Drug Administration (FDA) aprovou recentemente o uso de inibidor de sinalização Hh Vismodegib para tratar localmente avançado e metastático CBCs ^13-15.

Apesar de todas essas conquistas ^{de 16,} nós ainda não entendemos os mecanismos celulares e moleculares pelos quais Hh sinalização dirige carcinogenesis. Estabelecer modelos animais usando a ativação de tecidos específicos de sinalização Hh ainda é importante para os estudos e para a nossa compreensão da resistência às drogas. Em ratos, camundongos selvagens não desenvolvem CBCs, mesmo sob altas doses de substâncias cancerígenas, a radiação UV ou ionizante. Em contraste, Ptch1 ^{+ / -} murganhos são susceptíveis ao desenvolvimento de BCC ^17,18. A penetrância de desenvolvimento BCC em Ptch1 ^{+ / -} ratos é superior a 50%, embora Ptch1 ^18,19 + / - camundongos raramente desenvolvem CBCs adultas se mantido em condições normais. Devido à letalidade embrionária de Ptch1 ^{- / -,} ko específica de tecido de PTCH1 é geralmente utilizada para o estudo ^{de 20.} Além disso, condicional expressão específica de pele de oncogênico SmoM2 ^YFP (KRT14-creer: R26-SmoM2 ^YFP ou KRT14-cre: R26-SmoM2 ^YFP) leva à formação de múltiplos CBCs microscópicas em uma idade muito precoce, proporcionando uma análise genética fácil para hh sinalização fazerwnstream de SMO ^21.

Há três questões importantes em nosso conhecimento da biologia BCC. Primeiro, a origem celular dos CBCs não está totalmente claro. Embora alguns estudos suportam a ceder do folículo de cabelo como o local de célula estaminal ^22-24, Youssef et al. ²⁵ localizada na célula de origem murina de tumores cutâneos Hh orientadas para a epiderme na região inter-folicular, e não no folículo piloso , utilizando Cre específica de células para activar a expressão de um Rosa26 orientada transgénico mutante SMO. Em segundo lugar, as interacções celulares durante o desenvolvimento BCC não são bem compreendidos. Sabe-se que os queratinócitos activada com Hh sinalização podem levar à formação de BCC, mas outras alterações celulares não são bem compreendidos. Além disso, o tratamento de antagonistas de Smo em ratinhos pode conduzir a resistência aos fármacos ^26-28. São bastante necessárias, assim, novos alvos para BCC. Entender essas três questões requer análises de alterações celulares em camundongos durante carcinogenesis. Embora vários métodos têm sido publicados para a cultura de queratinócitos, citometria de fluxo e isolamento de células-tronco da pele ^29-31, atualmente não há procedimentos completos para análise de células em CBCs do mouse. Através da combinação de métodos para o modelo do rato de CBCs, a separação da epiderme, a geração de células isoladas do tecido e análises celulares, vamos proporcionar aos leitores um conjunto de procedimentos para estudar a sinalização celular, celular e interações moleculares durante o desenvolvimento do BCC. Nós acreditamos que este protocolo vai permitir que os leitores para ver como cada procedimento é realizado. Além disso, nós fornecemos alguns dados para ilustrar o que o resultado deve ser semelhante, e solução de problemas para ajudar os leitores a superar as dificuldades durante a realização desses procedimentos.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê IACUC na Indiana University School of Medicine.

1. Gerar Ratos com genótipos Corrigir

1. Estabelecer um modelo de mouse CBCs. Companheiro camundongos K14-Creer (Jackson laboratório estoque número 005107) com R26-SmoM2 camundongos ^YFP (Jackson laboratório estoque número 005.130) (18) para gerar K14-creer + e R26-SmoM2 ^{YFP +} camundongos.
2. Realizar genotipagem. Imergir cauda espécimes (0.5 cm de comprimento) em solução de lise directPCR cauda com 1 mg / ml de proteinase K a 55 ° C durante a noite com agitação. No dia seguinte, remover os detritos do tecido por meio de centrifugação à velocidade máxima numa micro-centrifuga (para manter o sobrenadante para determinação do genótipo). Use 1 ul do sobrenadante de cada reacção de PCR com os iniciadores e as condições recomendadas pelo fornecedor. Selecione os ratos com os genótipos direita (na idade de 3-6 semanas, a buprenorfina em 0,05-0,1 mg / kg serão aplicados via SQ cada 8-12 horas por 2-3 dias depois de cauda snip) for passo 2.

2. Induzem a expressão de queratinócitos da pele em SmoM2

Induzir SmoM2 expressão em queratinócitos por administração oral de tamoxifeno (5 ug / kg de peso corporal em 50 ml de óleo vegetal em cada mamada) durante 5 dias consecutivos por meio de sonda oral com uma agulha de alimentação (curva de calibre 20).

3. Preparando-se amostras de pele

Em geral, os fenótipos são mais graves na orelha e da cauda em ratinhos K14creER/R26SmoM2 ^GFP. Para se preparar para análises celulares, primeiro colher a pele do rato após o sacrifício animal com um procedimento aprovado institucional (CO ₂ mais deslocamento cervical).

4. Isolando Epiderme

1. Depois de camundongos sacrifício com um procedimento aprovado (ver passo 3), retire pele usando um aparador. Amostras de pele imerso em solução de dispase (5 mg / mL em DMEM com FBS a 10%) a 37 ° C durante 1-2 horas (1 hora para ratinhos menos de 8 semanas de idade e 2 hrem ratinhos de 8 semanas de idade).
2. Após o tratamento com dispase, a epiderme separada da derme por meio de fórceps.

5. Gerar células individuais

1. Para a obtenção de população celular única, tritura a epiderme com a tesoura e em seguida imerso em solução de colagenase IV (1 mg / mL em DMEM com FBS a 10%) durante 1-2 horas a 37 ° C em um tubo de 50 ml. Tente rode suavemente os tubos a cada 20 minutos para ajudar a dissociação celular.
2. Inspecione dissociação celular sob microscópio. Quando as células individuais podem ser detectados no meio de colagenase, incubar a amostra durante um adicional de 30 minutos para aumentar o rendimento das células. Em geral, a epiderme de um ratinho pode produzir até 10 ⁷ células.
3. Filtrar a mistura de tecidos através de filtro de células (tamanho dos poros de 70 mm), as células de spin para baixo a 1.500 rpm via bancada centrifugação, e lavar uma vez o tempo com PBS.

6. Células rótulo e realizar análises Citometria de Fluxo

1. Ressuspender as células em 10% de FBSem PBS a 2,5 x 10 ⁶ células / ml para bloquear a ligação não específica (em gelo durante 30 min)
2. Tomar uma aliquota de células para cada um dos microtubos de 1,5 ml para a rotulagem de anticorpos específicos. Adicionar anticorpos diferentes para cada tubo para uma concentração final de 2 ug / ml. Misturar as células com anticorpos através de um vértice suave durante vários segundos e deixar em gelo durante 30 minutos, depois lava-se com 1 ml de PBS. Para amostras de CBC, foram utilizados os seguintes anticorpos para biomarcadores: CD11b-PE mais Gr1-APC (células mielóides ou células supressoras derivadas de mielóide), vimentina-FITC (fibroblastos) (ver reagentes para detalhes).
3. Para a coloração intracelular, usamos um kit e siga o manual do fornecedor (ver Reagentes para detalhes). Usamos as células frescas de analisar marcadores de superfície celular. Após a coloração do marcador de superfície, lavar as células e ressuspender-los em PBS. Adicionar DAPI à mistura de células, a uma concentração final de 1 ug / ml. DAPI vai manchar as células mortas, que será fechado a partir de análises posteriores.
4. Analisar os dados com especificaçõessoftware c. Primeiro, escolha uma única célula com base na FSC vs SSC enredo e usar DAPI populacional negativo (células vivas), para posterior análise.

Sabe-se que os ratos que não desenvolvem carcinomas basocelulares, excepto com a activação de sinalização Hh. Figura 1 mostra o fenótipo da pele após indução da expressão oncogénica smoothened, SmoM2 ^YFP. Figura 2 mostra a análise de células mielóides em ratinhos normais e portadores de tumor. Células CD11b ⁺ Gr1 ⁺ são derivadas de células mielóides, e alguns deles estão mielóide células supressoras derivadas. Em situação normal, o CD11b ⁺ Gr1 ⁺ população de células é dificilmente detectável, mas vai aumentar em resposta a inflamação ou o desenvolvimento do tumor. Nós mostramos que a expressão induzida de SmoM2YFP na pele resulta num aumento nas células CD11b ⁺ Gr1 ^+. Atualmente, os mecanismos moleculares subjacentes a esta mudança na CBCs não são claras.

Figura 1. Morphological alterações após a indução SmoM2YFP na pele do rato. parte superior mostra um diagrama de genótipos do mouse. O painel do meio: a ⁺ K14creER e R26-SmoM2 ^{YFP +} ratinho tratado com tamoxifeno mostraram grosseiramente anormalidade na pele (à direita), bem como tumores de pele na secção H & E (esquerda). O painel inferior: o mouse sem indução SmoM2YFP mostrou pele com aspecto normal (à direita) e sem alterações morfológicas na secção H & E (esquerda).

Figura 2. Análise de fluxo de células CD11b ⁺ Gr1 ^+. Para examinar a mudança de células CD11b ⁺ Gr1 ⁺ durante o desenvolvimento do câncer de pele, foram isoladas células individuais e coradas com anticorpos marcados com fluorescência para CD11b e Gr1. Após a análise com FlowJo, notamos um aumento desta população de células em tecidos da pele de ratos tratadas com tamoxifeno.

Descrevemos um método para a análise da população de células em CBCs. Tecidos tumorais são consistentes de muitos tipos de células, e cada tipo de célula comporta-se de forma diferente a um determinado momento da carcinogénese, o qual é muito difícil de recuperar, mesmo sob as melhores condições in vitro. Usando este protocolo, que mostrou que o desenvolvimento do carcinoma basocelular é acompanhado pela expansão das células-tronco epidérmicas, bem como o recrutamento de células mielóides. Em comparação com a imuno-histoquímica ou análises de imunofluorescência, análise da população de células apresentam uma avaliação quantitativa das alterações mais populações de células uma vez que os anticorpos específicos para uma variedade de tipos de células estão agora disponíveis.

Para este protocolo, são necessárias 10 semanas para completar o estudo porque a mudança fenotípica da indução de genes requer tempo. Assim, é importante para planejar o experimento antes do tempo. Para o isolamento e análise de células, podem ser necessários dois dias inteiros. Como as células vivas são usadas para analyses, é importante para reservar um FACSCalibur antes do tempo. Temos também listado problemas comuns quando se trabalha com este protocolo (ver abaixo).

Em nossa experiência, a seguir são problemas comuns que encontramos:

1. Separação da epiderme Pobre: ​​Isto pode ser causado por tratamento com dispase incompleta (por favor, aumentar o tempo de tratamento diapase) ou solução de dispase insuficiente (A pele necessita de ser totalmente imerso na solução de dispase). O uso de pelo menos 5 ml de solução de dispase para um rato. O volume pode variar com base no tamanho da pele.
2. Baixo rendimento do número de células: Isto pode, devido à digestão incompleta com colagenase IV. Por favor, primeira concentração de colagenase cheque ou data de validade. Isto também pode ser causada por uma quantidade insuficiente de epiderme utilizado. Além disso, a digestão enzimática deve ser realizada a até 37 ° C com agitação (por favor, ajustar a temperatura antes de realizar a digestão).
3. Aglomerados de células: Isso é muito comum para as células da pele (células de pipetaalgumas vezes, depois de passar pelo filtro (antes da centrifugação), ou a existência de Mg ^{2 +} e Ca ^{2 +} em solução (utilize o Mg ^{2 +} e Ca ^{2 +} livre de PBS por lavagem celular).
4. Muitas células mortas: Este pode ser um resultado de tecidos degradados (por favor, use tecidos frescos), ou over-digestão (evitar incubação prolongada com dispase e colagenase IV).

Este protocolo pode ser combinado com o transplante de medula óssea ou transplante de tecidos para examinar a célula de origem. Por exemplo, o transplante de células que expressam a GFP de medula óssea em ratinhos letalmente irradiados irá permitir-nos a examinar a contribuição das células da medula óssea para os fibroblastos associados a tumores e células mielóides. Da mesma forma, os tumores da pele podem ser transplantadas para um novo hospedeiro rato para examinar interacções tumor-hospedeiro.

Além de examinar as mudanças população de células durante a carcinogênese, este protocolo também permitirá aos investigadores examinarEfeitos do tratamento com drogas para as células no ambiente tumoral. Embora este protocolo foi projetado para usar para análises população de células da pele durante a carcinogênese e pequenas modificações podem ser feitas para outros tipos de câncer.

Em resumo, as análises da população de células em modelos de ratos de câncer de pele pode dar-nos as mudanças dinâmicas celulares durante a carcinogênese, levando a uma melhor compreensão da biologia celular na transformação neoplásica e diferentes eventos celulares no processo de transformação.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este estudo foi apoiado pelo NCI (R01-R01-94160 e 155086), IU Simon Cancer Center e Wells Centro de Investigação Pediátrica.