Analisi popolazione cellulare Durante carcinogenesi della pelle

Carcinogenesi è un processo che coinvolge le interazioni tra cellule tumorali e il microambiente cancro. Per sezionare gli eventi molecolari, si ha la necessità di isolare diverse popolazioni di cellule in diverse fasi durante lo sviluppo del cancro. Utilizzando un modello murino di carcinoma a cellule basali, si descrive un protocollo per l'analisi di cellule durante la carcinogenesi.

Lo sviluppo del cancro è un processo a più fasi che coinvolga molti tipi cellulari, comprese le cellule tumorali, cellule precursori immunitarie, fibroblasti e cellule endoteliali. Ogni tipo di cellule subisce segnalazione e funzionale cambiamenti durante la carcinogenesi. La sfida attuale per molti ricercatori del cancro è di sezionare questi cambiamenti in ciascun tipo cellulare durante il processo più fasi in vivo. Negli ultimi anni, gli autori hanno sviluppato una serie di procedure per isolare le diverse popolazioni di cellule durante lo sviluppo del cancro della pelle utilizzando K14creER/R26-SmoM2 topi ^YFP. La procedura è divisa in 6 parti: 1) la generazione di topi appropriati per lo studio (K14creER ⁺ e R26-SmoM2 ^{YFP +} topi in questo protocollo), 2) che induce SmoM2 espressione ^YFP in pelle di topo, 3) preparazione del mouse biopsie cutanee, 4) isolamento epidermide dalla pelle; 5) preparare le singole cellule di epidermide; 6) l'etichettatura popolazioni di cellule singole per l'analisi di citometria a flusso.Generazione di numero sufficiente di topi con genotipo destra è il passo limitante in questo protocollo, che può richiedere fino a due mesi. Il resto dei passaggi prendere un paio di ore ad alcuni giorni. All'interno di questo protocollo, includiamo anche una sezione per la risoluzione dei problemi. Anche se ci concentriamo sul cancro della pelle, questo protocollo può essere modificato per fare domanda per altri modelli animali di malattie umane.

Come il tipo più comune di cancro umano, il carcinoma a cellule basali (BCC) colpisce circa 2 milioni di americani ogni anno ^1. Accumulando evidenze indicano che l'attivazione anormale del riccio (Hh) di segnalazione è la forza trainante alla base dello sviluppo BCC (Inviato a ^2,3). Alterazioni di segnale hedgehog nel BCC comprendono mutazioni inattivanti PTCH1 ^4-6, mutazioni guadagno-di-funzione di SMO ^7-9, e l'espressione aberrante di Hh percorso fattori di trascrizione GLI1 ¹⁰ e Gli2 ¹¹ o rare mutazioni inattivati ​​di Su regolatore negativo (FU ) ^12. Attraverso tutti questi e altri studi, Federal Drug Administration (FDA) ha recentemente approvato l'uso del segnale hedgehog inibitore Vismodegib per trattare metastatico e localmente avanzato BCC ^13-15.

Nonostante tutti questi risultati ^16, noi ancora non comprendiamo i meccanismi molecolari e cellulari con la quale il segnale hedgehog drives carcinogenesis. Creazione di modelli animali con attivazione tessuto-specifica del segnale hedgehog è ancora importante per questi studi e per la nostra comprensione della resistenza ai farmaci. Nei topi, topi wild-type non sviluppano BCC, anche in presenza di forti dosi di agenti cancerogeni, radiazioni UV o ionizzanti. In contrasto, Ptch1 ^{+ / -} topi sono suscettibili di sviluppo BCC ^17,18. La penetranza di sviluppo BCC in Ptch1 ^{+ / -} mice è di oltre il 50%, anche se PTCH1 ^18,19 + / - mice raramente sviluppano BCC full-grown se conservato in condizioni normali. Causa della letalità embrionale di Ptch1 ^{- / -,} tessuto-specifico knockout di PTCH1 è generalmente utilizzato per lo studio ^20. Inoltre, l'espressione condizionale pelle-specifica di oncogeno SmoM2 ^YFP (Krt14-CREER: R26-SmoM2 ^YFP o Krt14-cre: R26-SmoM2 ^YFP) porta alla formazione di molteplici BCC microscopici in età molto precoce, fornendo un semplice test genetico per segnalazione di Hh fannownstream di SMO ^21.

Ci sono tre grandi questioni della nostra conoscenza della biologia BCC. In primo luogo, l'origine cellulare delle BCC non è del tutto chiaro. Mentre alcuni studi supportano l'mosse del follicolo pilifero come sito cellula staminale ^22-24, Youssef et al. ²⁵ localizza il cellulare murina di origine dei tumori cutanei Hh-driven per essere nella regione nell'epidermide inter-follicolare, non nel follicolo pilifero , utilizzando cellule specifiche Cre per attivare l'espressione di un ROSA26-driven transgenico mutante SMO. In secondo luogo, interazioni cellulari durante lo sviluppo del BCC non sono ben compresi. E 'noto che i cheratinociti con segnale hedgehog attivi possono portare alla formazione di BCC, ma altri cambiamenti cellulari non sono ben compresi. Inoltre, il trattamento di Smo antagonisti nei topi può portare a farmacoresistenza ^26-28. Urgono dunque nuovi obiettivi per BCC. La comprensione di questi tre problemi richiede l'analisi dei cambiamenti cellulari in topi durante Carcinogenesis. Mentre diversi metodi sono stati pubblicati per la coltura dei cheratinociti, citometria a flusso e la pelle isolamento delle cellule staminali ^29-31, al momento non ci sono procedure complete per l'analisi di cellule in BCC del mouse. Grazie alla combinazione di metodi per modello murino di BCC, la separazione di epidermide, generazione di singole cellule da tessuti e analisi cellulari, forniremo ai lettori una serie di procedure per lo studio segnalazione cellulare, cellulari e interazioni molecolari durante lo sviluppo del BCC. Noi crediamo che questo protocollo permetterà ai lettori di vedere come ogni procedura è compiuta. Inoltre, abbiamo fornito alcuni dati per illustrare ciò che i risultati dovrebbero essere simile, e la risoluzione dei problemi per aiutare i lettori a superare le difficoltà durante l'esecuzione di queste procedure.

Questo studio è stato approvato dal Comitato IACUC presso l'Indiana University School of Medicine.

1. Generare topi con genotipo corretto

1. Stabilire un modello murino di BCC. Mate K14-CREER topi (Jackson laboratorio stock numero 005107) con R26-SmoM2 ^YFP topi (Jackson laboratorio stock numero 005.130) (18) per generare K14-CREER + e R26-SmoM2 ^{YFP +} topi.
2. Eseguire la genotipizzazione. Immergere i campioni coda (0,5 cm di lunghezza) in directPCR soluzione lisi coda con 1 mg / ml di proteinasi K a 55 ° C per una notte con agitazione. Il giorno successivo, rimuovere i residui di tessuto per centrifugazione a velocità massima in un micro-centrifuga (per mantenere il surnatante per la genotipizzazione). Usare 1 ml del supernatante per ciascuna reazione PCR con i primer e le condizioni raccomandate dal fornitore. Selezionare i topi con i genotipi giuste (all'età di 3-6 settimane, buprenorfina a 0,05-0,1 mg / kg verrà applicata tramite SQ ogni 8-12 ore per 2-3 giorni dopo la coda snip) for il punto 2.

2. Indurre l'espressione di SmoM2 nei cheratinociti della pelle

Indurre SmoM2 espressione nei cheratinociti con somministrazione orale di tamoxifene (5 pg / kg di peso corporeo in 50 ml di olio vegetale in ciascuna alimentazione) per 5 giorni consecutivi mediante sonda gastrica con un ago di alimentazione (curva 20 gauge).

3. Preparazione di campioni della pelle

In generale, i fenotipi sono più gravi sull'orecchio e la coda in K14creER/R26SmoM2 ^GFP topi. Per preparare per le analisi delle cellule, abbiamo prima vendemmia della pelle del mouse dopo il sacrificio di animali con una procedura approvata istituzionale (CO ₂ più dislocazione cervicale).

4. Isolando Epidermide

1. Dopo i topi sacrificio con una procedura approvata (vedi punto 3), rimuovere pelliccia tramite trimmer. I campioni di pelle Immergere in soluzione dispasi (5 mg / ml in DMEM con 10% FBS) a 37 ° C per 1-2 ore (1 ora per i topi meno di 8 settimane e 2 hrper i topi vecchi di 8 settimane).
2. Dopo il trattamento dispasi, epidermide separata dal derma con il forcipe.

5. Generare cellule singole

1. Per ottenere singola popolazione cellulare, tritare epidermide da forbici e poi immergere in soluzione IV collagenasi (1 mg / ml in DMEM con 10% FBS) per 1-2 ore a 37 ° C in un tubo da 50 ml. Provate a mescolare delicatamente i tubi ogni 20 min per aiutare dissociazione delle cellule.
2. Ispezionare dissociazione delle cellule al microscopio. Quando singole cellule possono essere rilevate nel medio collagenasi, incubare il campione per altri 30 min per aumentare la resa cella. In generale, l'epidermide da un mouse può produrre fino a 10 ⁷ cellule.
3. Filtrare la miscela tessuto attraverso colino cellula (diametro dei pori 70 micron), le cellule di spin giù a 1.500 giri tramite banco centrifugazione, e lavare una volta con PBS.

6. Cellule etichette ed eseguire analisi di flusso Citometria

1. Risospendere le cellule in 10% FBSin PBS a 2,5 x 10 ⁶ cellule / ml per bloccare il legame non specifico (in ghiaccio per 30 min)
2. Prelevare un'aliquota di cellule a ciascuna di 1,5 ml per microtubi etichettatura anticorpo specifico. Aggiungere anticorpi differenti in ciascun tubo ad una concentrazione finale di 2 mg / ml. Mescolare gli anticorpi con le cellule attraverso un delicato vertice per alcuni secondi e lasciarli in ghiaccio per 30 minuti, quindi lavare con 1 ml di PBS. Per i campioni di BCC, abbiamo usato gli anticorpi per i seguenti marcatori: CD11b-PE più Gr1-APC (cellule mieloidi o cellule mieloidi soppressore-derivati); vimentina-FITC (fibroblasti) (vedi i reagenti per i dettagli).
3. Per la colorazione intracellulare, usiamo un kit e seguire il manuale del fornitore (vedi Reagenti per i dettagli). Usiamo cellule fresche per analizzare marcatori di superficie cellulare. Dopo superficie marcatore colorazione, lavare le cellule, e risospendere in PBS. DAPI aggiungere alla miscela cella ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. DAPI si macchia le cellule morte che saranno gated fuori da ulteriori analisi.
4. Analizzare i dati con specifisoftware c. Abbiamo prima selezionare singole cellule in base alla FSC e SSC trama, e utilizziamo DAPI popolazione negativo (cellule vive) per ulteriori analisi.

E 'noto che i topi non sviluppano carcinomi a cellule basali salvo Hh attivazione segnalazione. Figura 1 mostra il fenotipo pelle seguente espressione indotta di oncogeno spianato SmoM2 ^YFP. Figura 2 mostra l'analisi di cellule mieloidi in topi normali e di tumore. CD11b ⁺ Gr1 ⁺ cellule derivano da cellule mieloidi, e alcuni di loro sono cellule derivate mieloidi soppressore. In situazione normale, il CD11b ^{+ +} Gr1 popolazione cellulare è difficilmente rilevabile, ma aumenta in risposta ad infiammazione o sviluppo del tumore. Abbiamo mostrato che l'espressione indotta di SmoM2YFP nei risultati cutanee in un aumento CD11b ⁺ Gr1 ⁺ cellule. Attualmente, i meccanismi molecolari alla base di questo cambiamento nella BCC non sono chiare.

Figura 1. Morphologicacambia l dopo induzione SmoM2YFP in pelle di topo. alto mostra un diagramma di genotipi del mouse. Il pannello centrale: la K14creER ⁺ e R26-SmoM2 ^{YFP +} topo trattato con tamoxifene mostrato grossolanamente anomalia nella pelle (a destra), tumori cutanei nella sezione H & E (a sinistra). Il pannello inferiore: il mouse senza SmoM2YFP induzione mostrava normale in cerca della pelle (a destra) e non morfologia anormale nella sezione H & E (a sinistra).

Figura 2. Analisi del flusso di CD11b ⁺ Gr1 ⁺ cellule. Per esaminare il cambiamento di CD11b ⁺ Gr1 ⁺ cellule durante lo sviluppo del cancro della pelle, abbiamo isolato cellule singole e colorate con anticorpi marcati con fluorescenza a CD11b e Gr1. Dopo l'analisi con FlowJo, abbiamo notato un aumento di questa popolazione di cellule nei tessuti cutanei da topi trattati con tamoxifene.

Abbiamo descritto un metodo per l'analisi di popolazione cellulare in BCC. Tessuti tumorali sono coerenti di molti tipi di cellule, e ciascun tipo cellulare si comporta diversamente in un determinato momento di carcinogenesi, che è molto difficile da recuperare anche nelle migliori condizioni in vitro. Usando questo protocollo, abbiamo dimostrato che lo sviluppo di carcinoma a cellule basali si accompagna l'espansione delle cellule staminali epidermiche e reclutamento di cellule mieloidi. In confronto con le analisi immunoistochimica o immunofluorescenza, analisi di popolazione di cellule danno una valutazione più quantitativa delle variazioni di popolazione di cellule da anticorpi specifici per una varietà di tipi di cellule sono ora disponibili.

Per questo protocollo, 10 settimane sono necessari per completare lo studio perché il cambiamento fenotipico da induzione genica richiede tempo. E 'quindi importante pianificare l'esperimento prima del tempo. Per l'isolamento delle cellule e di analisi, possono essere necessari due giorni interi. Poiché le cellule vive sono usati per analyses, è importante prenotare un FACSCalibur prima del tempo. Abbiamo anche elencato i problemi comuni quando si lavora con questo protocollo (vedi sotto).

Nella nostra esperienza, di seguito sono i problemi più comuni che abbiamo incontrato:

1. Scarsa separazione dell'epidermide: questo può essere causato da un trattamento dispasi incompleto (prego aumentare il tempo di trattamento diapase) o di soluzione dispasi insufficiente (La pelle deve essere completamente immersa in soluzione dispasi). Usiamo almeno 5 ml di soluzione dispasi per un mouse. Il volume può variare in base alle dimensioni della pelle.
2. Bassa resa del numero di cellule: Può essere dovuto alla incompleta digestione con collagenasi IV. Per favore prima concentrazione collagenasi assegno o la data di scadenza. Questo può anche essere causato da insufficiente quantità di epidermide utilizzato. Inoltre, digestione enzimatica deve essere effettuata a 37 ° C con agitazione (si prega di regolare la temperatura prima di eseguire la digestione).
3. Grumi di cellule: Questo è molto comune per le cellule della pelle (cellule pipetteun paio di volte dopo aver attraversato il filtro (prima della centrifugazione), o l'esistenza di Mg ^{2 +} e Ca ^{2 +} nella soluzione (si prega di utilizzare Mg ^{2 +} e Ca ^{2 +} libero PBS per il lavaggio delle cellule).
4. Troppe le cellule morte: questo potrebbe essere il risultato di tessuti degradati (si prega di utilizzare tessuti freschi), o over-digestione (evitare di incubazione con dispasi e collagenasi IV).

Questo protocollo può essere combinato con trapianto di midollo osseo o trapianto di tessuto per esaminare l'origine cella. Ad esempio, il trapianto di GFP che esprimono cellule del midollo osseo in topi letalmente irradiati ci permetterà di esaminare il contributo delle cellule del midollo osseo di fibroblasti associati al tumore e le cellule mieloidi. Allo stesso modo, i tumori della pelle possono essere trapiantate in un nuovo host mouse per esaminare le interazioni tumore-ospite.

Oltre a esaminare i cambiamenti di popolazione di cellule durante la carcinogenesi, questo protocollo consentirà inoltre ai ricercatori di esaminareeffetti dei trattamenti farmacologici verso le cellule del tumore ambiente. Sebbene questo protocollo è progettato per utilizzare per analisi di popolazioni cellulari durante carcinogenesi della pelle, lievi modifiche possono essere fatte per altri tipi di cancro.

In sintesi, le analisi di popolazione di cellule in modelli murini di cancro della pelle possono darci le modifiche dinamiche cellulari durante la carcinogenesi, portando ad una migliore comprensione della biologia cellulare nella trasformazione neoplastica e diversi eventi cellulari nel processo di trasformazione.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Questo studio è stato sostenuto dal NCI (R01-R01-94160 e 155086), UI Simon Cancer Center e Centro di Wells per la Ricerca Pediatrica.