Method Article
التسرطن هو عملية تنطوي على التفاعل بين الخلايا السرطانية والمكروية السرطان. لتشريح الأحداث الجزيئية، ويحتاج المرء لعزل السكان خلية مختلفة في مراحل مختلفة خلال تطور مرض السرطان. باستخدام نموذج الفأر لسرطان الخلايا القاعدية، ونحن تصف بروتوكول للتحليلات الخلية خلال التسرطن.
تطور مرض السرطان هو عملية متعددة الخطوات التي تنطوي على العديد من أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا سرطان السلائف، الخلايا المناعية، الخلايا الليفية والخلايا البطانية. كل نوع من الخلايا يخضع لإشارات وظيفية التغيرات خلال التسرطن. التحدي الحالي لكثير من الباحثين السرطان هو لتشريح هذه التغييرات في كل نوع من الخلايا أثناء عملية متعددة الخطوات في الجسم الحي. في السنوات القليلة الماضية، وضعت الكتاب مجموعة من الإجراءات لعزل السكان خلية مختلفة أثناء تطوير سرطان الجلد باستخدام K14creER/R26-SmoM2 YFP الفئران. وينقسم هذا الإجراء إلى 6 أجزاء: 1) توليد الفئران المناسبة للدراسة (K14creER + وR26-SmoM2 YFP + الفئران في هذا البروتوكول)، 2) حمل SmoM2 YFP التعبير في الجلد الماوس؛ 3) إعداد خزعات الجلد الماوس، 4) عزل البشرة من الجلد؛ 5) إعداد الخلايا واحد من البشرة؛ 6) وصفها السكان خلية واحدة لتحليل التدفق الخلوي.توليد عدد كاف من الفئران مع التركيب الوراثي الصحيح هو الخطوة تحد في هذا البروتوكول، والذي قد يستغرق فترة تصل الى شهرين. بقية الخطوات يستغرق بضع ساعات إلى بضعة أيام. في هذا البروتوكول، ونحن تتضمن أيضا قسم لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. على الرغم من أننا نركز على سرطان الجلد، ويجوز تعديل هذا البروتوكول إلى تقديم طلب للحصول النماذج الحيوانية الأخرى من الأمراض التي تصيب الإنسان.
كما النوع الاكثر شيوعا من سرطان الإنسان، وسرطان الخلايا القاعدية (BCC) يؤثر على حوالي 2 مليون أميركي سنويا 1. تراكم الأدلة تشير إلى أن تفعيل الشاذ من القنفذ (HH) إشارات هي القوة الدافعة وراء تطوير BCC (مراجعة في 2،3). التعديلات سمو يشير في بطاقات عبور الحدود وتشمل الطفرات تعطيل من PTCH1 4-6، والطفرات مكاسب من وظيفة من SMO 7-9، والتعبير المنحرف سمو عوامل النسخ مسار GLI1 10 و 11 GLI2 أو الطفرات المعطل نادرة من السلبية سو منظم (فو ) 12. من خلال كل هذه الدراسات وغيرها، وقد وافق الدواء الاتحادية (FDA) في الآونة الأخيرة استخدام سمو إشارات المانع Vismodegib لعلاج النقيلي المتقدمة محليا وبطاقات عبور الحدود 13-15.
على الرغم من كل هذه الإنجازات 16، ونحن ما زلنا لا نفهم الآليات الجزيئية والخلوية التي اتش اتش إشارات يدفع CARCتكون النسيج الليفي. إنشاء نماذج حيوانية باستخدام تنشيط الأنسجة محددة سمو إشارات لا يزال من المهم لهذه الدراسات وعلى فهمنا لمقاومة العقاقير. في الفئران، والفئران البرية من نوع لا تتطور بطاقات عبور الحدود، حتى في ظل جرعات كبيرة من المواد المسببة للسرطان، الأشعة فوق البنفسجية أو المؤينة. في المقابل، Ptch1 + / - الفئران عرضة لتطوير BCC 17،18. وانتفاذ التنمية BCC في Ptch1 + / - الفئران هي أكثر من 50٪ 18،19 على الرغم من Ptch1 + / - الفئران نادرا تطوير بطاقات عبور الحدود مكتملة النمو إذا كان يحتفظ بها في ظل ظروف طبيعية. ويرجع ذلك إلى الفتك الجنينية من Ptch1 - / -، ويستخدم خروج المغلوب الأنسجة محددة من PTCH1 عموما لدراسة 20. وبالإضافة إلى ذلك، مشروط التعبير الجلد محددة من أنكجنيك SmoM2 YFP (Krt14-creER: R26-SmoM2 YFP أو Krt14-جنة المساواة العرقية: R26-SmoM2 YFP) يؤدي إلى تشكيل بطاقات عبور الحدود مجهرية متعددة في سن مبكرة جدا، وتوفير الفحص الجيني سهلة لل إشارات سمو تفعلwnstream من SMO 21.
هناك ثلاث قضايا رئيسية في معرفتنا البيولوجيا BCC. الأول، وأصل الخلوية من بطاقات عبور الحدود ليست واضحة تماما. في حين دعم بعض الدراسات تتزحزح من بصيلات الشعر كموقع الخلايا الجذعية 22-24، يوسف وآخرون. 25 مترجمة الخلية الفئران من أصل الجلدية الأورام HH-مدفوعة لتكون في المنطقة البشرة بين مسامي، وليس في بصيلات الشعر ، وذلك باستخدام لجنة المساواة العرقية خلية محددة لتفعيل التعبير من يحركها ROSA26 المعدلة وراثيا متحولة SMO. وثانيا، التفاعلات الخلوية خلال تطوير BCC يست مفهومة جيدا. ومن المعروف أن الخلايا الكيراتينية مع المنشط اتش اتش الإشارات يمكن أن يؤدي إلى تشكيل بطاقات عبور الحدود، ولكن ليست مفهومة جيدا التغيرات الخلوية الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن علاج مضادات بيانات التزامات العضوية في الفئران يؤدي إلى مقاومة المخدرات 26-28. نحن بأمس الحاجة إلى أهداف وبالتالي رواية لBCC. فهم هذه القضايا الثلاث يتطلب تحليل التغيرات الخلوية في الفئران خلال carcinogenesis. في حين تم نشر العديد من الأساليب للثقافة الكيراتينية، التدفق الخلوي والجلد الجذعية العزلة الخلية 29-31، وهناك حاليا أي إجراءات شاملة لتحليل الخلية في بطاقات عبور الحدود الماوس. من خلال الجمع بين الأساليب لنموذج الفأر من بطاقات عبور الحدود، والفصل بين البشرة، وتوليد الخلايا واحد من الأنسجة وتحليلات الخلية، وسوف نقدم للقراء مع مجموعة من الإجراءات لدراسة إشارة الخلية الخلوية والتفاعلات الجزيئية أثناء تطوير BCC. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول سوف تسمح للقراء لمعرفة كيف يتم إنجاز كل إجراء. وبالإضافة إلى ذلك، قدمنا بعض البيانات لتوضيح ما هي النتائج يجب أن تبدو، ومخرج لمساعدة القراء على التغلب على الصعوبات أثناء تنفيذ هذه الإجراءات.
وقد اعتمدت هذه الدراسة من قبل لجنة IACUC في مدرسة جامعة إنديانا للطب.
1. توليد الفئران مع التركيب الوراثي الصحيح
2. لحث على التعبير من SmoM2 من الخلايا الكيراتينية الجلد
لحث SmoM2 التعبير في الخلايا القرنية عن طريق الفم من عقار تاموكسيفين (5 ميكروغرام / كغ من وزن الجسم في 50 مل من الزيت النباتي في كل رضاعة) لمدة 5 أيام متتالية من خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم مع إبرة التغذية (المنحني قياس 20).
3. إعداد عينات الجلد
بشكل عام، الظواهر هي أكثر شدة على الأذن والذيل في K14creER/R26SmoM2 الفئران GFP. للتحضير لتحليل الخلية، ونحن أول حصاد الجلد الماوس بعد التضحية الحيوانية مع إجراء المؤسسية المعتمدة (CO 2 زائد خلع عنق الرحم).
4. عزل البشرة
5. توليد الخلايا واحد
6. خلايا التسمية وإجراء التحليلات التدفق الخلوي
ومن المعروف أن الفئران لا تتطور سرطان الخلايا القاعدية إلا مع صاحب السمو تفعيل يشير الشكل 1 يبين النمط الظاهري الجلد بعد التعبير الناجم من أنكجنيك مملس، ويظهر SmoM2 YFP. الشكل 2 تحليل خلايا الدم النخاعي في الفئران العادية والحاملة للورم. وتستمد CD11b + + GR1 الخلايا من خلايا الدم النخاعي، وبعضها متعلق بالنخاع الشوكي الخلايا المكثف المشتقة. في الوضع الطبيعي، وCD11b + + GR1 السكان الخلية هو بالكاد يمكن كشفها، ولكن زيادة في استجابة للالتهاب أو ورم التنمية. لقد أظهرنا أن التعبير الناجم عن SmoM2YFP في النتائج الجلد إلى زيادة في CD11b + + GR1 الخلايا. حاليا، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا التغيير في بطاقات عبور الحدود ليست واضحة.
الشكل 1. Morphologicaالتغييرات L بعد الاستقراء SmoM2YFP في الجلد الماوس. أعلى يظهر الرسم البياني من المورثات الماوس. لوحة الأوسط: + K14creER وR26-SmoM2 YFP + الماوس تعامل مع تاموكسيفين أظهرت شذوذ بشكل صارخ في الجلد (يمين) وكذلك أورام الجلد في قسم H & E (يسار). لوحة أسفل: الماوس بدون SmoM2YFP الاستقراء أظهر الجلد يبحث العادية (اليمين) وليس التشكل غير طبيعي في قسم H & E (يسار).
الشكل 2. تحليل تدفق CD11b + + GR1 الخلايا. دراسة تغيير CD11b + + GR1 الخلايا خلال تطوير سرطان الجلد، ونحن عزل الخلايا واحد والملون مع الأجسام المضادة مضان المسمى لCD11b وGR1. بعد تحليل مع FlowJo، لاحظنا زيادة من هذه الفئة من السكان خلية في أنسجة الجلد من الفئران المعالجة تاموكسيفين.
وقد وصفت لنا طريقة لتحليل السكان الخلية في بطاقات عبور الحدود. أنسجة الورم متسقة من العديد من أنواع الخلايا، ولكل نوع من الخلايا تتصرف بشكل مختلف في وقت معين من التسرطن، والتي من الصعب جدا لاستعادة حتى في ظل أفضل الظروف في المختبر. باستخدام هذا البروتوكول، ونحن أظهرت أن التنمية من سرطان الخلايا القاعدية يرافقه توسع من الخلايا الجذعية البشرة وكذلك تجنيد خلايا الدم النخاعي. بالمقارنة مع المناعية أو مناعي التحليلات، تحليلات السكان الخلية إعطاء تقييم أكثر كمية من التغيرات السكانية الخلية منذ الاجسام المضادة المحددة لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا متاحة الآن.
لهذا البروتوكول، وهناك حاجة إلى 10 أسابيع لاستكمال الدراسة وذلك لأن التغيير المظهري من تحريض الجينات يتطلب وقتا. وبالتالي فمن المهم أن تخطط التجربة في وقت مبكر. لعزل الخلايا وتحليلات، قد تكون هناك حاجة يومين كله. لأنه يتم استخدام الخلايا الحية لanalysES، فمن المهم أن حجز FACSCalibur في وقت مبكر. لدينا قائمة أيضا المشاكل الشائعة عند العمل مع هذا البروتوكول (انظر أدناه).
في تجربتنا، وفيما يلي المشاكل الشائعة التي واجهناها:
ويمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع زرع نخاع العظام أو زرع الأنسجة لدراسة منشأ الخلية. على سبيل المثال، زرع GFP، معربا عن خلايا نخاع العظام في الفئران المعرضة للإشعاع قاتل سوف تسمح لنا للنظر في مساهمة خلايا نخاع العظام إلى الخلايا الليفية الورم المصاحب وخلايا الدم النخاعي. وبالمثل، يمكن زرعها أورام الجلد إلى مجموعة الفأرة الجديدة لدراسة التفاعلات ورم المضيف.
بالإضافة إلى دراسة التغيرات السكانية الخلية خلال التسرطن، وسوف يسمح هذا البروتوكول أيضا الباحثين لدراسةآثار العلاجات المخدرات إلى الخلايا في بيئة الورم. على الرغم من أن هذا البروتوكول يهدف إلى استخدام لتحاليل السكان الخلية خلال الجلد التسرطن، تعديلات طفيفة يمكن أن يتم لأنواع السرطان الأخرى.
وباختصار، يمكن أن التحليلات السكانية خلية في نماذج الماوس من سرطان الجلد تعطينا التغيرات الديناميكية الخلوية خلال التسرطن، مما يؤدي إلى فهم أفضل لبيولوجيا الخلية في التحول الأورام والأحداث الخلوية المختلفة في عملية التحول.
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
وأيد هذه الدراسة من قبل لجنة التحقيق الوطنية (R01-R01-94160 و155086)، IU مركز السرطان ومركز سيمون ويلز لأبحاث طب الأطفال.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved