Optogenética estimulação do comportamento de fuga em

Ferramentas optogenética codificados geneticamente permitir a manipulação não invasiva de neurónios específicos no Drosophila Cérebro. Tais ferramentas podem identificar neurónios cuja activação é suficiente para induzir ou suprimir determinados comportamentos. Aqui apresentamos um método para ativar Channelrhodopsin2 que se expressa em neurônios específicos em moscas livremente a pé.

Um número crescente de ferramentas codificados geneticamente estão ficando disponíveis que permitem não invasivo manipulação da actividade neural de neurónios específicos em Drosophila melanogaster ^1. A principal delas são ferramentas optogenética, que permitem a ativação ou silenciamento de neurônios específicos no animal intacto, e movendo-se livremente com luz brilhante. Channelrodopsina (CHR2) é um canal de catião activado pela luz, que, quando activada pela luz azul, provoca a despolarização dos neurónios que expressam. Chr2 tem sido eficaz para a identificação de neurônios críticos para comportamentos específicos, tais como o CO ₂ evasão, extensão e tromba gigante de fibra resposta de sobressalto mediada ^2-4. No entanto, como as fontes de luz intensa, utilizados para estimular a CHR2 também estimular fotorreceptores, estas técnicas optogenética não tenham sido previamente utilizados no sistema visual. Aqui, nós combinamos uma abordagem optogenética com uma mutação que prejudica fototransdução a demonstrate que a ativação de um cluster de tear neurônios sensíveis em lobo óptico da mosca, foma-1 neurônios, pode dirigir um comportamento de fuga usado para evitar a colisão. Utilizou-se um alelo nulo de um componente crítico da cascata de fototransdução, fosfolipase C-β, codificada pelo gene norpA, para tornar a voa cego e também utilizar o Gal4-UAS sistema activador transcricional para comandar a expressão de CHR2 no Foma-1 neurônios. Moscas individuais são colocados em uma pequena plataforma cercada por LEDs azuis. Quando os LEDs são iluminadas, as moscas rapidamente descolagem em voo, de um modo semelhante ao comportamento visual impulsionada tear-escape. Nós acreditamos que esta técnica pode ser facilmente adaptada para analisar outros comportamentos em se movimentar livremente moscas.

A crescente arsenal de ferramentas geneticamente codificados têm sido desenvolvidos para manipular actividade neural em células específicas na Drosophila melanogaster ^1. Estas ferramentas permitem a ativação não-invasiva ou silenciamento de neurônios específicos no animal intacto, e se movimentar livremente. Entre estes, Channelrhodopsin2 (CHR2), um canal de catião activado pela luz, apresenta vantagens importantes, uma vez que pode ser temporalmente controlado e rapidamente induzido. Quando os neurônios que expressam chr2 estão expostos a brilhante luz azul (470 nm), eles rapidamente despolarizar e apresentam elevadas taxas de disparo ^3-5. Ativação de neurônios como alvo específicos em animais livremente móveis revelou a suficiência de neurônios específicos para comportamentos como evitar CO ₂ ^3, tromba extensão ^2,4, ea gigante de fibra respostas de alarme mediadas ^4. No entanto, como as fontes de luz intensa necessárias para estimular CHR2 também estimular fotorreceptores, aplicando optogenetic técnicas para o sistema visual tem sido limitada. Através da combinação de uma abordagem optogenética com uma mutação que prejudica a fototransdução, nós demonstramos que a activação de um conjunto específico de neurónios no lóbulo óptico da mosca pode conduzir a um comportamento de escape utilizado para evitar a colisão ^6.

A maioria, se não todos, os animais visuais exibem um comportamento de fuga para evitar colisões com objectos que se aproximam. Andar a pé ou parado moscas, quando se apresenta com uma colisão iminente, o arranque em vôo, longe da colisão iminente ^7-9. Estes decolagens caracterizam-se por asas levantadas antes da descolagem e uma trajetória de vôo instável ^10,11. Esta resposta é distinto do gigante fibra resposta mediada sobressalto, saltos que não são precedidos por asas levantados, e, normalmente, resultaria em uma queda em queda livre ^4,9. Tendo identificado um cluster específico de neurônios sensíveis tear no lobo óptico, Foma-1 neurônios, que são uniquely atento para codificar objetos que se aproximam, procurou-se investigar o seu envolvimento na mosca comportamento de fuga tear. Aqui demonstramos o uso de optogenética para ativar seletivamente esses neurônios e provocar o comportamento da mosca fuga.

Usamos o Gal4-UAS sistema activador transcricional de dirigir a expressão de CHR2-nos uma foma neurónios. Chr2 requer o co-fator todo-trans-retinal e como esta é encontrada em níveis baixos no sistema central nervoso Drosophila deve ser completado na dieta das moscas. ^3,4 Como a luz brilhante é usado para ativar chr2 e moscas exibem comportamentos phototactic fortes ^12, procurou-se eliminar a possibilidade de uma resposta visual ao estímulo. Para fazer isto, utilizou-se animais que eram mutantes homozigóticos para um alelo nulo do gene norpA, que codifica um componente crítico da cascata de fototransdução, fosfolipase C-β. Fotorreceptores em tais moscas mutantes são incapazes de responsabilidaded a luz ^13. Para testar a estimulação optogenética da resposta de fuga, é necessário isolar uma única mosca e banhar em luz azul brilhante. Para fazer isso, nós colocamos moscas individuais em pontas de pipeta. Uma ponta de pipeta é colocada num suporte personalizado, de tal modo que a mosca vai geotactically subida da ponta e para fora para uma plataforma rectangular. A mosca é capaz de caminhar livremente em cima desta plataforma. A plataforma está rodeada por quatro matrizes de LED azul, cada um contendo três LEDs, voltadas para o topo da plataforma. Depois da passagem está na plataforma, os LEDs são iluminados, e resposta da mosca é gravado usando uma câmera de alta velocidade ^6.

1. Gerar Moscas channelrodopsina

1. Cruz UAS-chr2 moscas com o motorista Gal4 de sua escolha, nós usamos G105-Gal4, que é expressa em foma-1 neurônios no lóbulo óptico.
2. Para eliminar a possibilidade de uma resposta visual para o estímulo de luz azul, ambas as linhas de mosca são em aw fundo norpA ^+.
3. Resultado final: w ⁺ norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Depois de moscas adultas eclose, colocar as fêmeas seleccionadas com alimento fresco, suplementado com 10 uM todo-trans-retinal (um co-factor necessário para a CHR2) e protegida da luz, durante 3 dias antes da realização do ensaio do comportamento.

2. Faça 10 Comida All-trans-retinal mM aprimorada

1. Dissolver 100 mg de ácido todo-trans-retinal em 17,6 ml de etanol a 95% para tornar a 20 mM na retina. Manter todo-trans-retinal ao abrigo da luz em todos os momentos.
2. Derreta alimentos mosca padrão fubá no microondas, e deixe esfriar até que fique quente ao toque.
3. Misturar 50 ul de 20 mMall-trans-retinal em frascos de 10 ml de comida mosca.
4. Deixe arrefecer os frascos e manter ao abrigo da luz.

3. Equipamento

1. Pontas de pipeta: Standard 1.000 pontas de pipeta uL são cortados perto da ponta, criando um diâmetro de poro de ~ 2,25 mm.
2. Da plataforma (ver figura 1).
   1. Uma base de Delrin, 17 cm x 25 cm, foi construído com orifícios roscados em cada canto para encaixar ¼ "NPT conectores de mangueira de arrefecimento.
   2. Um suporte vertical, feito de Delrin, está ligado ao centro da base. As dimensões totais são de 25 mm x 40 mm x 65 mm (largura x profundidade x altura). A ranhura 10 mm de largura corre o comprimento do suporte, com um parafuso de polegar na parte inferior. A plataforma está ligada à parte superior do suporte, 25 mm X 40 mm X 10 mm, com um furo de 3,5 mm de diâmetro alinhado com a ranhura no suporte.
3. Matrizes de LED (ver Figura 1).
   1. Quatro braços de Refrigeração, ~ 18 cm de comprimento, estão afixadas na plataforma base utilizando o conector da mangueira de líquido refrigerante. Refrigeração é usado apenas como um suporte estrutural e não é utilizado para fins de refrigeração.
   2. Ranhuras espaçadas adequadamente são cortadas na parte final do refrigerante mangueira de cada braço para fixar um dissipador de calor para a extremidade de cada braço.
   3. A Rebel LED azul Tri-Stars é montada a cada dissipador de calor através de pré-corte de fita adesiva térmica. A CARCLO 18 ° Tri-lente é afixada em cada Tri Star.
   4. LED Tri-Stars são ligados aos motoristas BuckPuck DC e uma fonte de alimentação, conforme especificado. Nós conseguimos o nosso set-up com cada BuckPuck ligar duas Tri-Stars em série.
   5. Iluminação de todos os quatro LED Tri-estrelas a 700 mA rendeu uma irradiação de 713 W / m ² na nossa plataforma.
4. Câmara: A câmara está montada num tripé pequeno e centrou-se na parte superior da plataforma.

4. Ensaio Comportamental

1. Resumidamente anestesiar moscas em gelo.
2. Coloque moscas individuais em pontas de pipeta, usando a fita para fecharambas as extremidades da ponta.
3. Após as moscas têm despertado e estão activamente a explorar a ponta da pipeta, retirar a fita adesiva e coloque uma pipeta na ranhura no suporte vertical. O parafuso de aperto manual é usado para proteger a ponta da pipeta no lugar e para fechar a parte inferior da ponta.
4. Como a mosca explora a ponta da pipeta (tipicamente 30 - 60 seg), iniciar a gravação da câmara imediatamente antes da mosca emerge da ponta para cima da plataforma.
5. Após a mosca surgiu na plataforma, espere 1-2 seco, e ligar os LEDs azul. Use um cronômetro para medir manualmente o tempo até que a mosca inicia vôo.

Cego voa manifestou o chr2 ou o driver G105 só mostram uma baixa taxa de decolagem após a sua iluminação com luz azul brilhante. Cego moscas apresentaram a mesma taxa de descolagem independentemente de iluminação (Figura 2), sugerindo que estes eram take-off espontânea e não devido à iluminação com luz azul. Quando o CHR2 é expressa nos neurónios Foma1, no entanto, a iluminação com luz azul elicia a resposta de fuga. Mais de 50% das moscas testados tirou dentro de 1 segundo de iluminação e de 75% dentro de 5 segundos (Figura 2). Em contraste, apenas 10% das moscas de controlo arrancou dentro de 1 segundo, e 20%, dentro de 5 segundos. À medida que o condutor G105 é expresso tanto em neurónios FOMA-1 e no lóbulo γ do corpo de cogumelo, utilizou-se um condutor especificamente expressos nesta parte do corpo de cogumelo (201Y-Gal4) como um controlo adicional. Estas moscas apresentaram uma taxa de descolagem semelhante aos outros controlos efectuados (Figura 2), Indicando especificamente que a ativação optogenética de foma-1 neurônios provocou a resposta de fuga.

Imagiologia de alta velocidade tomado em 200 quadros por segundo das respostas induzidas optogenetically revelou que estas respostas foram semelhantes para o comportamento de fuga tear evocado (Figura 3). Ou seja, 90% das moscas filmado levantaram suas asas antes da descolagem (n = 30) ^6. Além disso, a trajectória de voo que se seguiu foi a menos estável do que o voluntário descolagens ^10, com o corpo da mosca estar numa orientação um tanto vertical (figura 3), mas mais estável do que as respostas mediadas por fibras gigantes ^9.

Figura 1. Experimental set-up mostrando a plataforma com o suporte vertical eo refrigerante mangueira quatro braços segurando dissipadores de calor com matrizes de LED afixados a eles. A, A afinação sob iluminação ambiente. B, o set-up quando os LEDs são iluminados. C, um close-up de um Tri-Star LED no dissipador de calor. D, um close-up da Estrela Tri-com a lente tri-anexado. E, um esquema do controlador Buckpuck e circuito de LED. F, diagrama de circuito para o BuckPuck e circuito de LED.

Figura 2. Histograma acumulado de tempo do salto de fuga para as linhas de mosca experimentais e de controlo. Todos moscas expressa w ⁺ norpA para torná-los visualmente cego. "Foma-1" moscas tem o driver G105-Gal4; "MB" moscas têm o motorista 201Y-Gal4 que impulsiona expressão no corpo de cogumelo.

Figura 3. Quadros de vídeo de alta velocidade CHR2 induzidas respostas de fuga. Os quadros são numerados sequentially com 5 msec entre os quadros.

Nós demonstramos estimulação optogenética de comportamentos de fuga, banhando livremente caminhar moscas em luz azul brilhante. Esta abordagem pode ser facilmente adaptada para analisar outros comportamentos em moscas livremente a pé, e pode ser escalado para plataformas maiores, simplesmente ladrilhos as matrizes de LED que usamos em uma área maior. Usando uma câmera barata do que descrever, ou outros sistemas de câmera disponíveis, o usuário pode ajustar a taxa de quadros e resolução espacial das imagens adquiridas para atender o comportamento de interesse. Adicionalmente, a nossa imagem é limitada ao tempo depois de os LEDs são iluminados, como os LEDs azuis para fornecer a iluminação para a câmara, bem como a activação de CHR2. Isto é suficiente para o nosso comportamento, mas, se a posição ou o movimento da mosca antes de LED de iluminação tem de ser gravado, as fontes de luz adicionais que fornecem os sinais na gama de infravermelhos, combinado com filtragem adequada da câmara, podem ser incorporados.

Este protocolo exige que CHR2 ser expressa nos neurónios de escolha, as moscas que ser alimentado todo-trans-retinal, e que as moscas se banhadas em luz azul brilhante. O protocolo foi desenvolvido atendeu a estes requisitos, ainda não foi totalmente otimizado. Por exemplo, nós acreditamos que a quantidade de luz que usamos pode ser mais brilhante do que o necessário, e que uma concentração mais elevada de ácido todo-trans-retinal, ou mais, alimentando time, pode resultar em uma maior taxa de decolagem. Nós não têm sistematicamente explorado esses parâmetros.

Os FOMA-1 neurónios que activam são encontrados no complexo lobula da mosca, e são, portanto, situado perto da superfície da parte de trás do cérebro. É possível que o sucesso desta experiência baseia-se nos neurónios estarem próximos da superfície, tal como a luz deve penetrar através da cutícula da mosca para activar CHR2. Assim, as células situadas mais profundamente no cérebro pode não ser activada com sucesso utilizando este método.

O condutor G105 é expressa em um conjunto de 5 neurónios em cada um dos lados do lóbulo óptico, Foma-1 neurónios, bem como em neurónios do γ lóbulo do corpo de cogumelo. Felizmente, tivemos um motorista para fazer experimentos de controle para eliminar um papel dos neurônios do corpo de cogumelos no comportamento de fuga. No entanto, se a ativação de todos os 10 FOMA-1 neurônios são necessários para este comportamento, ou se há apenas um ou doiscélulas específicas são suficientes, não pode ser determinada neste momento. À medida que mais drivers específicos são desenvolvidos e as estratégias intersetoriais para limitar a expressão são refinados ^1,14, esperamos ser capazes de atingir os neurônios com maior especificidade.

Criptocromos são fotorreceptores envolvidos em ritmos circadianos e comportamentos que são sensíveis à luz azul. Neste protocolo, criptocromos provavelmente são ativadas pela luz azul usado para estimular chr2. Este não parece influenciar o comportamento de decolagem observado aqui, como a baixa taxa de decolagem observado em moscas de controle (para o qual a luz azul ativa os criptocromos mas não chr2 em foma-1 neurônios) se aproxima da taxa de tomar Observou-off no controle voa sem iluminação ou quando iluminados com luz verde (que não activa criptocromos). No entanto, para outros comportamentos que estão mais diretamente influenciados por criptocromos, isso pode ser problemático. Um potencialmelhora a evitar esta poderia ser a utilização de um channelrodopsina vermelho-deslocado que é activado por amarelo, 589 nm, a luz ^15.

Em nossos experimentos, observamos um baixo nível de espontânea decolagens tal que ~ 10% de moscas controle decolou dentro de 1 seg de iluminação LED, e 13-28% dentro de 5 segundos. Como observamos essa mesma taxa de decolagem quando as moscas foram iluminadas com luz verde que não efetivamente ativar chr2, assim como moscas sem qualquer iluminação, acreditamos que estes eram vôos espontâneos em vez de luz induzidas descolagens. O efeito da activação de FOMA CHR2-1 neurónios no comportamento de escape deve, portanto, ser medida no topo desta actividade espontânea. Para outros comportamentos que não envolvem a descolagem, contudo, isto pode resultar em ensaios terminados se moscas escapar a partir da plataforma, antes da execução do comportamento testado. O grau em que essas fugas espontâneas representar um inconveniente experimental é obviously dependente de escala de tempo do comportamento de interesse.

Não há conflitos de interesse declarados.

Este trabalho foi financiado por uma bolsa Dean Stanford (SEJdV), dos Institutos Nacionais de Saúde Prêmio Diretor Pioneer (TRC DP0035350), um Prêmio Fundação McKnight estudioso (TRC) e R01 EY022638 (TRC).