Optogenetic تحفيز السلوك في الهروب

أدوات ترميز وراثيا optogenetic تمكين التلاعب موسع من الخلايا العصبية المحددة في ذبابة الفاكهة الدماغ. يمكن لهذه الأدوات تحديد الخلايا العصبية التي التنشيط كافية للحصول أو قمع السلوكيات معينة. هنا نقدم طريقة لتفعيل Channelrhodopsin2 التي يعبر عنها في الخلايا العصبية المستهدفة في الذباب المشي بحرية.

وهناك عدد متزايد من الأدوات المشفرة وراثيا أصبحت المتاحة التي تسمح غير الغازية التلاعب في النشاط العصبي للخلايا العصبية الخاصة في ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا ^1. ومن أهم هذه الأدوات هي optogenetic، والتي تتيح تفعيل أو إسكات من الخلايا العصبية المحددة في الحيوان سليمة والتحرك بحرية باستخدام الضوء الساطع. Channelrhodopsin (ChR2) هي قناة الموجبة للضوء المنشط أنه عندما تفعيلها من خلال الضوء الأزرق، وأسباب إزالة الاستقطاب من الخلايا العصبية التي تعبر عن ذلك. وكان ChR2 فعالة لتحديد الخلايا العصبية الحرجة لسلوكيات معينة، مثل تجنب ₂ CO والإرشاد وخرطوم العملاقة الألياف بوساطة ردود الفعل المفاجئة ^2-4. لكن، وكما تستخدم مصادر الضوء المكثف لتحفيز تحفيز خلايا مستقبلة للضوء ChR2 أيضا، لم هذه التقنيات optogenetic سبق المستخدمة في النظام البصري. هنا، ونحن الجمع بين نهج optogenetic مع الطفرة التي يضعف لphototransduction التجريبيnstrate أن تفعيل مجموعة من الخلايا العصبية الحساسة للتلوح في الأفق في الفص الذبابة البصرية، FOMA-1 الخلايا العصبية، يمكن أن تقود سلوك الهروب استخدامها لتجنب الاصطدام. كنا على أليل فارغة من عنصر حاسم من الشبكة phototransduction، فسفوليباز C-β، المشفرة بواسطة الجينات norpA، لجعل الذباب المكفوفين وأيضا استخدام Gal4-UAS نظام المنشط النسخي لدفع التعبير عن ChR2 في FOMA-1 الخلايا العصبية. توضع الذباب الفردية على منصة صغيرة محاطة المصابيح الزرقاء. عندما تضاء المصابيح، ويطير بسرعة الإقلاع في رحلة، بطريقة مشابهة لسلوك الهروب النول مدفوعة بصريا. ونحن نعتقد أن هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة لدراسة السلوكيات الأخرى في التحرك بحرية الذباب.

وقد وضعت ترسانة متزايدة من الأدوات المشفرة وراثيا لمعالجة النشاط العصبي في خلايا معينة في ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا ^1. هذه الأدوات تمكن تفعيل موسع أو إسكات من الخلايا العصبية المحددة في الحيوان سليمة وتتحرك بحرية. ومن بين هذه، Channelrhodopsin2 (ChR2)، قناة الموجبة للضوء المنشط، ويقدم المزايا الرئيسية، حيث يمكن أن تسيطر مؤقتا والتي يسببها بسرعة. عندما الخلايا العصبية التي يتعرض لها صريحة ChR2 إلى الضوء الساطع (470 نانومتر) الزرقاء التي تظهر بسرعة ويزيل الاستقطاب ارتفاعا في معدلات اطلاق ^3-5. وقد كشفت هذه الخلايا العصبية المستهدفة تفعيل محددة في الحيوانات التحرك بحرية كفاية من الخلايا العصبية خاصة لتجنب السلوكيات مثل ₂ CO ^3، خرطوم تمديد ^2،4، والألياف العملاقة الردود جفل بوساطة ^4. لكن، وكما مصادر ضوء مكثفة اللازمة لتحفيز خلايا مستقبلة للضوء أيضا تحفيز ChR2، وتطبيق البروتوكول الاختياريكان محدودا لتقنيات togenetic النظام البصري. من خلال الجمع بين نهج optogenetic مع الطفرة التي يضعف phototransduction، وقد أثبتنا أن تفعيل مجموعة محددة من الخلايا العصبية في الفص الذبابة البصرية يمكن أن تدفع سلوك الهروب استخدامها لتجنب الاصطدام ^6.

معظم، إن لم يكن كلها، والحيوانات البصرية يحمل سلوك الهروب لتجنب الاصطدامات مع كائنات قادمة في الاتجاه المعاكس. المشي أو ثابتة الذباب، عندما قدم مع حادث تصادم تلوح في الأفق، الإقلاع إلى الطائرة، بعيدا عن التصادم قدوم ^7-9. وتتميز هذه الموازنة من قبل أخذها إلى أجنحة أثار قبل اقلاعها ومسار رحلة غير مستقرة ^10،11. هذا الرد يختلف عن استجابة العملاقة الألياف بوساطة جفل، القفزات التي لا يسبقها أجنحة المثارة، ويؤدي عادة في تعثر السقوط الحر ^4،9. وبعد تحديد مجموعة محددة من الخلايا العصبية الحساسة تلوح في الأفق في الفص البصري، FOMA-1 الخلايا العصبية، التي هي UNIQUسعينا اعل ضبطها لترميز الأشياء تقترب، لبحث مشاركتها في الذبابة تلوح في الأفق السلوك الهروب. نحن هنا لشرح استخدام optogenetics لتفعيل هذه الخلايا العصبية بشكل انتقائي وتثير السلوك الذبابة الهروب.

نستخدم نظام Gal4-UAS المنشط النسخي لدفع التعبير عن ChR2 في الخلايا العصبية-1 FOMA. ChR2 يتطلب العامل المساعد للجميع عبر الشبكية وكما تم العثور على هذا في مستويات منخفضة في النظام المركزي العصبي ذبابة الفاكهة يجب أن تستكمل في النظام الغذائي للذباب. ^3،4 كما يتم استخدام الضوء الساطع لتفعيل ChR2 والذباب يحمل السلوكيات ضوئية السلوك قوية ^12، سعينا إلى القضاء على إمكانية استجابة لحافز البصرية. للقيام بذلك، كنا الحيوانات التي كانت متحولة متماثلة اللواقح أليل لاغية من الجين norpA، الذي يشفر عنصر حاسم من الشبكة phototransduction، فسفوليباز C-β. مبصرات في الذباب متحولة غير قادر على مثل هذه المسؤولةد الضوء ^13. لاختبار التحفيز optogenetic للاستجابة الهروب، ونحن بحاجة لعزل ذبابة واحدة ويستحم في ضوء زرقاء لامعة. للقيام بذلك، ونحن نضع الفرد في الذباب نصائح الماصة. يتم وضع طرف واحد الماصة في حامل مخصصة، مثل أن يطير سوف يسير geotactically حتى تلميح والخروج على منصة مستطيلة. الطاير قادرة على المشي بحرية حول على رأس هذا النظام الأساسي. وتحيط بها سلسلة منصة الزرقاء 4 الصمام، كل يحتوي على 3 المصابيح، وتركز على الجزء العلوي من المنصة. بعد الطاير على المنصة، والمصابيح مضاءة، ويتم تسجيل رد الذبابة باستخدام كاميرا عالية السرعة ^6.

1. توليد الذباب Channelrhodopsin

1. عبر UAS-ChR2 الذباب مع السائق Gal4 من اختيارك، ونحن نستخدم G105-Gal4، وهو ما يعبر عنه في الخلايا العصبية-1 FOMA في الفص البصري.
2. للقضاء على احتمال وجود استجابة البصرية لتحفيز الضوء الأزرق، سواء خطوط الطيران في الخلفية AW ⁺ norpA.
3. النتيجة النهائية: W ⁺ norpA؛ G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. بعد الكبار الذباب eclose، وطرح الإناث على اختيار الأغذية الطازجة، على أن تستكمل مع 10 ميكرومتر جميع العابر الشبكية (شارك في العوامل اللازمة لChR2) ومحمية من الضوء، لمدة 3 أيام قبل إجراء الفحص السلوكي.

2. جعل 10 ميكرومتر جميع العابر الشبكية الغذاء المحسن

1. 100 ملغ من حل جميع الشبكية العابر في 17،6 مل من الايثانول 95٪ لجعل 20 ملي الشبكية. إبقاء جميع العابر الشبكية محمية من الضوء في جميع الأوقات.
2. تذوب معيار دقيق الذرة الغذاء يطير في الميكروويف، والسماح لتبرد حتى دافئة للمس.
3. خلط 50 ميكرولتر من 20 مليجميع العابر الشبكية في قارورة من 10 مل من الغذاء الطاير.
4. اسمحوا تبرد قوارير والحفاظ على محمية من الضوء.

3. معدات

1. نصائح الماصة: يتم قطع القياسية 1000 نصائح الماصة ميكرولتر قرب الطرف، وخلق قطر المسام من 2،25 ملم ~.
2. منصة (انظر الشكل 1).
   1. قاعدة Delrin، شيد 17 سم X 25 سم، مع ثقوب الخيوط في كل ركن لتناسب ¼ "خرطوم المبرد موصلات معاهدة حظر الانتشار النووي.
   2. ومرفق حامل عمودي، مصنوعة من Delrin، إلى مركز للقاعدة. الأبعاد الكلية هي 25 مم X 40 مم X 65 مم (الارتفاع X العرض X العمق). أخدود 10 مم واسعة تمتد على طول حامل، مع المسمار الإبهام في الأسفل. ومرفق النظام الأساسي إلى أعلى حامل، 25 مم X 40 مم X 10 مم، مع وجود ثقب قطره 3،5 مم تتماشى مع الأخدود في حامل.
3. الصمام صفائف (انظر الشكل 1).
   1. أربعة أذرع للخرطوم المبرد، ~ 18 سم طويلة، تلصق على منصة BASه باستخدام الرابط خرطوم المبرد. خرطوم المبرد يستخدم فقط الدعم الهيكلي وعدم استخدامها لأغراض التبريد.
   2. يتم قطع الأخاديد متباعدة بشكل صحيح في الجزء الأخير من المبرد الخراطيم من كل ذراع لتركيب المشتت الحراري إلى نهاية كل ذراع.
   3. هي التي شنت A المتمردين الأزرق LED ثلاثي نجوم لكل بالوعة الحرارة باستخدام قبل قطع شريط لاصق الحراري. A 18 ° Carclo تم تثبيت ثلاثي العدسة لكل نجم ثلاثي.
   4. يتم السلكية LED ثلاثي نجوم لبرامج التشغيل DC BuckPuck وإمدادات الطاقة كما هو محدد. لقد رتبنا لدينا مجموعة المتابعة مع كل BuckPuck المحرك 2 ثلاثي نجوم في السلسلة.
   5. الإضاءة LED من كل أربعة نجوم ثلاثي ب 700 مللي أمبير وأسفرت عن الإشعاع من 713 W / م ² على برنامجنا.
4. الكاميرا: الكاميرا هي التي شنت على ترايبود الصغيرة وركز على الجزء العلوي من المنصة.

4. الفحص السلوكي

1. تخدير لفترة وجيزة الذباب على الجليد.
2. وضع الفرد في الذباب نصائح الماصة، وذلك باستخدام الشريط لإغلاقكلا طرفي الإكراميات.
3. بعد الذباب واستيقظت واستكشاف بنشاط غيض الماصة، وإزالة الشريط ووضع الماصة في الأخدود في حامل عمودي. يتم استخدام إبهامي لتأمين طرف الماصة في مكان وإغلاق أسفل الحافة.
4. كما يستكشف الطاير طرف الماصة (30 عادة - 60 ثانية)، بدء التسجيل قبل الكاميرا الطاير يخرج من الطرف على المنصة.
5. بعد الطاير ظهرت على منصة، والانتظار 1-2 SECO، وتشغيل المصابيح الزرقاء. استخدام جهاز توقيت لقياس الوقت يدويا حتى يبدأ رحلة الطاير.

أعمى يطير يعبر عن ChR2 أو برنامج تشغيل G105 وحدها تظهر انخفاض معدل الإقلاع بعد إضاءة الضوء الأزرق مع مشرق. أعمى يطير عرضت بنفس المعدل من خارج بغض النظر عن اتخاذ الإضاءة (الشكل 2)، مما يشير إلى أن هذه الموازنة كانت عفوية أخذها إلى بدلا من الإضاءة نظرا لمع الضوء الأزرق. عندما يتم التعبير عن ChR2 في الخلايا العصبية Foma1، ومع ذلك، مع إضاءة الضوء الأزرق يثير استجابة الهروب. استغرق أكثر من 50٪ من اختبار الذباب من خلال 1 ثانية من الإضاءة، و 75٪ في غضون 5 ثوان (الشكل 2). في المقابل، لم تكن الا 10٪ من الذباب قبالة السيطرة داخل ثانية 1، و 20٪ خلال 5 ثوانى. كما أعرب كل من السائق G105-1 في الخلايا العصبية وFOMA في الفص-γ من الجسم الفطر، استخدمنا سائق أعرب تحديدا في هذا الجزء من الجسم الفطر (201Y-Gal4) كعنصر تحكم إضافية. عرضت هذه الذباب معدل المردود مماثلة لعناصر التحكم الأخرى يؤديها (الشكل 2)، مشيرا إلى أن تفعيل تحديدا optogenetic من الخلايا العصبية-1 FOMA أثارت استجابة الهروب.

كشفت التصوير سرعة اتخاذ بسرعة 200 لقطة في الثانية من الردود التي يسببها optogenetically أن هذه الاستجابات كانت مشابهة لسلوك الهروب النول أثار (الشكل 3). وهي تصوير أثار 90٪ من الذباب أجنحتها قبل الإقلاع (ن = 30) ^6. علاوة على ذلك، كان مسار الرحلة التي تلت ذلك أقل استقرارا من عمليات الاقلاع الطوعية ^10، مع جسم الذبابة يجري في اتجاه رأسي إلى حد ما (الشكل 3)، ولكن أكثر استقرارا من عملاق ردود بوساطة الألياف ^9.

الشكل 1. التجريبية انشاء منصة تظهر مع حامل الرأسي وسائل التبريد 4 الخراطيم الأسلحة عقد أحواض الحرارة مع المصفوفات LED الملصقة عليها. Aوانشاء تحت الإضاءة المحيطة. B، وانشاء عندما تضاء المصابيح. C، ونظرا لقرب على النجمة الصمام ثلاثي على امتصاص الحرارة. D، وقرب من نجوم ثلاثي مع عدسة ثلاثية المرفقة. E، تخطيطي للسائق Buckpuck والدوائر LED. F، مخطط الرسم البياني لBuckPuck والدوائر LED.

الشكل 2. الرسم البياني التراكمي من وقت الانتقال لخطوط الطيران الهروب التجريبية والضابطة. جميع التعبير عن الذباب ث ⁺ norpA لجعلها أعمى البصر. "FOMA-1" الذباب لديك برنامج التشغيل G105-Gal4؛ "MB" الذباب لديك برنامج التشغيل 201Y-Gal4 الذي يدفع التعبير في الجسم الفطر.

الشكل 3. عالية السرعة من إطارات الفيديو ChR2 الردود الهروب المتعمد. يتم ترقيم إطارات متتاليةially مع 5 مللي ثانية بين الإطارات.

لقد أثبتنا التحفيز optogenetic من السلوكيات الهروب من الاستحمام بحرية المشي الذباب في ضوء زرقاء لامعة. يمكن تكييفها بسهولة هذا النهج لدراسة السلوكيات الأخرى في الذباب المشي بحرية، ويمكن زيادتها إلى أكبر منصات من قبل تبليط ببساطة صفائف LED كنا على مساحة أكبر. سواء باستخدام الكاميرا غير مكلفة وصفنا، أو غيرها من أنظمة الكاميرات المتوفرة، يمكن للمستخدم تصميم حصلت على معدل الإطار والتحليل المكاني من الصور لتتناسب مع سلوك الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، يقتصر التصوير لدينا لوقت بعد تضاء المصابيح، والمصابيح الزرقاء توفير الإضاءة للكاميرا وكذلك تفعيل ChR2. هذا يكفي لسلوكنا، ولكن إذا كان الموقف أو حركة الطيران الإضاءة LED قبل يحتاج إلى تسجيل، يمكن أن تدمج مصادر الضوء إضافية إشارات في نطاق الأشعة تحت الحمراء، جنبا إلى جنب مع فلترة مناسبة للكاميرا.

هذا البروتوكول يتطلب أن يتم التعبير عن ChR2 في الخلايا العصبية في الاختيار، أن يكون الطعام الذباب جميع عبر الشبكية، وأن استحم في ضوء الذباب الأزرق الساطع. وقد اجتمع بروتوكول قمنا بتطوير هذه المتطلبات، ولكن لم يتم بشكل كامل الأمثل. على سبيل المثال، فإننا نعتقد أن كمية الضوء التي نستخدمها قد يكون أكثر إشراقا مما هو ضروري، وأن تركيز أعلى من جميع الشبكية العابر، أو لفترة أطول تغذية منظمة الشفافية الدوليةلي، يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع معدل المردود. نحن لم تستكشف بشكل منهجي من هذه المعلمات.

تم العثور على الخلايا العصبية-1 FOMA نحن في المجمع تفعيل lobula من ذبابة، وبالتالي تقع على مقربة من سطح الخلفي من الدماغ. فمن الممكن أن نجاح هذه التجربة يعتمد على الخلايا العصبية لقربها من السطح، كما يجب ان تخترق من خلال ضوء بشرة الذبابة لتفعيل ChR2. وبالتالي، قد لا تقع أعمق الخلايا في الدماغ تفعيلها بنجاح باستخدام هذا الأسلوب.

وأعرب السائق G105 في كتلة الخلايا العصبية من 5 على كل جانب من الفص البصري، وFOMA-1 الخلايا العصبية، وكذلك في الخلايا العصبية في الفص-γ من الجسم الفطر. لحسن الحظ، كان لدينا سائق للقيام تجارب السيطرة للقضاء على دور الخلايا العصبية الجسم الفطر في سلوك الهروب. ومع ذلك، ما إذا كان يلزم تفعيل جميع الخلايا العصبية 10-1 FOMA لهذا السلوك، أو ما إذا كانت هناك فقط واحد أو اثنينخلايا معينة كافية، لا يمكن تحديده في الوقت الحالي. كما يتم تطوير برامج أكثر تحديدا، ويتم تنقيح الاستراتيجيات المتعدد الجوانب للحد من التعبير ^1،14، فإننا نتوقع أن تكون قادرة على استهداف الخلايا العصبية مع زيادة خصوصية.

Cryptochromes هي خلايا مستقبلة للضوء المشاركة في الإيقاع اليومي والسلوكيات التي تعتبر حساسة للضوء الأزرق. في هذا البروتوكول، يتم تنشيط المرجح cryptochromes من الضوء الأزرق المستخدمة لتحفيز ChR2. هذا لا يبدو أنها تؤثر في السلوك الاقلاع لاحظ هنا، كما انخفاض معدل المردود لوحظ في الذباب التحكم (التي على ضوء الأزرق ينشط cryptochromes ولكن ليس في الخلايا العصبية ChR2-1 FOMA) مباريات عن كثب معدل اتخاذ مرة والتي لوحظت في مراقبة يطير دون إضاءة أو عندما مضيئة مع الضوء الأخضر (الذي لا يتم تنشيط cryptochromes). ومع ذلك، لالسلوكيات الأخرى التي يتأثر بشكل مباشر cryptochromes، وهذا قد يثبت إشكالية. واحد المحتملةيمكن أن تحسن لتجنب أن يكون هذا استخدام channelrhodopsin الحمراء تحولت التي يتم تفعيلها من خلال الصفراء، 589 نانومتر، وعلى ضوء ^15.

في تجاربنا، لاحظنا انخفاض مستوى عفوية عمليات الاقلاع بحيث ~ 10٪ من الذباب التحكم أقلعت في حدود 1 ثانية من الإضاءة LED، و13-28٪ في غضون 5 ثوان. كما لاحظنا هذا المعدل ذاته من خارج اتخاذها عند أضيئت الذباب مع الضوء الأخضر الذي لم يفعل بشكل فعال ChR2، وكذلك الذباب دون أي الإضاءة، ونحن نعتقد أن هذه الرحلات كانت عفوية بدلا من الضوء الناجم عن إقلاع. ولذلك يجب أن تأثير ChR2 تفعيل الخلايا العصبية-1 FOMA على سلوك الهروب أن يقاس على رأس هذا النشاط العفوي. لالسلوكيات الأخرى التي لا تنطوي على الإقلاع، ولكن هذا قد يؤدي إلى إنهاء المحاكمات إذا الذباب الهروب من منصة قبل تنفيذ السلوك التي تم اختبارها. إلى أي مدى هذه هروب عفوية تمثل إزعاج التجريبية هو obvioتعتمد على مقياس الوقت usly من سلوك الفائدة.

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الزمالة وعميد جامعة ستانفورد في (SEJdV)، والمعاهد الوطنية للصحة جائزة الريادة المدير (TRC DP0035350)، جائزة مؤسسة ماكنايت الباحث في (TRC) وR01 EY022638 (TRC).