Flexão Medidas rigidez de Biopolímeros usando ensaios de deslizamento

Um método para medir o comprimento de persistência ou rigidez à flexão de biopolímeros é descrito. O método utiliza uma cinesina-driven microtúbulos ensaio deslizar para determinar experimentalmente o comprimento persistência dos microtúbulos individuais e é adaptável a actina ensaios baseados em deslizamento.

Microtúbulos do citoesqueleto são polímeros que têm um papel na divisão celular, a mecânica de células e transporte intracelular. Cada uma dessas funções requer microtúbulos, que são rígidas e reto suficiente para abranger uma fracção significativa do diâmetro da célula. Como resultado, o comprimento de persistência de microtúbulos, uma medida de rigidez, tem sido activamente estudados nas duas últimas décadas ^1. No entanto, permanecem questões abertas: microtúbulos curtas são 10-50 vezes menos rígido do que os microtúbulos de comprimento ^2-4, e mesmo os microtúbulos longos mediram comprimentos de persistência que variam de uma ordem de magnitude ^5-9.

Aqui, apresentamos um método para medir o comprimento persistência microtúbulos. O método baseia-se num ensaio de cinesina-driven microtúbulos deslizamento ^10. Através da combinação de marcação fluorescente esparsa de microtúbulos individuais com acompanhamento única partícula de fluoróforos individuais associadas ao microtúbulo, o glidintrajetórias g de microtúbulos individuais são controlados com nível de precisão nanométrica. O comprimento das trajectórias de persistência é o mesmo que o comprimento de persistência do microtúbulo sob as condições utilizadas ^11. Uma rotina de rastreamento automatizado é utilizado para criar trajectórias de microtúbulos a partir de fluoróforos ligados aos microtúbulos individuais, e o comprimento desta trajectória persistência é calculada utilizando rotinas escritas em IDL.

Esta técnica é rapidamente implementável, e capaz de medir o comprimento de 100 persistência microtúbulos no mesmo dia da experimentação. O método pode ser estendido para medir o comprimento da persistência sob uma variedade de condições, incluindo a duração de persistência como uma função do comprimento ao longo dos microtúbulos. Além disso, as rotinas de análise utilizados pode ser estendido a miosina ensaios baseados em acção de deslizamento, para medir o comprimento dos filamentos de actina persistência também.

O citoesqueleto, uma rede de biopolímeros encontrados na maioria das células eucariotas, desempenha um papel na organização celular, transporte intracelular, e da mecânica de células. As características mecânicas dos biopolímeros do citoesqueleto (principalmente actina e microtúbulos) desempenham um papel importante na determinação das características mecânicas da célula como um ¹² todo. Uma vez que a mecânica de células inteiras pode caracterizar as células saudáveis ​​e doentes ^13,14 e está envolvido na motilidade celular ^15, as propriedades mecânicas dos componentes do citoesqueleto subjacentes têm sido uma área activa de estudo para as duas últimas décadas ^1.

A flexibilidade (ou rigidez) de biopolímeros é caracterizado pela persistência comprimento, o comprimento do polímero, que se dobra por aproximadamente um radiano sob flutuações térmicas à temperatura ambiente. Um número de técnicas têm sido desenvolvidas para medir o comprimento da persistência ^16, por example técnicas activas que envolvem flexão do polímero utilizando fluxo hidrodinâmico, armadilhas ópticas, ou campos eléctricos ^4,17,18, e técnicas passivas que medem as variações de polímeros livres em solução de ^5,6. As medidas activas, no entanto, exigem instalações especializadas para implementar forças conhecidas na escala micrométrica, e as medições de flutuação livre pode ser um desafio devido à difusão para fora do plano de focagem do microscópio utilizado.

Neste artigo, descrevemos um complementar, a técnica passiva, para medir o comprimento persistência de microtúbulos, um polímero do citoesqueleto. A técnica envolve a ensaios de deslizamento, que asseguram que o polímero permanece sempre no plano focal ^19. Além disso, envolve rastreamento fluoróforos individuais ligados permanentemente ao polímero de interesse, de modo a que locais específicos ao longo do polímero estão bem caracterizados.

Uma caricatura do método é mostrado na Figure 1. Cinesina move especificamente para a extremidade + de microtúbulos, de modo que os microtúbulos em um ensaio de deslizamento são impulsionadas unidireccionalmente. A extremidade dianteira do microtúbulo, para além da última cinesina ligado, está livre para oscilar sob as forças térmicas da solução circundante. À medida que o microtúbulo é impelido para a frente, a fim flutua até se ligar a uma molécula de cinesina novo mais ao longo da lâmina de vidro congela numa variação determinada. Porque cinesina atribui microtúbulos muito fortemente, a microtúbulos é obrigada a seguir o caminho da extremidade dianteira. Portanto, as flutuações estatísticas congelados na trajectória de microtúbulos são as mesmas que as flutuações estatísticas da extremidade livre dos microtúbulos ^11, e pode, portanto, ser utilizadas para calcular o comprimento de acordo com persistência a ²⁰

onde _p l é o comprimento de persistência do microtúbulo, θ _s é o ângulo entre as tangentes à trajetória separados por um comprimento de contorno, e <> denota uma média sobre todos os pares de posições, separadas por um comprimento de contorno.

O ensaio de deslizamento próprio usa cinesina biotinilado na ²¹ coiled-coil se liga especificamente a lâmina de vidro por meio de uma ligação biotina-estreptavidina. Esta ligação assegura que os domínios do motor está livre para se ligar a microtúbulos e impulsionar. A fim de acompanhar as trajetórias de microtúbulos, os microtúbulos são escassamente marcado com fluoróforos orgânicos ^22,23 - os rótulos devem ser escasso o suficiente para que fluoróforos individuais são resolúveis por microscopia de fluorescência única molécula. Fluoróforos individuais são rastreados usando rotinas de análise de imagem escritas em IDL. As trajetórias de cada fluoróforo ligado a um microfone dadorotubule são combinados em uma trajetória de microtúbulos composto automaticamente ^24. Os ângulos θ tangentes a cada ponto ao longo de uma trajetória são calculados, a partir desses ângulos tangentes a s> valor é calculado para cada s comprimento do contorno. Finalmente, estes dados estão aptos a equação. 1, a fim de extrair um comprimento de persistência para um microtúbulo dado, ou para muitos microtúbulos no ensaio de deslizamento mesmo.

O método é suficientemente robusto para trabalhar com microtúbulos preparados numa grande variedade de condições (com diferentes agentes estabilizadores ou outras moléculas pequenas ligadas ao microtúbulo, com proteínas de microtúbulos ligados associados (MAPs), ou com uma variedade de soluções viscosas). No nosso laboratório, a técnica tem sido utilizada para caracterizar a duração de persistência de microtúbulos, como uma função do comprimento ao longo dos microtúbulos e microtúbulos com diferentes agentes estabilizantes. A principal restrição é que os microtúbulos deve ainda suporte motilidade cinesina. Uma vez que é uma enzima cinesina do motor robusto, este é uma restrição relativamente solta. Através da substituição de microtúbulos com a actina e com uma enzima de cinesina família miosina, o comprimento de persistência da actina podem ser medidos utilizando a mesma técnica.

1. Microtúbulos deslizamento Ensaio Soluções de Stock

Preparar antes do ensaio de deslizamento.

1. Polimerizar 0,5 mg escassamente microtúbulos marcados com fluoróforo brilhante orgânico ^22. A concentração etiqueta-alvo é um fluoróforo por micrómetro de microtúbulo, ou a densidade de etiquetagem de cerca de 1 por 1500 fluoróforo dímeros de tubulina. Armazenar à luz à temperatura ambiente, protegida com uma folha de alumínio, até duas semanas.
2. Purifica-biotina-cinesina ²¹ a cerca de 1 uM. Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 5 ul para utilização em experiências individuais.
3. Preparar o tampão de ensaio (AB), de 50 imidiazole mM, 50 mM de cloreto de potássio (KCl), 4 mM de cloreto de magnésio _(MgCl2), 2 mM de etileno glicol tetracético (EGTA), pH 6,7. Filtro estéril e armazenar a 4 ° C.
4. Dissolver biotinilado albumina de soro bovino (BSA-biotina) a 2 mg / ml em AB. Filtre com filtro de seringa de 0,2 | im.Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 100 ul por longos períodos, a 4 ° C, durante até um mês.
5. Dissolver estreptavidina (SA) a 10 mg / ml em AB. Filtre com filtro de seringa de 0,2 | im. Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 20 ul por longos períodos, a 4 ° C durante um período máximo de duas semanas.
6. Dissolver α-caseína a 5 mg / ml em AB. Filtre com filtro de seringa de 0,2 | im. Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 100 ul por longos períodos, a 4 ° C durante um período máximo de duas semanas.
7. Dissolver ditiotreitol (DTT) em água desionizada a 200 mM. Armazenar a -20 ° C em alíquotas de 100 ul, utilizar dentro de 8 horas de descongelamento. Pode ser novamente congelado.
8. Dissolver o paclitaxel (PT) em grau HPLC sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 4 mM. Armazenar em alíquotas de 10 ul a -80 ° C a longo prazo, de -20 ° C a curto prazo. Utilizar dentro de 8 horas de descongelamento. Pode ser novamente congelado.
9. Dissolver glucose em água desionizada a 120 mg / ml. Armazenar em alíquotas de 100 uL a -20 ° C. Pode ser novamente congelado.
10. Disresolver o trifosfato de adenosina (ATP) em água desionizada a 150 mM, pH 7,0. Armazenar em aliquotas de 5 uL a -80 ° C, utilizar dentro de 8 horas de descongelamento.
11. Prepare 100x estoque de eliminação de oxigénio ^25, dissolvendo glicose oxidase 10.000 unidades e as unidades de catalase 156000 em 600 ul de tampão de ensaio total. Centrifugar brevemente numa microcentrífuga para sedimentar os sólidos; sobrenadante filtro com 0,2 de filtro de seringa ^ m. Armazenar a -80 ° C em alíquotas de 10 ul por longos períodos, a 4 ° C durante até uma semana.

2. Microtúbulos Gliding Ensaio, Preparação Solução mesmo dia

Preparar as soluções de 2,1-2,6, no dia da experiência. Com a prática, as soluções de 2,2-2,6 podem ser preparados durante o fluxo de células de lavagem. Salvo indicação em contrário, as soluções de manter em gelo.

1. Prepare AB, 1 ml de tampão de ensaio com 10 ul de DTT stock (AB com 2 mM de DTT). Mantenha à temperatura ambiente.
2. Prepare bio-BSA, 40 & mu; L de uma mistura de 1:1 do material de biotina-BSA e AB. Mantenha à temperatura ambiente.
3. Preparar tampão de BSA, 645 uL de mistura de AB, com 5,5 ul de BSA (1 mg / ml de BSA em AB). Mantenha à temperatura ambiente.
4. Preparar tampão SA, misturando 57 ul de estoque AB com 3 ul de estreptavidina (0,5 mg / ml de estreptavidina em AB). Mantenha à temperatura ambiente.
5. Prepare α-caseína tampão, misturando 200 ul de BSA, 50 ul de estoque de caseína, e 0,8 ul de 15 mM de ATP (1 mg / ml α-caseína, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM de ATP em AB). Mantenha à temperatura ambiente.
6. Preparar tampão anti-branqueamento fluorescente, a mistura de tampão 95 ul α-caseína, 2,5 ul de estoque de glicose, uma mistura de oxigénio ul 100x limpeza, um estoque paclitaxel ul, 1 ul de 2-mercaptoetanol (βME). Adicionar βME sob coifa. Utilize uma solução tampão anti-lixívia fluorescência dentro de 1 hora de preparação CUIDADO:. ΒME é altamente tóxico e cheiro horrível. Certifique-se de abrir apenas sob a coifa. Garrafa loja noausência de luz, a luz degrada βME e sua capacidade de reduzir a fotodegradação.

3. Microtúbulos Ensaio Gliding

1. Construção de cerca de quatro pistas de fluxo entre uma lamela 24 mm x 60 e 22 x 22 mm lamela utilizando graxa de vácuo, extrudados de uma seringa através de uma ponteira, como um espaçador. Cada pista de fluxo deve ser de aproximadamente 10 ul de volume (escala volumes subsequentes em conformidade).
2. Lave 10 ul de tampão BSA-bio em cada pista. Incubar 5 min para permitir a BSA para revestir as superfícies de vidro.
3. Lava-se cada pista três vezes com 15 ul de tampão de BSA para remover a biotina livre-BSA, enquanto continua a bloquear a superfície da lâmina. Usar um Kimwipe ou filtro de papel para remover o tampão de um lado oposto da câmara de fluxo, tendo a certeza de não permitir que as bolhas de ar a passar através da câmara de fluxo.
4. Lave 15 ul de tampão-SA em cada pista. Esperar 10 min, ou até 2 horas. A estreptavidina irá ligar à superfície ligada a biotina-BSA.
5. Lava-se cada pista três vezes com 15 ul de tampão de BSA para remover SA livre enquanto continua a bloquear a superfície da lâmina.
6. Lava-se cada via com 15 tampão α-caseína ul. α-caseína ajuda adicional bloquear a ligação não específica de cinesina e microtúbulos ao vidro.
7. Diluir cinesina de 10 nM em tampão de α-caseína e lave cada pista com 15 ul desta cinesina - α-caseína solução. Esperar 15 minutos (ou até uma hora) para a cinesina biotinilado para se ligarem especificamente a estreptavidina ligada à superfície. Os domínios kinesin motores serão livres de microtúbulos se ligam.
8. Diluir com paclitaxel a 40 uM em temperatura ambiente α-caseína-tampão, e lave cada pista com 15 ul desta solução para lavar a cinesina livre e para pré-carregar cada uma das câmaras de fluxo com uma solução de paclitaxel para evitar microtúbulos a partir de despolimerização. Frio também depolymerizes microtúbulos, para ter certeza essas etapas ocorrem em temperatura ambiente com sala de temperature soluções.
9. Diluir marcado por fluorescência microtúbulos 1:100-1:1,000 em tampão anti-branqueador fluorescente com 1 mM de ATP. Lave 15 ul em uma pista e observar dentro de 30 minutos.

4. Coleta de Dados

1. Observar o deslizamento microtúbulos por microscopia de fluorescência, uma microscópio capaz de resolver fluoróforos individuais, tais como uma configuração TIRF comercial ou casa-build é necessária ²⁶ (Figura 2).
   Os microtúbulos devem ser impelido pelos motores cinesina sobre o substrato a cerca de 0,5 um / s, dependendo da temperatura. Se o campo de visão do microscópio é 50 um, os microtúbulos individuais, deverá ser visível durante cerca de 100 segundos. Definido de modo que a intensidade de iluminação fluoróforos individuais não Fotobranqueador mais rapidamente do que 100 segundos. Se utilizar excitação com laser, uma configuração de corrente de aproximadamente 3-5 mW é adequada.
2. Colete sequências de imagens para análise. 600 imagens em5 Hz (total de 2 min) funciona bem. Utilize sequências de tempo suficiente para que os microtúbulos atravessar todo o campo de visão.

5. Análise de Dados

Uma rotina IDL, get_lp.pro , está ligado. Esta rotina retorna um valor de comprimento persistência com base em todas delta microtúbulos em uma seqüência determinada imagem. Ou execute esta rotina em cada seqüência de imagens, modificar os parâmetros de intensidade, dependendo da configuração do seu microscópio especial, ou faça o seguinte:

1. Acompanhar cada fluoróforo ligado a um microtúbulo para criar trajetórias fluoróforo.
2. Combine todas as trajetórias de fluoróforos sobre um microtúbulo dada em uma trajetória de microtúbulos global; repita para cada microtúbulo na seqüência de imagens (Figura 3).
3. Calcula-se o ângulo da tangente para cada ponto ao longo do percurso (Figura 4)E calcular θ _s> na equação. 1 por uma média de co-seno do ângulo de diferença para cada par de pontos separados por um caminho de comprimento s (Figura 5). Encontre o comprimento de persistência para um microtúbulo ou um grupo de microtúbulos por θ _s> a eq. Uma ponderação, os pontos de dados individuais no ajuste do número de valores independentes de cos θ _s que são usados ​​para calcular a média.

Um instantâneo a partir de um ensaio de deslizamento é mostrado na Figura 2. A densidade de microtúbulos bom é microtúbulos 1-10 por campo de observação; substancialmente mais resultará em mistracking como microtúbulos se cruzam. Um gráfico das trajectórias de microtúbulos a partir de 11 no ensaio de deslizamento da Figura 2 é mostrado na Figura 3. Trajetórias típicas são de 10 a 30 ^ m de comprimento; algumas trajetórias têm lacunas onde se cruza com outro microtúbulos. Estes percursos podem ser descartados da análise.

Uma única trajectória de microtúbulos de comprimento é mostrado na figura 4A, com ângulos de tangente exemplo em duas posições ao longo da trajectória. A diferença entre os ângulos de tangente, separados por uma distância fixa está relacionado com o tamanho de persistência, o ângulo da tangente como uma função da posição ao longo da trajectória de microtúbulos é mostrado na Figura 4B.

Os dados de ângulo de tangentea partir de trajectórias de microtúbulos é muitas combinadas para calcular um tamanho de persistência única para todos os microtúbulos em uma dada experiência. Figura 5 mostra um gráfico da s> s θ contra comprimento do contorno para o ensaio de deslizamento da Figura 2. Ao valores de comprimento de contorno grandes, muito poucos valores de cos θ são medidos, daí a média é muito variável. O ajuste ponderado em conformidade com a s curto, de alta precisão de dados mais de perto do que o S tempo, precisão baixa de dados.

O valor do comprimento persistência destas trajectórias 11, 500 ± 40 um (± erro padrão da média), é representativa de persistência para comprimentos relativamente curtos microtúbulos ^2. Experiências similares dão uma variedade de comprimentos de persistência entre 300 e 1000 ^ m.

Solução de problemas

Se microtúbulos estão completamente ausentes, increase a concentração de microtúbulos no passo 3,9-0,5 mg / ml. Se microtúbulos ainda estão desaparecidos, re-polimerizam microtúbulos. Fazer paclitaxel certeza está presente em cada solução de microtúbulos são diluídos em, caso contrário irá microtúbulos despolimerizam.

Se microtúbulos são livremente difundir em solução, mas não de ligação à superfície, aumentar a concentração de cinesina na etapa 3.7 e utilizar AMP-PNP em vez de ATP para assegurar cinesina se liga irreversivelmente os microtúbulos. Se microtúbulos ainda não ligar, fazer estoque estreptavidina novo e tampão, seguido por novo tampão biotina-BSA. Finalmente, purificam cinesina biotinilado novo.

Se microtúbulos se ligam, mas não mover, substituir ATP solução estoque com ATP fresco.

Se fluoróforos Fotobranqueador muito rapidamente, reduzir a intensidade de iluminação. Se fluoróforos ainda Fotobranqueador muito rapidamente, substituir o sistema de captura de oxigénio com estoque fresco.

Se fluorophores são muito fraca, aumentar a intensidade de iluminação.

Figura 1. Dos desenhos animados do ensaio microtúbulos delta. Enzimas kinesin estão especificamente ligados a uma lamela por uma ligação biotina-estreptavidina. Os microtúbulos são escassamente marcado com fluoróforos orgânicos. Após a adição de ATP, os microtúbulos são empurrados pelos motores cinesina. A extremidade dianteira livre do microtúbulo oscila devido às forças térmicas em solução; estas flutuações são usados ​​para calcular o comprimento da persistência do microtúbulo. A escala de comprimento do microtúbulo sondado por estas experiências é o comprimento da extremidade livre.

Figura 2. Instantâneo microscópio típico de um ensaio de deslizamento, tomadas através de microscopia TIRF. Microtu bules são escassamente decorado com fluoróforos individuais. Barra de escala é de 5 m.

Trajectórias Figura 3. Microtúbulos da sequência de imagem mostrado na Figura 2. Cada trajetória microtúbulos combina muitas trajetórias fluoróforo individuais (cerca de 10 em média), e foram diluídos a um ponto por 100 nm.

Figura 4. Calcular os ângulos tangentes a uma trajetória. (A) A trajetória de um microtúbulo, com ângulos exemplo tangente (θ) mostrados. (B) o ângulo da tangente como uma função da posição ao longo da trajectória de microtúbulos. Estes dados são utilizados para calcular os ângulos médios utilizados na Equação. 1.

Medições de comprimento persistência são uma boa caracterização das propriedades mecânicas dos biopolímeros individuais. Neste artigo, descreve um método de medição do tamanho de persistência de microtúbulos. Conforme referido na introdução, este método é facilmente estendido para examinar as propriedades mecânicas de microtúbulos em uma variedade de condições, simplesmente por variação dos reagentes, temperatura, viscosidade ou no último passo do ensaio delta, 3,9, ou por polimerização de microtúbulos, passo 1.1, sob condições diferentes.

A técnica em si é rápido de executar. Uma vez que as soluções de reserva foram preparados antes do tempo (passo 1), numa experiência de ensaio de deslizamento podem ser realizados em 2-3 horas, incluindo um máximo de quatro variações nas condições de uma lâmina de microscópio simples (os quatro pistas na etapa 3.1.) Microtúbulos Muitos podem ser examinados em cada experimento; experiências típicas no nosso laboratório examinar 100 microtúbulos por condição (cerca de seqüenciamento imagem 10es por pista, com 10 microtúbulos por sequência). A análise de grandes conjuntos de dados é também bastante rápido. Com a prática, 10 sequências de imagens podem ser analisadas por tamanho de persistência em uma tarde ou assim com um PC moderno. O passo limitante da velocidade na análise é o tempo para rastrear fluoróforos individuais; novos métodos de localização prometem aumentar esta velocidade substancialmente ^27.

Uma vez que o método envolve o rastreamento fluoróforos individuais ligados a um microtúbulo dado, a precisão de controle só é limitado pela recolha de fotões, e pode estar na escala de ^{22, 25} nanómetros. Com a inclusão de dados a partir de fluoróforos muitos, a precisão é ainda mais melhorada. Potencialmente, uma precisão ainda maior pode ser alcançado, anexando objetos muito brilhantes fluorescentes, como pontos quânticos, ao microtúbulo.

Embora a precisão de trajetórias individuais é muito bom, a incerteza na persistência lengths medidos com esta técnica (na escala de ± 50% durante um único microtúbulo) é ainda significativo. A limitação chave da precisão das medições de comprimento de persistência é a estatística envolvidos na média cos θ _s. À medida que o comprimento do contorno entre pares de pontos, s, aumenta, o número de medições independentes de θ _s diminui à medida que L / s, em que L é o comprimento da trajectória de microtúbulos estudada. O aumento do comprimento das trajectórias de microtúbulos permitiria precisão melhorada na medida do comprimento de persistência.

Uma segunda limitação deste método é a exigência de que biotinilado cinesina-1 ser utilizado para a fixação específica de cinesina de lâminas de microscópio. Cinesina biotinilado deve ser purificado (a partir de E. Coli, no nosso caso), e não pode simplesmente ser adquiridos da prateleira. No entanto, uma modificação do ensaio de deslizamento usando parentes não biotiniladoesin podem ser utilizados ^28; cinesina proteína de cadeia pesada, que poderiam ser adequados para esta técnica encontra-se comercialmente disponível a partir de citoesqueleto (KR01). Modificando o ensaio de deslizamento para usar este cinesina alternativo não afecta a rigidez à flexão de microtúbulos de qualquer forma, e permitiria, assim, os grupos que não têm acesso a proteína recombinante cinesina de usar este método.

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Agradecemos Melissa Klocke de assistência preparando Figura 1 e Anna Ratliff para demonstrar o protocolo. Este trabalho foi financiado pela Corporação de Pesquisa para o Avanço da Ciência.