グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定

持続長や生体高分子の曲げ剛性を測定するための方法が記載されている。この方法は、実験的に個々の微小管の持続長を決定するキネシン駆動型微小管滑走アッセイを使用しており、アクチンベース滑空アッセイに適応可能です。

微小管は細胞分裂、細胞力学、および細胞内輸送の役割を果たす細胞骨格のポリマーである。これらの各関数は、硬いとセル径のかなりの部分にまたがるようにまっすぐに十分である微小管を必要とします。その結果、微小管の持続長、剛性の尺度は、積極的に過去二十年の¹のために研究されました。それにもかかわらず、オープンな疑問が残る：短い微小管が長い微小管^2月4日より10〜50倍未満で硬直している、とさえ長い微小管はマグニチュード^5-9の順序によって異なり永続の長さを測定した。

ここでは、微小管の持続性の長さを測定する方法を提案する。方法はキネシン駆動型微小管滑走アッセイ¹⁰に基づいています。微小管に接続されている個々の蛍光体の単粒子追跡による個々の微小管のまばらな蛍光標識を組み合わせることにより、glidin単一微小管のG軌道はナノメートルレベルの精度で追跡されます。軌道の持続長は^11を使用した条件下で微小管の持続長と同じです。自動追跡ルーチンは、個々の微小管に取り付けられた蛍光団から微小管の軌跡を作成するために使用され、この軌道の持続長はIDLで書かれたルーチンを使用して計算されます。

この技術は急速に実現可能、と実験の一日で100微小管の持続長を測定することが可能である。方法は微小管に沿って長さの関数としての持続長を含め、さまざまな条件の下で持続長を測定するために拡張することができます。さらに、使用される解析ルーチンは、同様にアクチンフィラメントの持続長を測定するために、ミオシンベース演技滑走アッセイに拡張することができます。

細胞骨格は、ほとんどの真核生物の細胞に見出される生体高分子のネットワークは、細胞組織、細胞内輸送、細胞力学の役割を果たしている。細胞骨格（主にアクチンと微小管）の生体高分子の機械的特性は、全体の¹²として、セルの機械的特性を決定する上で重要な役割を果たしている。細胞全体のメカニックが^13,14の健康と病気の細胞を特徴付けることができると細胞運動性¹⁵に関与しているので、基礎となる細胞骨格成分の機械的特性は、過去二十年の¹のための研究の活発な領域となっている。

生体高分子の柔軟性（または剛性）の周囲温度における熱揺らぎの下で約1ラジアンによる持続長、曲がるポリマーの長さによって特徴付けられる。多くの技術がexampための持続長^16を測定するために開発されてきた流体力学的流れ、光トラップ、または電界^4,17,18、および溶液中の遊離ポリマー^5,6の変動を測定する受動的手法を用いてポリマーを曲げ伴うルアクティブ技術。アクティブな測定値は、しかし、専門的なセットアップは、マイクロメートルスケールで知られている力を実装するために必要とし、自由変動の測定は、使用される顕微鏡の焦点面の拡散切れによる挑戦することができます。

この記事では、我々は、微小管、細胞骨格ポリマーの持続長を測定するための補完的な、受動的な、テクニックを説明します。技術は、ポリマーが常に焦点面¹⁹に残っていることを確認し滑空アッセイを伴う。また、ポリマーに沿った特定の場所が十分に特徴付けられるように、興味のあるポリマーに永久的に取り付け追跡単一フルオロフォアを伴う。

メソッドの漫画はFigurに示されているE 1。キネシンは微小管の+端に向けて具体的に移動するので、滑空アッセイにおける微小管は一方向に推進される。微小管の先端は、接続された最後のキネシンを越え、周囲の溶液の熱力の下で変動して自由である。微小管を前方に推進されるように、終わりはスライドガラスに沿ってさらに新しいキネシン分子に結合するまで、与えられた変動でフリーズ変動します。キネシンは非常に強く、微小管を添付しているため、微小管は先端の道を歩むように制約されます。したがって、微小管軌道に凍結統計的変動は微小管¹¹の自由端の統計的変動と同じであるので^、20によると持続長を計算するために使用することができます

L _Pは微小管の持続長であり_、θsは輪郭長で区切ら軌道への接線間の角度であり、<>輪郭長で区切ら位置のすべてのペアの平均を表している。

滑空アッセイ自体は、特にストレプトアビジン-ビオチン結合を介してスライドガラスに結合したコイルドコイル²¹でキネシンビオチン化が使用されます。このアタッチメントは、モータードメインはに結合し、微小管を推進して自由であることを保証します。微小管の軌跡をたどるためには、微小管はまばらに有機フルオロフォアで標識されている^22,23 -ラベルは単一フルオロフォアが単一分子蛍光顕微鏡を用いて解決可能であることを十分に疎である必要があります。単一フルオロフォアはIDLで書かれた画像解析ルーチンを使用して追跡されます。各蛍光体の軌道が与えられたマイクにバインドrotubuleは自動的に²⁴複合微小管軌道に結合されます。軌道に沿った各点からθ接線の角度が計算され、これらの接線の角度からs>の値は、各輪郭長 sのために計算される。最後に、これらのデータは、式に合わされます。 1与えられた微小管のために持続長を抽出するために、または同じ滑走アッセイにおける多くの微小管のため。

この方法は、さまざまな条件（異なる安定化剤または微小管に結合した他の小分子と、結合した微小管関連タンパク質（MAP）を使って、または粘性溶液の様々）で作製した微小管で動作するように十分に堅牢です。私たちの研究室では、この技術は、異なる安定剤と微小管と微小管に沿って長さの関数として、微小管の持続長を特徴付けるために使用されています。主な制限は、微小管がまだの必要があるということですupportコマンドキネシンの運動。キネシンは、堅牢なモーター酵素であるので、これはかなり緩い制限です。ミオシンファミリーの酵素を用いてアクチンとキネシンと微小管を交換することによって、アクチンの持続長は、同じ手法を用いて測定することができる。

1。微小管グライディングアッセイストックソリューション

前方に滑空アッセイの準備をします。

1. まばらに明るい有機蛍光色素で標識された²² 0.5mgの微小管を重合する。目標ラベル濃度は1マイクロメートルの微小管あたりフルオロフォア、または1500チューブリン二量体あたり約1フルオロフォアの標識密度である。室温、アルミで保護光、最大2週間のために箔で保存してください。
2. 約1μMでビオチンキネシン^21を精製^する 。 -80℃で保存、個々の実験で使用するための5μlをインチ
3. 50mMのimidiazole、50mMの塩化カリウム（KCl）、4 mMの塩化マグネシウム（MgCl _2）、2mMのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、pH値6.7のアッセイバッファー（AB）を準備します。 4で滅菌フィルターと℃で保存
4. ABの2 mg / mlに（ビオチン-BSA）をビオチン化ウシ血清アルブミンを溶解。 0.2μmのシリンジフィルターでフィルタリングします。-80℃で保存4℃で長期間100μlアリコート中のC、°1月までのC。
5. ABの10 mg / mlにストレプトアビジン（SA）を溶かす。 0.2μmのシリンジフィルターでフィルタリングします。 -80℃で保存4℃で長期間20μlのアリコート、°2週間までのCのC。
6. ABの5 mg / mlにα-カゼインを溶解。 0.2μmのシリンジフィルターでフィルタリングします。 -80℃で保存4℃で長期間100μlアリコート中のC、°2週間までのC。
7. 200 mMの脱イオン水にジチオスレイトール（DTT）を溶かす。 100μlアリコートで-20℃で保存し、凍結融解の8時間内でご使用ください。再凍結することができます。
8. 4 mMでHPLCグレードのジメチルスルホキシド（DMSO）にパクリタキセル（PT）を溶かす。 -8010μlアリコートで保管℃の長期、-20℃の短期。解凍の8時間以内に使用してください。再凍結することができます。
9. 120 mg / mlの脱イオン水にグルコースを溶かす。 -20℃で100μlアリコートで保管再凍結することができます。
10. DIS150ミリメートル、pH7.0で脱イオン水にアデノシン三リン酸（ATP）を解く。 -805μlのアリコートで保管℃、融解の8時間内での使用。
11. 100xの600μlの全アッセイバッファーにカタラーゼ万単位のグルコースオキシダーゼと156000単位を溶解することにより株式²⁵脱酸素を準備します。ペレットを固体にマイクロ遠心機に軽く遠心する。0.2μmのシリンジフィルターとフィルター上澄み。 -80℃で保存4℃で長期間10μlアリコート、℃で1週間までのCのC。

2。微小管グライディングアッセイ、同日溶液の調製

実験の日に2.1から2.6でのソリューションを用意してください。練習すれば、解決策は、2.2から2.6フローセルの洗浄時に調製することができる。特に断りのない限り、氷の上に原液を保つ。

1. DTTの株式の10μl（2mMのDTTとAB）がAB、アッセイ緩​​衝液1mlを準備します。室温で保管してください。
2. バイオBSA緩衝液、40＆ムーを準備;ビオチン-BSAを株式とABとの1:1混合物リットル。室温で保管してください。
3. 5.5μlのBSA（ABの1 mg / mlのBSA）でABの645μlを混合して、BSA緩衝液を準備します。室温で保管してください。
4. 3μlのストレプトアビジンストック（ABの0.5 mg / mlのストレプトアビジン）とABの57μlを混合して、SAのバッファを準備します。室温で保管してください。
5. BSA緩衝液200μl、50μlのカゼイン株式、及び15μMのATP（1 mg / mlのα-カゼイン、0.8 mg / mlのBSA、50 nMのABのATP）の0.8μlを混合して、α-カゼインのバッファを準備します。室温で保管してください。
6. 95μlのα-カゼイン酸緩衝液、2.5μlのグルコースストック、1μlの100倍酸素消去ミックス、1μlのパクリタキセル株式、1μlの2 - メルカプトエタノール（βME）を混合し、蛍光抗漂白バッファを準備します。ヒュームフードの下βMEを追加します。準備の1時間以内に蛍光抗漂白バッファを使用注意 ：βMEは非常に有毒であり、臭いはひどい。唯一のヒュームフードの下に開くようにしてください。にボトルを保管して光の不在、光がβMEと退色を軽減する能力を低下させます。

3。微小管グライディングアッセイ

1. スペーサーとしてピペットチップを通してシリンジから押し出した真空グリースを使用して、24×60 mmのカバーガラスと22×22mmのカバーガラスの間に4つのフローレーン、約構築します。各フローレーンは、ボリューム内の約10μlの（スケール以降のボリュームに応じて）でなければなりません。
2. 各レーンにバイオ - BSA緩衝液10μlを洗います。コー​​トガラス表面にBSAを可能にするために5分間インキュベートします。
3. スライド表面をブロックし続けながら、フリーのビオチン-BSAを除去するために15μlのBSA緩衝液を各レーンに3回洗浄する。 気泡がフローチャンバーを通過できるようにしないように注意しながら 、フローチャンバーの反対側からバッファを削除するには、キムワイプまたはろ紙を使用しています。
4. 各レーンに15μlのSA-bufferを洗う。 10分、または最大2時間待ちます。ストレプトアビジンは、表面に結合したビオチン-BSAに結合するであろう。
5. スライド表面をブロックしつつ、自由なSAを削除するには、15μlのBSA緩衝液を各レーンに3回洗浄する。
6. 15μlのα-カゼイン緩衝液を用いて、各レーンを洗ってください。 α-カゼインはさらにキネシンと微小ガラスへの非特異的結合を阻止するのに役立ちます。
7. α-カゼインバッファ内の10nmにキネシンを希釈し、このキネシンの15μlで、各レーンを洗う - α - カゼイン溶液。表面に結合したストレプトアビジンと特異的に結合するビオチン化キネシン15分間（または時間まで）待ちます。キネシンモータードメインは、微小管を結合する自由のままになります。
8. 室温で40μMのα-カゼインバッファにパクリタキセルを希釈し、無料キネシンを洗い流すと脱重合から微小管を防ぐために、パクリタキセル溶液を用いて、各フローチャンバーを事前にロードするには、この溶液15μlを各レーンを洗う。風邪もそう部屋temperatuと室温でこれらの手順が発生していることを確認し、微小管を解重合ソリューションを再度。
9. 蛍光1mMのATPの蛍光抗漂白バッファに微小1:100-1:1,000というラベルが付いて希釈します。 1レーンに15μlを洗って30分以内に観察する。

4。データ収集

1. 蛍光顕微鏡を用いて微小管滑空を守って、そのような商業目的または家庭築くTIRFのセットアップのような単一の蛍光団を解決することができる顕微鏡は^26（ 図2）が必要です。
   微小管は温度に応じて、約0.5μm/ sの速度で基板上にキネシンモーターによって推進されるべきである。顕微鏡の視野が50μmである場合、個々の微小管は、約100秒間表示されるはずです。単一の蛍光団はより迅速に100秒よりも退色しないように照度を設定します。レーザー励起を使用している場合は、約3〜5 mWの電力設定は適切である。
2. 分析のために画像のシーケンスを収集します。 600の画像で5 Hzの（2分の合計）がうまく動作します。十分な長さの微小管が全体の視野を横断するのシーケンスを使用します。

5。データ解析

IDLのルーチン、 get_lp.proは 、装着されている。このルーチンは、与えられた画像シーケンス内のすべての微小管滑走に基づく持続長の値を返します。いずれかの特定の顕微鏡のセットアップに応じて強度パラメータを変更し、各イメージシーケンスで、このルーチンを実行するか、次の操作を行います。

1. 蛍光団の軌跡を作成するための微小管に接続された各蛍光体を追跡する。
2. 画像シーケンス内の各微小管（ 図3）を繰り返し、全体的な微小管軌道に与えられた微小管上のフルオロフォアの全軌跡を兼ね備えています。
3. 軌道に沿った各点の接線角度（ 図4）を計算します、と_θS> EQインチパスの長さS（ 図5）で区切られたポイントのペアごとに角度差の余弦を平均化することにより1。 _θs>の式にフィッティングCoSθsの独立した値の数でフィット感で、個々のデータポイント。

滑空アッセイからのスナップショットを図2に示します。良い微小管密度は視野当たり1から10まで微小であり、微小管が互いに交差するように実質的に多くのmistrackingになります。 図2の滑空アッセイからの11微小管軌道のプロットを図3に示します。典型的な軌道は10〜30μmで長さは、いくつかの軌跡が1微小管が別のものを交差ギャップを持っている。これらの軌跡は、分析から捨てられるかもしれません。

ひとつの長い微小管軌道は軌道に沿って二箇所例接線角度を図4Aに示されています。一定の距離で区切らタンジェントの角度の差は持続長に関連しており、微小管の軌道に沿った位置の関数として接線角度は、 図4Bに示されている。

接線角度データ多くの微小管の軌跡から与えられた実験ではすべての微小管に対して単一の持続長を計算するために結合されます。 図5は、図2の滑空アッセイ用対輪郭長 sのプロットを示す。大きな輪郭の長さの値では、cosθの非常に少数の値が測定され、それ故に平均が非常に可変です。重み付けされたフィット感は、より密接に長いの 、低精度のデータより短いの 、高精度のデータに準拠しています。

これらの11の軌道から持続長の値は、500±40μm以下（平均値の±標準誤差）は、比較的短い微小管²の永続長の代表である。同様の実験は300と1,000μmの間での永続長さの範囲を与える。

トラブルシューティング

微小管はインクリメント、完全に不在である場合ステップにおける微小管のASE濃度3.9から0.5 mg / mlである。微小管がまだ不足している場合は、再重合微小管。パクリタキセルは、微小管が解重合するでしょうそうでなければ、各ソリューション微小管に希釈さで存在していることを確認してください。

微小管は表面への結合自由溶液中で拡散するが、いない場合は、ステップ3.7におけるキネシン濃度を増加させ、キネシンが不可逆的に結合し、微小管を確実にするために、ATPの代わりに、AMP-PNPを使用しています。微小管がまだバインドされない場合は、新しいビオチン-BSA緩衝液、続いてストレプトアビジン新しいストックとバッファを作成します。最後に、新しいビオチン化キネシンを清める。

微小管が結合するが、移動しない場合は、新鮮なATPとATPの原液を交換してください。

フルオロフォアが速すぎる退色した場合、照度を下げる。フルオロフォアはまだ早すぎる退色した場合、新鮮な在庫と脱酸素システムを置き換える。

もしfluorophoresがあまりにも薄暗いですが、照度を上げる。

図1微小管滑走アッセイの漫画。キネシンの酵素が特異的にビオチン - ストレプトアビジン結合によってカバースリップにバインドされます。微小管はまばらに有機蛍光団で標識されています。 ATPを添加すると、微小管はキネシンモーターによってプッシュされます。微小管の主要な自由端は、溶液中の熱の力により変動するが、これらの変動は微小管の持続長を計算するために使用されています。これらの実験によって調べ微小管の長さスケールは、自由端の長さです。

図2 TIRF顕微鏡を介して取ら滑空アッセイの典型的な顕微鏡のスナップショット、。 Microtu bulesはまばら単一フルオロフォアが飾られています。スケールバーは5μmである。

画像シーケンスから図3微小管の軌跡は、 図2に示す。各微小管の軌跡は、多くの単一フルオロフォアの軌跡（平均約10）を組み合わせ、及び100nmにつき1点まで薄くされています。

図4軌道の接線の角度を計算する。示されている例タンジェントの角度（θ）を持つ1微小管の（A）の軌跡。微小管の軌道に沿った位置の関数として、（B）の接線角度。これらのデータは、式で使用される平均的な角度を計算するために使用されます。 1。

持続長の測定は、個々の生体高分子の機械的特性の優れた特性があります。この記事では、我々は、微小管の持続長を測定する方法を説明してきました。ように、ステップ1.1、3.9、、この方法は容易に単に滑空アッセイの最終工程で試薬、温度、粘度を変えることにより様々な条件で微小管の機械的性質を調べることに拡張される導入部で述べたように、または重合微小管によって、さまざまな条件の下で。

技術自体は実行するのが手っ取り早いです。原液を前もって（ステップ1）の準備が完了したら、滑空アッセイ実験は、単一の顕微鏡スライド上の条件で4つのバリエーション（ステップ3.1における4車線）まで含めて、2〜3時間で行うことができます。多くの微小管は各実験で調べることができ、我々の研究室での典型的な実験では、条件ごとに100微小管（約10画像シーケンシングを調べるシーケンスごとに10微小管）とレーンあたりES、。大規模なデータセットの分析も同様に、かなり速いです。練習すれば、10イメージシーケンスは現代のPCと午後かそこらで持続長について分析することができる。分析の律速段階は、個々の蛍光団を追跡するための時間ですが、より新しい追跡方法は、実質的に²⁷この速度を向上させることを約束します。

メソッドは指定された微小管に接続された単一の蛍光団を追跡伴うため、トラッキングの精度が唯一の光子コレクションによって制限されており、ナノメートル^22、25の規模になることができます。多くのフルオロフォアからのデータを含めることにより、精度がさらに向上する。潜在的に、より高い精度が微小管に、このような量子ドットのような非常に明るい蛍光物体を取り付けることによって達することができる。

個々の軌道の精度は、永続ルの不確実性はかなり良いですがこのテクニック（単一微小管のための±50％の範囲）で測定ngthsは依然として重要である。持続長測定の精度の重要な制限は_、cosθSを平均に関わる統計である。 Lは微小管の軌跡の長さL / S が 、勉強としての点、S、増加のペアの間の輪郭長として_、θsの独立した測定値の数が減少します。微小管の軌跡の長さを増やすと持続長測定における精度向上を可能にするであろう。

このメソッドの2番目の制限は、ビオチン化されたキネシン1は顕微鏡のスライドへのキネシンの特定の接続用に使用されるという要件があります。ビオチン化されたキネシンは、（我々の場合は大腸菌から）を精製しなければならず、単に棚から購入することはできません。非ビオチン化親族を使用しかし、修正滑空アッセイesinは^28を用いてもよいが、この手法に適しているかもしれませんキネシン重鎖タンパク質は、細胞骨格（KR01）から市販されている。この代替キネシンを使用するように滑空アッセイを変更すると、どのような方法で微小曲げ剛性に影響しないでしょう、したがって、組換えキネシンタンパク質へのアクセスがないグループは、このメソッドを使用することが可能となります。

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

私たちは、プロトコルを実証するために、図1とアンナRatliffを準備支援のためメリッサ作者：klockeに感謝します。この作品は、科学振興のための研究·コーポレーションがサポートされていました。