Method Article
ووصف طريقة لقياس طول جمود العاطفة أو استمرار من البوليمرات الحيوية. أسلوب يستخدم كينيسين يحركها مقايسة مزلق أنيبيب تجريبيا لتحديد طول استمرار ميكروتثبول الفردية وقابلة للتكيف مع المقايسات مزلق الأكتين مقرا لها.
ميكروتثبول هي البوليمرات هيكل الخلية التي تلعب دورا في انقسام الخلايا، والميكانيكا الخلية، والنقل داخل الخلايا. كل من هذه المهام يتطلب ميكروتثبول التي هي قاسية بما فيه الكفاية وتمتد مباشرة إلى جزء كبير من الإطارات الخلية. ونتيجة لذلك، تم طول استمرار أنيبيب، وهو مقياس لصلابة، ودرس بنشاط على مدى العقدين الماضيين 1. ومع ذلك، تبقى الأسئلة مفتوحة: ميكروتثبول قصيرة هي 10-50 مرات أقل من ميكروتثبول طويلة قاسية 2-4، وميكروتثبول حتى قياس أطوال طويلة والتي تختلف استمرار بأمر من حجم 5-9.
هنا، نقدم طريقة لقياس طول أنيبيب المثابرة. وتستند هذه الطريقة على فحص أنيبيب مزلق كينيسين يحركها 10. من خلال الجمع بين العلامات الفلورية متفرق من ميكروتثبول الفردية مع تتبع جسيم واحد من fluorophores الفردية التي تعلق على أنيبيب، وglidinيتم تعقب مسارات غرام من ميكروتثبول نانومتر واحد مع المستوى من الدقة. طول مسارات استمرار هو نفس طول استمرار أنيبيب وفقا للشروط استخدامها 11. يستخدم روتين تتبع الآلي لخلق مسارات أنيبيب من fluorophores تعلق على ميكروتثبول الفردية، ويتم حساب طول استمرار هذا المسار باستخدام إجراءات مكتوبة في IDL.
هذه التقنية قابلة للتطبيق بسرعة، وقادرة على قياس طول استمرار ميكروتثبول من 100 في يوم واحد من التجريب. ويمكن تمديد طريقة لقياس طول ظل استمرار مجموعة متنوعة من الظروف، بما في ذلك استمرار طول بوصفها وظيفة من طول الأنابيب الدقيقة جنبا إلى جنب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تمتد إجراءات التحليل المستخدمة لالميوسين القائم على المقايسات مزلق التمثيل، لقياس طول خيوط الأكتين استمرار كذلك.
الهيكل الخلوي، وهي شبكة من البوليمرات الحيوية موجودة في الخلايا حقيقية النواة الأكثر، يلعب دورا في تنظيم الخلوية، والنقل داخل الخلايا، والميكانيكا الخلية. الخصائص الميكانيكية للالبوليمرات الحيوية من الهيكل الخلوي (أكتين في المقام الأول وميكروتثبول) تلعب دورا هاما في تحديد الخواص الميكانيكية للخلية كما في 12 كله. منذ ميكانيكا خلية كاملة يمكن أن تميز الخلايا السليمة والمريضة 13،14 وتشارك في الحركة الخلوية 15، وكانت الخواص الميكانيكية للهيكل الخلية الأساسية في مكونات منطقة نشطة للدراسة على مدى العقدين الماضيين 1.
وتتميز بالمرونة (أو تصلب) من البوليمرات الحيوية من طول استمرار، وطول البوليمر الذي ينحني من راديان واحد تقريبا تحت تقلبات الحرارية عند درجة حرارة الغرفة. وقد تم تطوير عدد من التقنيات لقياس طول استمرار 16، لأمثلتقنيات جنيه بالموقع التي تنطوي على الانحناء البوليمر باستخدام تدفق الهيدروديناميكية، والفخاخ البصرية، أو المجالات الكهربائية 4،17،18، وتقنيات قياس السلبي الذي تقلبات البوليمرات الحرة في حل 5،6. القياسات بالموقع، ومع ذلك، تتطلب الاجهزة المتخصصة لتنفيذ القوات المعروفة على مقياس الميكرومتر، وقياسات الحرة تقلب يمكن أن يكون تحديا بسبب نشرها من الطائرة من تركيز المجهر المستخدمة.
في هذه المقالة، ونحن تصف، السلبي التكميلية، تقنية لقياس طول استمرار ميكروتثبول، بوليمر هيكل الخلية. والأسلوب الذي ينطوي المقايسات مزلق، والتي تضمن أن يبقى دائما البوليمر في المستوى البؤري 19. وعلاوة على ذلك، فإنه ينطوي fluorophores واحدة تتبع تثبت بصورة دائمة على البوليمر في المصالح، بحيث تتميز كذلك مواقع محددة على طول البوليمر.
ويرد كارتون الأسلوب في الارقام ..ه 1. كينيسين يتحرك على وجه التحديد في أواخر + من الأنابيب الدقيقة، بحيث يتم دفع ميكروتثبول مزلق في مقايسة unidirectionally. نهاية الرائدة في مجال أنيبيب، وراء كينيسين مشاركة المرفقة، حر في أن تتقلب تحت قوات الحرارية من الحل المحيطة بها. كما دفعت أنيبيب إلى الأمام، حتى نهاية يتقلب الربط إلى جزيء جديد كينيسين على امتداد شريحة زجاجية يتجمد في تذبذب معين. لأن تعلق كينيسين ميكروتثبول بقوة، يتم تقييد أنيبيب لمتابعة مسار نهاية الرائدة. ولذلك، فإن التقلبات الإحصائية المجمدة في مسار أنيبيب هي نفس التقلبات الإحصائي للنهاية خالية من الأنابيب الدقيقة 11، وبالتالي يمكن استخدامها لحساب طول استمرار فقا إلى 20
حيث L هو طول ع استمرار أنيبيب، θ s هو الزاوية بين الظلال لمسار مفصولة كفاف ق الطول، و<> يدل على متوسط على كل زوج من المواقف مفصولة كفاف ق الطول.
الفحص مزلق نفسه يستخدم المعقدة البيروكسيديز كينيسين في ال 21 ملفوف لفائف ملزمة على وجه التحديد إلى شريحة زجاجية عن طريق الربط streptavidin-البيوتين. هذا المرفق يضمن أن محرك المجالات أحرار في ربط ودفع ميكروتثبول. من أجل تتبع مسارات أنيبيب، وصفت قليلة ميكروتثبول مع fluorophores العضوية 22،23 - التسميات يجب أن تكون كافية متفرق التي لحل fluorophores واحدة باستخدام جزيء واحد المجهري مضان. يتم تعقب fluorophores واحدة باستخدام إجراءات تحليل الصور مكتوب في IDL. مسارات من كل fluorophore منضم إلى هيئة التصنيع العسكري نظرايتم الجمع بين rotubule في مسار مركب 24 أنيبيب تلقائيا. يتم حساب زوايا الظل θ إلى كل نقطة على طول المسار، ومن هذه الزوايا الظل ويتم احتساب سبت> قيمة كل كفاف ق الطول. وأخيرا، وتناسب هذه البيانات إلى المعادلة. (1) بغية انتزاع طول استمرار لأنيبيب معين، أو لميكروتثبول كثيرة في نفس الفحص مزلق.
طريقة قوية بما فيه الكفاية للعمل مع ميكروتثبول أعدت في مجموعة متنوعة واسعة من الظروف (مع مختلف وكلاء استقرار أو الجزيئات الصغيرة الأخرى منضمة إلى أنيبيب، مع البروتينات أنيبيب ملزمة المرتبطة (خرائط)، أو مع مجموعة متنوعة من الحلول لزجة). في المختبر، وقد استخدمت هذه التقنية لوصف طول استمرار ميكروتثبول بوصفها وظيفة من طول على طول الأنابيب الدقيقة والأنابيب الدقيقة مع مختلف وكلاء الاستقرار. تقييد الرئيسي هو أن ميكروتثبول يجب أن لا يزال لياليupport كينيسين الحركة. منذ كينيسين هو انزيم محرك قوي، وهذا هو تقييد فضفاضة إلى حد ما. من خلال استبدال الأنابيب الدقيقة مع الأكتين وكينيسين مع انزيم الأسرة الميوسين، يمكن قياس طول استمرار الأكتين باستخدام نفس التقنية.
1. أنيبيب الانزلاق الفحص حلول للسهم
إعداد مقايسة قبل مزلق.
2. أنيبيب الانزلاق الفحص، ونفس إعداد الحل اليوم
إعداد الحلول في 2،1-2،6 في يوم التجربة. مع الممارسة، يمكن إعداد حلول 2،2-2،6 خلال تدفق خلايا الغسيل. ما لم يذكر خلاف ذلك، والحفاظ على حلول الأسهم على الجليد.
3. أنيبيب الانزلاق الفحص
4. جمع البيانات
5. تحليل البيانات
روتين IDL، get_lp.pro يتم إرفاق. هذا الروتين بإرجاع قيمة طول استمرار بناء على كل مزلق ميكروتثبول في تسلسل الصور معين. إما تشغيل هذا الروتين في كل تسلسل الصور، وتعديل المعلمات اعتمادا على شدة الإعداد المجهر معينة، أو القيام بما يلي:
ويرد لقطة من الفحص مزلق في الشكل 2. A الكثافة أنيبيب الجيد هو ميكروتثبول 1-10 في مجال الرؤية؛ حد كبير سوف يؤدي إلى مزيد من mistracking كما ميكروتثبول عبر بعضها البعض. ويرد مؤامرة من مسارات أنيبيب 11 من مقايسة مزلق في الشكل 2 في الشكل 3. مسارات نموذجية من 10 إلى 30 ميكرون طويلة، وبعض المسارات لديها ثغرات واحد حيث يعبر أنيبيب آخر. قد يتم تجاهل هذه المسارات من التحليل.
ويرد واحد، مسار طويل أنيبيب في الشكل 4A مع زوايا الظل سبيل المثال في موقعين على طول مسار. ويرتبط الفرق بين زوايا الظل مفصولة مسافة ثابتة لطول الثبات؛ يظهر زاوية الظل بوصفها وظيفة للموقف على طول مسار أنيبيب في الشكل 4B.
البيانات زاوية الظلمن أنيبيب مسارات عديدة يتم الجمع بين لحساب طول استمرار واحد لجميع ميكروتثبول في تجربة معينة. ويبين الشكل 5 قطعة θ ق ق مقابل> طول كفاف لفحص مزلق من الشكل 2. ككل القيم طول كفاف، يتم قياس القيم قليل جدا من كوس θ، وبالتالي متوسط متغير بدرجة كبيرة. تناسب المرجح يتفق مع ليالي قصيرة، عالية الدقة البيانات على نحو أوثق من ليالي طويلة، وانخفاض الدقة البيانات.
قيمة طول هذه المسارات من استمرار 11، 500 ± 40 ميكرون (± الخطأ المعياري للمتوسط)، هو ممثل أطوال الأنابيب الدقيقة لاستمرار قصيرة نسبيا 2. تجارب مماثلة إعطاء مجموعة من أطوال استمرار ما بين 300 و 1،000 ميكرومتر.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها
إذا ميكروتثبول غائبة تماما، increبورصة عمان تركيز ميكروتثبول في الخطوة 3،9 حتي 0،5 ملغ / مل. إذا ميكروتثبول ما زالوا مفقودين، وإعادة تبلمر ميكروتثبول. جعل متأكد من باكليتاكسيل موجود في كل حل يتم تخفيفه إلى ميكروتثبول، وإلا سوف يزيل البلمرة ميكروتثبول.
إذا ميكروتثبول هي نشرها بحرية في حل ولكن ليست ملزمة على السطح، زيادة تركيز كينيسين في الخطوة 3.7 و استخدام AMP-PNP بدلا من ATP لضمان كينيسين يربط ميكروتثبول لا رجعة فيه. إذا ميكروتثبول لا تزال لا تلزم، وجعل جديدة streptavidin الأسهم والعازلة، تليها العازلة البيوتين-BSA الجديد. وأخيرا، تنقية كينيسين المعقدة البيروكسيديز جديدة.
إذا ميكروتثبول ربط ولكن لا تتحرك، ATP استبدال محلول المخزون مع ATP جديدة.
إذا fluorophores photobleach بسرعة كبيرة جدا، والحد من شدة الإضاءة. إذا fluorophores photobleach يزال بسرعة كبيرة جدا، يحل محل نظام الأكسجين الكسح مع الأسهم الجديدة.
إذا fluorophoالدقة هي قاتمة جدا، وزيادة كثافة الإضاءة.
الشكل 1. كارتون للمقايسة مزلق أنيبيب. لا بد على وجه التحديد الانزيمات كينيسين إلى ساترة من الربط البيوتين streptavidin-. وصفت قليلة ميكروتثبول مع fluorophores العضوية. إضافة إلى ATP، يتم دفع الأنابيب الدقيقة من قبل محركات كينيسين. نهاية الرائدة خالية من أنيبيب يتقلب بسبب القوات الحرارية في حل، وتستخدم هذه التقلبات لحساب طول استمرار أنيبيب. طول النطاق من أنيبيب تناقش هذه التجارب هو طول الطرف الحر.
الشكل 2. نموذجي لقطة المجهر لفحص مزلق، اتخذت عبر المجهر TIRF. Microtu زينت قليلة bules مع fluorophores واحد. شريط المقياس 5 ميكرون.
مسارات الرقم أنيبيب 3. من تسلسل الصور هو مبين في الشكل 2. كل مسار يجمع بين العديد من المسارات أنيبيب fluorophore واحد (حوالي 10 في المتوسط)، وقد ضعفت إلى نقطة واحدة لكل 100 نانومتر.
الشكل 4. حساب زوايا الظل الى مسار. (A) مسار واحد أنيبيب، مع زوايا الظل سبيل المثال (θ) مبين. (B) زاوية الظل بوصفها وظيفة للموقف على طول مسار أنيبيب. وتستخدم هذه البيانات لحساب متوسط الزوايا المستخدمة في المعادلة. 1.
قياسات طول استمرار هي توصيف جيد من الخواص الميكانيكية للالبوليمرات الحيوية الفردية. في هذه المقالة، ووصف لنا طريقة لقياس طول استمرار ميكروتثبول. كما لوحظ في المقدمة، ويمتد هذا الأسلوب بسهولة إلى دراسة الخصائص الميكانيكية أنيبيب في مجموعة متنوعة من الظروف ببساطة من خلال تغيير الكواشف، ودرجة الحرارة، أو اللزوجة في الخطوة الأخيرة من الفحص مزلق، 3.9، أو عن طريق بلمرة ميكروتثبول، خطوة 1.1، في ظل ظروف مختلفة.
هذه التقنية نفسها سريعة لتنفيذ. مرة واحدة تم إعداد حلول الأسهم في وقت مبكر (الخطوة 1)، يمكن إجراء فحص تجربة التزلج على الماء في 2-3 ساعة، بما في ذلك ما يصل إلى أربعة اختلافات في الظروف على شريحة المجهر واحدة (أربعة في الممرات الخطوة 3.1). يمكن فحص العديد من الأنابيب الدقيقة في كل تجربة، تجارب نموذجية في المختبر فحص 100 حالة في ميكروتثبول (حوالي sequenc صورة رقم 10وفاق في لين، مع 10 في تسلسل ميكروتثبول). تحليل مجموعات البيانات الكبيرة هو بالمثل سريعة إلى حد ما. مع الممارسة، يمكن تحليل تسلسلات الصور (10) لطول استمرار في فترة بعد الظهر أو نحو ذلك مع PC الحديثة. معدل منظم للخطوة في التحليل هو الوقت المناسب لتتبع fluorophores الفردية، وطرق تتبع أحدث نعد لزيادة هذه السرعة بشكل كبير 27.
لأن الأسلوب ينطوي على تتبع fluorophores واحدة تعلق على أنيبيب معينة، ويقتصر فقط على دقة تتبع من قبل مجموعة فوتون، ويمكن أن تكون على نطاق نانومتر 22 و 25. بما في ذلك البيانات بواسطة من fluorophores كثيرة، زيادة تحسين الدقة. ومن المحتمل أن يتم التوصل إلى الدقة أعلى من ذلك عن طريق ربط الأجسام الفلورسنت مشرق للغاية، مثل نقاط الكم، إلى أنيبيب.
في حين أن المسارات الفردية دقة جيدة جدا، فإن عدم اليقين في استمرار جنيهngths قياس مع هذه التقنية (على مقياس من 50٪ ± لأنيبيب واحد) لا يزال كبيرا. مفتاح القيد في دقة القياسات طول هو استمرار إحصاءات المشاركة في المتوسط كوس θ ق. وطول كفاف بين أزواج من النقاط، s، الزيادات، وعدد من القياسات مستقلة عن θ ق يتناقص مع L / ثانية، حيث L هو طول مسار أنيبيب دراستها. وزيادة طول مسارات أنيبيب تسمح تحسين الدقة في القياسات طول المثابرة.
والقيد الثاني لهذه الطريقة هو شرط المعقدة البيروكسيديز كينيسين-1 يمكن استخدامها لمرفق معين من كينيسين على الشرائح المجهر. يجب تنقية كينيسين المعقدة البيروكسيديز (من كولاي في حالتنا)، ولا يمكن ببساطة يمكن شراؤها من على الرف. ومع ذلك، فإن فحص الأقارب مزلق تعديلها باستخدام unbiotinylatedويمكن استخدام esin 28؛ كينيسين البروتين السلسلة الثقيلة التي قد تكون مناسبة لهذه التقنية متوفرة تجاريا من الهيكل الخلوي (KR01). ومقايسة تعديل مزلق لاستخدام هذا البديل لا يؤثر كينيسين جمود العاطفة أنيبيب بأي شكل من الأشكال، وبالتالي سيمكن الجماعات دون الحصول على البروتين المؤتلف كينيسين لاستخدام هذا الأسلوب.
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.
نشكر ميليسا Klocke للحصول على المساعدة وإعداد الشكل 1 راتليف آنا لبيان البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل هيئة البحوث للتقدم العلوم.
الكواشف معدات استبدال MATLAB، يماغيج، أو غيرها من البرامج تحليل الصور.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
إيميدازول | سيغما الدريخ | I2399 | |
كلوريد البوتاسيوم | سيغما الدريخ | P9541 | |
المغنيسيوم الكلوريد | سيغما الدريخ | M8266 | |
EGTA | سيغما الدريخ | E3889 | |
BSA | Calbiochem | 126615 | |
المعقدة البيروكسيديز BSA | الحرارية العلمية | 29130 | |
α-الكازين | سيغما الدريخ | C6780 | |
streptavidin | الحرارية العلمية | 21125 | |
dithiothreitol | سيغما الدريخ | D0632 | |
باكليتاكسيل | LC المختبرات | P-9600 | |
الجلوكوز أوكسيديز | سيغما الدريخ | G2133 | |
الكاتلاز | سيغما الدريخ | C100 | |
الجلوكوز | سيغما الدريخ | G8270 | |
ATP | سيغما الدريخ | A2383 | |
2-المركابتويثانول | سيغما الدريخ | M3148 | السامة. شراء كمية صغيرة. |
24X60 مم رقم 1 1/2 كوب غطاء | VWR | 48393-252 | |
22X22 مم رقم 1 كوب غطاء | الذهب خاتم | 3306 | |
الشحوم عالية الفراغ | داو كورنينج- | NA | |
TIRF المجهر | NA | وكان المجهر TIRF المستخدمة في هذه الطريقة محلية الصنع. | |
IDL (البرمجيات) | Exelis | NA |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved