Visualização e análise do fluxo sangüíneo e consumo de oxigênio na microcirculação hepática: aplicação para um modelo Hepatite Aguda

Um sistema óptico foi desenvolvido para visualizar a microcirculação hepática com eritrócitos marcados com FITC e para medir a pressão parcial de oxigénio no microvasos com laser assistida phosphorimetry. Este método pode ser usado para investigar os mecanismos fisiológicos e patológicos, analisando a estrutura microvascular, o diâmetro, a velocidade de fluxo de sangue, e tensão de oxigénio.

Há uma grande discrepância entre a oferta ea demanda de oxigênio no fígado, porque o consumo de oxigênio hepático é relativamente elevada, mas cerca de 70% do suprimento sanguíneo hepático é pouco sangue oxigenado da veia porta derivado do trato gastrointestinal e do baço. O oxigénio é entregue a hepatócitos de sangue que flui a partir de um ramo terminal da veia porta a uma vênula central através sinusóides, e isto faz um gradiente de oxigénio em lóbulos hepáticos. O gradiente de oxigénio é um parâmetro importante física que envolve a expressão de enzimas a montante ea jusante, na microcirculação hepática, mas a falta de técnicas de medição de consumo de oxigénio na microcirculação hepática atrasou a elucidação dos mecanismos relacionados com o metabolismo de oxigénio no fígado. Por conseguinte, utilizado marcado com FITC eritrócitos para visualizar a microcirculação hepática e utilizado laser assistida phosphorimetry para medir a pressão parcial de oxigénio no microvasos aí. Noncontact e medição óptico contínuo pode quantificar velocidades de fluxo de sangue, diâmetros dos vasos e gradientes de oxigênio relacionadas com o consumo de oxigênio no fígado. Em um modelo de hepatite aguda que fizemos através da administração de paracetamol para ratos, observamos pressão de oxigênio aumentou em ambos os vênulas portal e central, mas um gradiente de diminuição de oxigênio nos sinusóides, indicando que a necrose dos hepatócitos na zona pericentral poderia mudar a pressão de oxigênio e afetar a expressão da enzima na zona periportal. Em conclusão, os nossos métodos ópticos para hemodinâmica hepáticas de medição e consumo de oxigênio pode revelar mecanismos relacionados à doença hepática.

1. Marcando eritrócitos com isotiocianato de fluoresceína Isómero I (FITC)

Todos os protocolos experimentais nós utilizados foram aprovados pelo comitê de ética da Keio University School of Medicine.

1. Anestesiar uma ratinhos dadores, e depois de fazer uma incisão celiotomia retirar sangue total a partir da veia cava inferior com uma seringa de 1 ml contendo pequena quantidade de heparina. O rato foi imediatamente sacrificados por injecção de pentobarbital sódico (100 mg / kg ip).
2. Lava-se a sangue total duas vezes com PBS (pH 7,4) por centrifugação durante 5 min a 400 g num rotor de balanço-balde.
3. Dissolve-se 10 mg de FITC em 5 ml de 100 mM de Na ₂ HPO ₄ e filtrá-lo com uma membrana com 0,22-iM poros.
4. Num tubo de ensaio misturar 1 ml da solução de FITC com 0,15 ml de 3 mM de glucose, 0,25 ml de 180 mM NaH ₂ ml PO _4, e 1,5 de 100 mM de Na ₂ HPO _4. Adicionar 0,2 ml de RBC pellet, e toque o tubo para misturar.
5. Manter o tubo durante 2 horas a 4 ° C e, em seguida lavar os RBCs duas vezes em PBS coradas.
6. Coloque uma pequena quantidade da suspensão de RBC em uma grama corrediça e ver se as RBCs aparência saudável (isto é, que a sua forma e tamanho são normal) e que a intensidade de fluorescência é suficiente.
7. Suspender o 0,1 ml de glóbulos vermelhos em 0,9 ml de PBS a pH 7,4, e manter a suspensão a 4 ° C até injecção.

2. Preparação de oxigênio-sensível Dye

1. Dissolve-se 500 mg de BSA em 10 ml de PBS a pH 7,4.
2. Adicionar 30 mg de Pd (II)-meso-tetra (4-carboxifenil) porphine (Pd-TCPP) à solução de BSA e agitou-se durante a noite.
3. (Opcional) Extrair BSA-bound Pd-TCPP usando cromatografia de fluxo por gravidade ou uma coluna de spin para o separar livre Pd-TCPP.
4. Centrifugar a solução para remover não dissolvido Pd-TCPP, e filtrar o sobrenadante com um filtro de membrana com 0,22-iM poros.
5. Loja de 1 ml em tubos de alíquotas a -20 ° C. Evite a repetição de ciclos de congelamento e descongelamento.

3. Preparação dos animais

1. Para a observação microscópica da microcirculação preparar uma placa de plástico com um furo 20 milímetros de diâmetro, e uma fita de 30 mm de quadrado de vidro de cobertura sobre o furo quadrado.
2. Anestesiar um mouse, retire a pele e preparar a pele. Coloque um cateter na cauda vão para injecção de drogas usando uma agulha 30 G ligada a um polietileno de 10-cm (PE 10) do cateter preenchido com heparinizado PBS.
3. Após a incisão mediana, estender um lóbulo principal do fígado na chapa de plástico, e coloque o mouse em decúbito esternal.
4. Preparar pequenas tiras com o envoltório de cozinha (3 mm x 8 mm) e azulejo-los em torno da borda do lobo hepático para inibir a mover-se do fígado com a respiração e mantendo-o a partir de secagem.
5. Observe a microcirculação hepática sob um microscópio (com luz transmitida), e confirmar que o bfluxo Lood não tem nenhuma estase no campo de visão, pelo menos, 15 min.
6. Lentamente injetar 0,2 ml de hemácias fluorescente etiquetado para a observação do fluxo de sangue ou 0,2 ml de Pd-TCPP solução para medição de pO _2. Esta quantidade de glóbulos vermelhos marcados com FITC serão responsáveis ​​por 1/50 de todos os RBCs em circulação na região visualizada.

4. Visualização do Fluxo de Sangue

1. Excitar o FITC por irradiação com luz da lâmpada de mercúrio que passou através de um filtro passa-banda (450-490 nm) ^1.
2. Gravar a imagem fluorescente com uma câmara CCD.

5. pO Medição ₂

Pd-TCPP fosforescência é relativamente fraca e deve ser detectado com um detector de alta sensibilidade. Todas as experiências precisam de ser realizado numa sala escura.

1. Os picos de absorção de Pd-TCPP são a 410 nm e 532 nm, de modo que o segundo-harmónica comprimento de onda de 532 nm é recomendado para a excitação. Este comprimento de onda pode ser gerado por um Nd: YAG pulso de laser ^2.
2. Alimentar o feixe do laser Nd: YAG na porta apropriada no microscópio invertido, e ajustar o ponto de feixe para uma posição central no plano focal. A resolução espacial depende do tamanho do ponto de laser, que é alterado pela passagem do feixe através de um furo de pino.
3. Para detectar a fosforescência, anexar um filtro de longo-pass (> 620 nm) e um tubo fotomultiplicador (PMT) para a outra porta do microscópio. O PMT deve ser sensível aos comprimentos de onda vermelhos, especialmente em torno de 700 nm.
4. Amostrar o sinal de fosforescência (500 pontos amostrados a 200 kHz) e calcular a constante de tempo de decaimento, encaixando uma função exponencial para a decomposição.
5. Para a calibração preparar dois conjuntos de amostras de Pd-TCPP solução com pO ₂ 150 mmHg e 0 mmHg. Adicionar ditionito de sódio 1% em volume de amostra para produzir ausência de oxigénio. Manter o pH das amostras a 7,4 ea temperaturatura a 37 ° C durante a calibragem.
6. Fixar o Stern-Volmer tempo de decaimento constante k _q e livre de oxigénio luminescência τ ₀ na equação (1) ^3. No nosso caso, com Pd-TCPP soluções a 37 ° C e um pH de 7,4, k _q é 374 mmHg ^-1 s ^-1 e ₀ é τ 0,74 ms. Estes parâmetros de medição dependem do equipamento (isto é, a laser, detector, outros dispositivos ópticos) e do método de processamento de sinal, de modo a calibração é necessário em cada sistema de medição ^4.
   τ ₀ / τ = ​​1 + k _q • τ ₀ • pO ₂ (1)
7. Definir o rato sobre a placa sobre a platina do microscópio, observar a microcirculação hepática, e ajustar a posição do alvo de microvasos até ao ponto de o ponto de laser.

6. Modelo de Hepatite

1. Camundongos rápidos com livre acesso à água durante a noite.
2. Prepara-se uma20 mg por ml de solução de acetaminofeno (APAP) em DMSO.
3. Injectá-la por via intraperitoneal em 1 ml/100 g de peso corporal (ie, 200 mg / kg de peso corporal). Após a injecção, o rato pode ser dado livre acesso a comida e água ^5.
4. 24 horas após a injecção, anestesiar o rato e expor o fígado através de uma incisão mediana. Se a hepatite é conseguido, necrose na região pericentral será facilmente visível a olho nu.

7. Os resultados representativos

Exemplo, imagens de microcirculação hepática são mostrados na Figura 1, onde (a) é uma imagem de luz de transmissão e (b) é uma imagem de fluorescência. Individuais eritrócitos marcado com FITC são observados no filme de vídeo, e vénulas de portal, sinusóides, e vénulas centrais são reconhecidos por direcções de fluxo de sangue.

Como mostrado na Figura 2, o ponto de laser irradiação de um vénula central, através de uma lente objectiva x100 foi aproximdiatamente 10 um de diâmetro. Intravascular pO ₂ na microcirculação hepática foi medida em ratinhos C57BL macho / 6 ratinhos, e Figura 3 (a) mostra as relações entre pO ₂ e diâmetro do vaso em vénulas de portal e central. A pO ₂ gradiente de portal para vênulas centrais indica que liberam oxigênio hemácias de forma eficiente ao passar sinusóides. Como mostrado na Figura 3 (b), a média pO ₂ foi de 59,8 mmHg em vasos de portal, 48,2 mmHg em sinusóides, e 38,9 mmHg em vénulas centrais.

Quando produzido hepatite aguda, injetando APAP via intraperitoneal, intravascular pO ₂ foi significativamente elevado em cada parte da microcirculação hepática: p <0,05 na veia porta, e p <0,01 em sinusóides e veias centrais (Figura 3 (c)).

Figura 1. Baixa ampliação-images mostrando microcirculação hepática com (a) a luz transmitida e (b) de fluorescência.

Figura 2. Imagem do ponto de laser irradiando uma vênula alvo central para medição pO _2.

Figura 3. PO ₂ gradiente na microcirculação hepática de camundongos sadios e de camundongos com acetaminofeno-induzida lesão hepática. (A) mostra pO ₂ versus diâmetro do vaso para o portal vénulas (PV) e vénulas central (CV), e (b) mostra o gradiente de oxigénio a partir de PV para CV através sinusóides (S). A pO ₂ diferença entre PV e CV reflete o consumo de oxigênio de hepatócitos ou outras células do parênquima. (C) mostra que, em condições de hepatite induzida por APAP administração, pO ₂ foi significativamente elevados em PV, S, e CV e pO ₂gradiente diminuiu, indicando que o consumo de oxigênio hepático foi comprometida.

Fornecimento de oxigênio aos tecidos é um papel essencial da microcirculação, e um monte de papéis descrever doenças relacionadas à anatomia microvascular e reologia ^6. O fluxo de sangue hepático é uma combinação de sangue arterial e venoso. Cerca de 30% do fluxo sanguíneo para o fígado é bem oxigenado sangue fornecido pela artéria hepática e os outros 70%, fornecido pela veia portal, é o fluxo venoso mal o sangue oxigenado a partir do baço e do tracto gastrointestinal ^7. Doenças do fígado, como esteatose hepática, choque ou mudança tumor do fluxo sanguíneo na microcirculação hepática. Para determinar a oxigenação dos tecidos, é necessário medir tanto o fluxo de sangue e concentração de oxigénio na microcirculação. A falta de instrumentos disponíveis no mercado para fazer essas medições na microcirculação hepática tornou difícil a obtenção de dados fisiológicos neste domínio.

Um ponto importante em etapas de preparação de animais é a fixação deo fígado sobre uma placa de plástico. Resultados de fixação soltos em movimento sincronizado de fígado com a respiração, o que interfere com a observação microscópica e torna a análise difícil. Fixação apertado, no entanto, provoca estase do fluxo sanguíneo. Condições de fluxo de sangue deve ser observado que um microscópio de baixo consumo de energia durante o ato operatório. Lasers de alta potência facilmente ferir microvasos, de modo a frequência da irradiação deve ser minimizada. 1 Hz é geralmente suficiente para a medição temporal, ^8. No entanto, uma única medida de pO ₂ demora menos de 1 ms, o que significa que a frequência de repetição pode ser aumentada para 1 kHz para rápida pO ₂ mudança, conforme necessário. Além disso, a reacção fotoquímica de Pd-TCPP gera oxigénio singuleto que os danos microvasos e induz a agregação plaquetária ^9. A combinação de fluorescência de imagem e medição de pO ₂ pode medir a dinâmica do fluxo sanguíneo e da concentração de oxigênio todos juntos. A irradiação lâmpada de mercúrioFITC emocionante também excita Pd-TCPP, no entanto, gerando oxigênio singlete muito e levando a estase do fluxo sanguíneo. Quando tanto o fluxo sanguíneo e tensão de oxigénio são medidos no mesmo animal, a imagem FITC deve ser feito antes de Pd-TCPP é administrada. Além disso, o nível de oxigénio sistémica é indicativo do consumo de oxigénio no tecido. É preferível executar o gerenciamento respiratória durante experimentos ou analisar os níveis de gases sanguíneos após experimentos.

Utilizou-se APAP para induzir a hepatite aguda, em parte porque uma dose elevada de APAP é conhecida a conduzir a necrose de células na região pericentral ^10. Medição da pressão parcial de oxigénio mostrou a 20,9 mmHg pO ₂ diferença entre vénulas de portal e vénulas centrais em ratinhos de controlo diminuiu para 16,9 mmHg nos ratos tratados com APAP-e que o pO ₂ foi mais elevada em toda a microcirculação hepática. O gradiente de oxigênio na microcirculação hepática é principalmente o resultado de suppl oxigênioIED de vênulas portais sendo consumidos nos hepatócitos. A dose mais elevada de APAP induz necrose na região pericentral ^{11, 12,} e que pode diminuir o consumo de oxigénio a jusante como mostrado na Figura 3c. Para determinar os mecanismos detalhados subjacentes hepatite fígado, especialmente a relação entre a necrose do tecido e nível de oxigénio, a quantificação da extensão da necrose, e os níveis séricos de bilirrubina, ALT, AST e citocinas inflamatórias precisam de ser medidos. Um lote de doenças do fígado estão relacionados com a microcirculação hepática, por outras palavras, para a distribuição do fluxo sanguíneo, a entrega de oxigénio, e consumo de oxigénio no tecido do fígado. Em casos de ingestão de álcool crónica, cerca de 10-15% de álcool é metabolizado pelo sistema de etanol-oxidante microssomal, eo P450IIE1 molécula de álcool induzida gera NAPQI ^13, um metabolito tóxico que leva a necrose hepatocelular pericentral ^14.

Em conclusão, a nossa mea ópticasuração método pode ser usado para investigar os mecanismos fisiológicos e patológicos, analisando a estrutura microvascular, o diâmetro, a velocidade de fluxo de sangue, e tensão de oxigénio.

Não temos nada a divulgar.

Os autores agradecem a Sra. Risa Otsuka de assistência técnica e experiências de ajuda. Esta pesquisa foi parcialmente financiada pelo Ministério da Educação, Ciência, Esportes e Cultura, Grant-in-Aid para Jovens Cientistas (B), 2010, 22700476, e Memorial Foundation Suzuken 2010 para KT E esse estudo foi suportado por Pesquisa e Desenvolvimento de Simulação da Próxima Geração Integrada da matéria viva, uma parte do Desenvolvimento e Uso do Projeto de próxima geração de supercomputadores do MEXT, e em parte por JST ERATO Projeto Biologia Gás Suematsu.