Visualizzazione e analisi del flusso ematico e consumo di ossigeno nella microcircolazione epatica: Applicazione di un modello di epatite acuta

Un sistema ottico è stato sviluppato per visualizzare microcircolazione epatica con eritrociti marcata con FITC e per misurare la pressione parziale di ossigeno nel microvasi con laser assistita phosphorimetry. Questo metodo può essere usato per studiare i meccanismi fisiologici e patologici analizzando struttura microvascolare, diametro, velocità del flusso ematico, e tensione di ossigeno.

C'è una notevole discrepanza tra l'offerta e la domanda di ossigeno nel fegato, perché il consumo di ossigeno epatico è relativamente alto, ma circa il 70% delle scorte di sangue epatico è poco vena porta sangue ossigenato derivato dal tratto gastrointestinale e la milza. L'ossigeno viene trasportato al epatociti dal sangue che scorre da un ramo terminale della vena porta ad un venule centrale via sinusoidi, e questo rende un gradiente di ossigeno in lobuli epatici. Il gradiente di ossigeno è un importante parametro fisico che coinvolge l'espressione di enzimi a monte ea valle in microcircolazione epatica, ma la mancanza di tecniche per la misurazione del consumo di ossigeno nel microcircolo epatico ha ritardato la delucidazione dei meccanismi relativi al metabolismo dell'ossigeno nel fegato. Abbiamo quindi usato marcata con FITC eritrociti per visualizzare la microcircolazione epatica e usato laser assistita phosphorimetry per misurare la pressione parziale di ossigeno nel microvasi lì. Noncontact e continuo di misurazione ottica in grado di quantificare velocità di flusso, diametri dei vasi sanguigni e gradienti di ossigeno legati al consumo di ossigeno nel fegato. In un modello di epatite acuta che abbiamo fatto con la somministrazione di paracetamolo ai topi che abbiamo osservato un aumento della pressione di ossigeno in entrambe le venule portali e centrale, ma un gradiente di ossigeno è diminuita nei sinusoidi, indicando che la necrosi degli epatociti nella zona pericentral potrebbe spostare la pressione di ossigeno e influenzano l'espressione degli enzimi nella zona periportale. In conclusione, i nostri metodi ottici per emodinamica epatica di misura e del consumo di ossigeno in grado di rivelare i meccanismi connessi con la malattia epatica.

1. Etichettatura Eritrociti con isotiocianato di fluorescina isomero I (FITC)

Tutti i protocolli sperimentali che abbiamo usato sono stati approvati dal Comitato Animal Cura di Keio University School of Medicine.

1. Anestetizzare una topi donatori, e dopo una incisione laparotomia prelevare sangue intero dalla vena cava inferiore con una siringa da 1 ml contenenti piccole quantità di eparina. Il topo è stato immediatamente eutanasia tramite iniezione sodio pentobarbital (100 mg / kg ip).
2. Lavare il sangue intero due volte con PBS (pH 7,4) mediante centrifugazione per 5 min a 400 g in una con rotori.
3. Sciogliere 10 mg di FITC in 5 ml di 100 mM Na ₂ HPO ₄ e filtrare con una membrana avente pori 0,22-micron.
4. In una provetta miscelare 1 ml della soluzione FITC con 0,15 ml di 3 mM di glucosio, 0,25 ml di 180 mM NaH ₂ PO ₄ ml, 1,5 e 100 mM di Na ₂ HPO _4. Aggiungere 0,2 ml di RBC pellet, e toccare il tubo per la miscelazione.
5. Mantenere la provetta per 2 ore a 4 ° C e poi lavare gli RBC macchiati due volte in PBS.
6. Mettere una piccola quantità della sospensione RBC su un prato diapositiva e vedere se gli RBC aspetto sano (cioè, che la loro forma e dimensione sono normali) e che l'intensità di fluorescenza è sufficiente.
7. Sospendere il 0,1 ml di globuli rossi in 0,9 ml di PBS a pH 7,4, e mantenere la sospensione a 4 ° C fino ad iniezione.

2. Preparazione di Ossigeno-sensitive Dye

1. Sciogliere 500 mg di BSA in 10 ml di PBS a pH 7,4.
2. Aggiungere 30 mg di Pd (II)-meso-tetra (4-carbossifenil) porfina (Pd-TCPP) alla soluzione BSA e agitazione per una notte.
3. (Opzionale) Estratto BSA-bound Pd-TCPP utilizzando gravità-flow cromatografia o una colonna di selezione per separarlo dalla libera Pd-TCPP.
4. Centrifugare la soluzione per rimuovere indisciolto Pd-TCPP, e filtrare il surnatante con un filtro a membrana con pori 0,22-micron.
5. Conservare le aliquote da 1 ml in provette a -20 ° C. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.

3. Preparazione degli animali

1. Per l'osservazione microscopica del microcircolo preparare un piatto di plastica con un foro di 20 millimetri di diametro, e nastro di 30-mm-quadrato di vetro quadrato copertina sopra il foro.
2. Anestetizzare un mouse, togliere la pelliccia e preparazione della pelle. Inserire un catetere in coda vano per l'iniezione del farmaco utilizzando un ago 30 G collegato ad un 10-cm polietilene (PE 10) catetere riempito con eparinizzata PBS.
3. Dopo l'incisione mediana, estendere un lobo principale del fegato nel piatto di plastica, e posizionare il mouse in decubito sternale.
4. Preparare piccoli slittamenti cucina con l'involucro (3 mm x 8 mm) e piastrelle intorno al bordo del lobo epatico per inibire spostamento del fegato con respirazione e tenerlo da essiccazione.
5. Osservare la microcircolazione epatica al microscopio (con luce trasmessa), e verificare che la bflusso lood non ha stasi nel campo di vista per almeno 15 min.
6. Iniettare lentamente 0,2 ml di globuli rossi fluorescente per l'osservazione del flusso sanguigno o 0,2 ml di Pd-TCPP soluzione pO ₂ misurazione. Questa quantità di globuli rossi marcata con FITC rappresenteranno per 1/50 di tutti i globuli rossi in circolazione nella regione visualizzato.

4. Visualizzazione del flusso sanguigno

1. Eccitare il FITC mediante irradiazione con luce lampada al mercurio che è passata attraverso un filtro passa-banda (450-490 nm) ^1.
2. Registrare l'immagine fluorescente con una telecamera CCD.

5. pO ₂ Misura

Pd-TCPP fosforescenza è relativamente debole e deve essere rilevata con elevata sensibilità del rivelatore. Tutti gli esperimenti devono essere eseguite in una stanza buia.

1. I picchi di assorbimento di Pd-TCPP sono a 410 nm e 532 nm, quindi la seconda armonica lunghezza d'onda 532 nm è raccomandato per l'eccitazione. Questa lunghezza d'onda può essere generato da un Nd: YAG impulso laser ^2.
2. Far passare il fascio dal laser Nd: YAG nella porta appropriata sul microscopio invertito, e regolare il punto di fascio ad una posizione centrale nel piano focale. La risoluzione spaziale dipende dalla dimensione del punto laser, che viene modificato facendo passare il fascio attraverso un forellino.
3. Per rilevare la fosforescenza, collegare un lungo filtro passa-(> 620 nm) e un tubo fotomoltiplicatore (PMT) all'altra porta del microscopio. La PMT dovrebbe essere sensibile alle lunghezze d'onda rosse, in particolare intorno a 700 nm.
4. Campionare il segnale fosforescenza (500 punti campionati a 200 kHz) e calcolare la costante di tempo di decadimento inserendo una funzione esponenziale al decadimento.
5. Per la calibrazione preparare due serie di campioni di Pd-TCPP soluzione pO ₂ 150 mmHg e 0 mmHg. Aggiungere ditionito di sodio 1% in volume da campionare per produrre assenza di ossigeno. Mantenere il pH dei campioni a 7,4 e la temperatura a 37 ° C durante la calibrazione.
6. Fissare il Stern-Volmer costante k _q e oxygen-free tempo di decadimento della luminescenza τ ₀ nell'equazione (1) ^3. Nel nostro caso, con Pd-TCPP soluzioni a 37 ° C e un pH di 7,4, _q k è 374 mmHg ^-1 s ^-1 e τ ₀ è 0,74 ms. Questi parametri di misura dipendono dalla apparecchiatura (cioè laser, rivelatore, altri dispositivi ottici) e il metodo di elaborazione del segnale, quindi è necessaria la calibrazione in ciascun sistema di misurazione ^4.
   τ ₀ / τ = ​​1 + k _q • τ ₀ • pO ₂ (1)
7. Impostare il mouse sul piatto sul microscopio scena, osservare la microcircolazione epatica, e regolare la posizione del bersaglio microvasi al punto del punto laser.

6. Epatite Modello

1. Topi veloci con libero accesso all'acqua durante la notte.
2. Preparare una20 mg per ml di soluzione di paracetamolo (APAP) in DMSO.
3. Iniettare la intraperitonealy a 1 ml/100 g di peso corporeo (cioè 200 mg / kg di peso corporeo). Dopo l'iniezione, il mouse può essere dato libero accesso a cibo e acqua ^5.
4. 24 ore dopo l'iniezione, anestetizzare il mouse e esporre il fegato da una incisione mediana. Se si ottiene epatite, necrosi nella regione pericentral sarà facilmente visibili ad occhio nudo.

7. Risultati rappresentativi

Esempio di immagini microcircolo epatico sono mostrati nella Figura 1, dove (a) è una luce trasmessa immagine e (b) è una immagine di fluorescenza. I singoli eritrociti FITC marcati si osservano nel film video, e venule portali, sinusoidi, e venule centrali sono riconosciuti dalla direzione del flusso sanguigno.

Come mostrato in figura 2, il punto laser irradiare un venule centrale attraverso una lente di obiettivo x100 era approximtamente 10 um in diametro. Intravascolare pO ₂ nel microcircolo epatica è stata misurata in maschio C57BL / 6 topi, e la figura 3 (a) mostra le relazioni tra pO ₂ e diametro del vaso in venule portale e centrale. Il gradiente di pO ₂ dal portale venule centrale indica che l'ossigeno i globuli rossi comunicato in modo efficace durante il passaggio attraverso sinusoidi. Come mostrato nella Figura 3 (b), la media pO ₂ era 59,8 mmHg in vasi portali e 48,2 mmHg in sinusoidi, e 38,9 mmHg in venule centrali.

Quando abbiamo prodotto epatite acuta iniettando APAP intraperitonealy, intravascolare pO ₂ è stato significativamente elevati in ogni parte della microcircolazione epatica: p <0.05 nelle vene portali e p <0.01 in sinusoidi e nelle vene centrali (Figura 3 (c)).

Figura 1. Basso ingrandimento imaghi mostrando microcircolazione epatica con (a) luce trasmessa e (b) fluorescenza.

Figura 2. Immagine di spot laser irradiare un venule mirato centrale per pO ₂ misura.

Figura 3. PO ₂ gradiente nella microcircolazione epatica di topi sani di controllo e di topi con paracetamolo lesione epatica indotta. (A) mostra pO ₂ rispetto al diametro del vaso per portale venule (PV) e venule centrale (CV), e (b) mostra il gradiente di ossigeno da PV a CV attraverso sinusoidi (S). La differenza di _due pO tra PV e CV riflette il consumo di ossigeno di epatociti o di altre cellule parenchimali. (C) mostra che in condizioni di epatite indotta da APAP amministrazione, pO ₂ è stato significativamente elevati nei PV, S, e il CV e la pO ₂pendenza ridotta, indicando che il consumo di ossigeno epatica è stata compromessa.

Fornire ossigeno ai tessuti è un ruolo essenziale del microcircolo, e un sacco di articoli descrivono malattie legate all'anatomia dei microvasi e la reologia ^6. Il flusso ematico epatico è una combinazione di sangue arterioso e venoso. Circa il 30% del flusso sanguigno al fegato è ben sangue ossigenato fornito dalla arteria epatica e il restante 70%, fornito dalla vena portale, è poco ossigenato deflusso venoso sangue dalla milza e tratto gastrointestinale ^7. Malattie del fegato come la steatosi epatica, shock, o il cambiamento del tumore del flusso sanguigno nella microcircolazione epatica. Per determinare l'ossigenazione dei tessuti, è necessario misurare sia il flusso sanguigno e la concentrazione di ossigeno nel microcircolo. La mancanza di strumenti disponibili in commercio per fare queste misurazioni a livello del microcircolo epatico ha reso difficile ottenere dati fisiologici in questo campo.

Un punto importante in fasi di preparazione degli animali è la fissazione diil fegato su un piatto di plastica. Risultati di fissaggio allentati in movimento sincronizzato con la respirazione del fegato, che interferisce con l'osservazione microscopica e rende difficile l'analisi. Fissazione Tight, tuttavia, fa sì che il flusso di sangue stasi. Condizioni di flusso del sangue dovrebbero essere osservati anche a bassa potenza microscopio durante la procedura operativa. Laser ad alta potenza facilmente danneggiare microvasi, per cui la frequenza della radiazione deve essere minimizzata. 1 Hz di solito è sufficiente per la misurazione temporale ^8. Tuttavia, una singola misura di pO ₂ richiede meno di 1 ms, il che significa che la frequenza di ripetizione può essere aumentato a 1 kHz per un rapido cambiamento pO _2, come necessario. Inoltre, la reazione fotochimica di Pd-TCPP genera ossigeno singoletto che danno microvasi e induce l'aggregazione piastrinica ^9. La combinazione di fluorescenza imaging e la misurazione pO ₂ può misurare la dinamica del flusso sanguigno e la concentrazione di ossigeno tutti insieme. L'irradiazione con lampada di mercurioFITC emozionante eccita anche Pd-TCPP, tuttavia, generando così molto ossigeno singoletto e porta alla stasi del flusso sanguigno. Quando sia il flusso di sangue e la tensione di ossigeno sono misurati nello stesso animale, l'imaging FITC dovrebbe essere fatto prima Pd-TCPP viene somministrato. Inoltre, il livello di ossigeno sistemica è indicativa del consumo di ossigeno nel tessuto. E 'preferibile eseguire la gestione delle vie respiratorie durante gli esperimenti e analizzare i livelli di gas nel sangue dopo gli esperimenti.

Abbiamo usato per indurre APAP epatite acuta, in parte perché una dose elevata di APAP è noto per portare a necrosi cella nell'area pericentral ^10. Misurazione della pressione parziale di ossigeno-ha mostrato il 20,9 mmHg pO ₂ differenza tra venule portali e venule centrali di topi di controllo è sceso a 16,9 mmHg nel APAP topi trattati e che la pO ₂ è risultata più alta in tutta la microcircolazione epatica. Il gradiente di ossigeno a livello del microcircolo epatico è principalmente il risultato di suppl ossigenoied da venule portali di essere consumati negli epatociti. La dose più elevata di APAP induce necrosi nella regione pericentral ^{11, 12,} e che potrebbe diminuire il consumo di ossigeno a valle come mostrato nella Figura 3c. Per determinare meccanismi dettagliati sottostanti epatite del fegato, in particolare relazione tra necrosi dei tessuti e il livello di ossigeno, la quantificazione del grado di necrosi, e livelli sierici di bilirubina, ALT, AST, e citochine infiammatorie devono essere misurati. Molte malattie del fegato sono correlate a microcircolazione epatica, in altre parole, la distribuzione del flusso sanguigno, di ossigeno, e consumo di ossigeno nel tessuto del fegato. In caso di assunzione cronica di alcool, circa 10-15% di alcol viene metabolizzato dal microsomiale etanolo-ossidante sistema, e l'alcol-indotta P450IIE1 molecola genera NAPQI ^13, un metabolita tossico che porta a pericentral necrosi epatocitaria ^14.

In conclusione, il ottico MEAsurement metodo può essere usato per studiare i meccanismi fisiologici e patologici analizzando struttura microvascolare, diametro, velocità del flusso ematico, e tensione di ossigeno.

Non abbiamo nulla da rivelare.

Autori ringraziano la signora Risa Otsuka per l'assistenza tecnica e la sperimentazione di aiuto. Questa ricerca è stata in parte sostenuta dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza, Sport e Cultura, Grant-in-Aid per giovani scienziati (B), 2010, 22700476 e Suzuken Memorial Foundation 2010 per KT E questo studio è stato supportato dalla Ricerca e Sviluppo di Next-Generation Simulazione integrata della materia vivente, una parte dello sviluppo ed uso della Next-Generation Supercomputer Progetto di MEXT, e in parte dal progetto JST ERATO Biologia Gas Suematsu.