Visualización y análisis de flujo de la sangre y del consumo de oxígeno en la microcirculación hepática: Aplicación a un Modelo de cuadro de hepatitis aguda

Un sistema óptico fue desarrollado para visualizar la microcirculación hepática con eritrocitos de FITC-etiquetados y para medir la presión parcial de oxígeno en los microvasos con asistida por láser fosforimetría. Este método puede ser utilizado para investigar los mecanismos fisiológicos y patológicos mediante el análisis de la estructura microvascular, el diámetro, la velocidad del flujo de sangre, y la tensión de oxígeno.

Hay una discrepancia considerable entre la oferta y la demanda de oxígeno en el hígado, porque el consumo de oxígeno hepático es relativamente alto, pero aproximadamente el 70% del suministro sanguíneo hepático no está bien oxigenado sangre de la vena portal de deriva en el tracto gastrointestinal y bazo. El oxígeno es transportado a los hepatocitos por la sangre que fluye de una rama terminal de la vena porta con una vénula central a través de los sinusoides, y esto hace que un gradiente de oxígeno en los lóbulos hepáticos. El gradiente de oxígeno es un parámetro importante físico que implica la expresión de las enzimas de aguas arriba y aguas abajo de la microcirculación hepática, pero la falta de técnicas para medir el consumo de oxígeno en la microcirculación hepática ha retrasado la elucidación de los mecanismos relacionados con el metabolismo del oxígeno en el hígado. Por lo tanto, utiliza FITC-etiquetados eritrocitos para visualizar la microcirculación hepática y utilizado asistida por láser fosforimetría para medir la presión parcial de oxígeno en los microvasos allí. Noncontact y medición óptica continua puede cuantificar velocidades del flujo sanguíneo, los diámetros de los vasos, y los gradientes de oxígeno relacionados con el consumo de oxígeno en el hígado. En un modelo de hepatitis aguda hemos hecho mediante la administración de paracetamol a los ratones que hemos observado aumento de la presión de oxígeno en los dos vénulas portales y la central, sino un gradiente de disminución de oxígeno en los sinusoides, lo que indica que la necrosis de hepatocitos en la zona pericentral podría cambiar la presión de oxígeno y afectar la expresión de enzimas en la zona periportal. En conclusión, nuestros métodos ópticos para la medición hemodinámica hepática y el consumo de oxígeno puede revelar los mecanismos relacionados con la enfermedad hepática.

1. Etiquetado de eritrocitos con fluoresceína isotiocianato me isómero (FITC)

Todos los protocolos experimentales que utilizamos fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Keio Facultad de Medicina.

1. Anestesiar a un ratones donantes, y después de hacer una incisión celiotomía retirar toda la sangre de la vena cava inferior con una jeringa de 1 ml que contiene una pequeña cantidad de heparina. El ratón se sacrificó inmediatamente por inyección de pentobarbital sódico (100 mg / kg ip).
2. Lavar la sangre entera dos veces con PBS (pH 7,4) por centrifugación durante 5 min a 400 g en un rotor de giro-cubo.
3. Disolver 10 mg de FITC en 5 ml de 100 mM de Na ₂ HPO ₄ y filtrar con una membrana que tiene 0,22 micras-poros.
4. En un tubo de ensayo mezclar 1 ml de la solución FITC con 0,15 ml de 3 mM de glucosa, 0,25 ml de 180 mM de NaH ₂ ml de PO _4, y 1,5 de 100 mM de Na ₂ HPO _4. Añadir 0,2 ml de la RBC pellets, y toque el tubo para mezclar.
5. Mantener el tubo durante 2 horas a 4 ° C y luego lavar los glóbulos rojos teñidos en PBS dos veces.
6. Ponga una pequeña cantidad de la suspensión de glóbulos rojos en una hierba de diapositivas y ver si los glóbulos rojos aspecto saludable (es decir, que su forma y tamaño son normales) y que la intensidad de la fluorescencia es suficiente.
7. Suspender el 0,1 ml de glóbulos rojos en 0,9 ml de PBS a pH 7,4, y mantener la suspensión a 4 ° C hasta que la inyección.

2. Preparación de oxígeno sensible a Dye

1. Disolver 500 mg de BSA en 10 ml de PBS a pH 7,4.
2. Añadir 30 mg de Pd (II)-meso-tetra (4-carboxifenil) porfirina (Pd-TCPP) a la solución de BSA y se agita durante la noche.
3. (Opcional) Extracto de BSA-enlazado Pd-TCPP mediante flujo por gravedad o una cromatografía en columna de centrifugación para separarlo de libre Pd-TCPP.
4. Centrifugar la solución para eliminar sin disolver Pd-TCPP, y filtrar el sobrenadante con un filtro de membrana que tiene 0,22 micras-poros.
5. Tienda 1-ml alícuotas en tubos a -20 ° C. Evitar una repetición de los ciclos de congelación-descongelación.

3. Preparación de Animales

1. Por observación microscópica de la microcirculación preparar una placa de plástico con un agujero de 20 mm de diámetro, y una cinta de vidrio de 30-mm cuadrados cubierta cuadrada sobre el agujero.
2. Anestesiar a un ratón, quite la piel, y la preparación de la piel. Colocar un catéter en la cola vano para la inyección de drogas mediante el uso de una aguja G 30 conectado a un polietileno de 10 cm (PE 10) catéter lleno con heparinizada PBS.
3. Tras la incisión mediana, extender un lóbulo principal del hígado en la placa de plástico, y colocar el ratón en decúbito esternal.
4. Preparar pequeños trozos con una envoltura de cocina (3 mm x 8 mm) y baldosa ellos alrededor del borde del lóbulo hepático para inhibir movimiento del hígado con la respiración y evitando que el secado.
5. Observe la microcirculación hepática en el microscopio (con luz transmitida), y confirmar que el blood flujo no tiene ninguna estasis en el campo de visión por lo menos durante 15 min.
6. Lentamente inyectar 0,2 ml de eritrocitos marcadas fluorescentemente para la observación del flujo sanguíneo o 0,2 ml de Pd-TCPP solución para pO ₂ medición. Esta cantidad de glóbulos rojos marcados con FITC representarán el 1/50 de todos los glóbulos rojos en circulación en la región visualizada.

4. Visualización de flujo de la sangre

1. Excitar el FITC por irradiación con luz de una lámpara de mercurio que ha pasado por un filtro de banda (450-490 nm) ^1.
2. Grabe la imagen fluorescente con una cámara CCD.

5. PO ₂ de Medición

Pd-TCPP fosforescencia es relativamente débil y debe ser detectado con un detector de alta sensibilidad. Todos los experimentos deben realizarse en un cuarto oscuro.

1. Los picos de absorción de Pd-TCPP son a 410 nm y 532 nm, de modo que el segundo armónico de longitud de onda 532 nm es recomendado para la excitación. Esta longitud de onda puede ser generada por un láser Nd: YAG de pulso del láser ^2.
2. Pase el haz del láser de Nd: YAG en el puerto apropiado en el microscopio invertido, y ajustar el haz de luz a una posición central en el plano focal. La resolución espacial depende del tamaño del punto láser, que se cambia al pasar el haz a través de un orificio.
3. Para detectar la fosforescencia, conecte un filtro de paso largo (> 620 nm) y un tubo fotomultiplicador (PMT) para el otro puerto del microscopio. La PMT debe ser sensible a longitudes de onda rojas, especialmente alrededor de 700 nm.
4. Muestra la señal de fosforescencia (500 puntos muestreados a 200 kHz) y calcular la constante de tiempo de la decadencia mediante el ajuste de una función exponencial a la decadencia.
5. Para la calibración de preparar dos grupos de muestras de Pd-TCPP solución con pO ₂ 150 mmHg y 0. Añadir ditionito de sodio al 1% en volumen de muestra para producir ausencia de oxígeno. Mantener el pH de las muestras a 7,4 y la temperaturatura a 37 ° C durante la calibración.
6. Fijar el tiempo de la luminiscencia de Stern-Volmer constante de desintegración _q k y el oxígeno libre τ ₀ en la ecuación (1) ^3. En nuestro caso, con Pd-TCPP soluciones a 37 ° C y un pH de 7,4, k _q es 374 mm Hg ^-1 s ^-1 y τ ₀ es de 0,74 ms. Estos parámetros de medición dependerá del equipo (es decir, láser, detector, otros dispositivos ópticos) y el método de procesamiento de señales, de modo de calibración se necesita en cada sistema de medición ^4.
   τ ₀ / τ = ​​1 + k _q • τ ₀ • PO ₂ (1)
7. Ponga el ratón en la placa de la platina del microscopio, observar la microcirculación hepática, y ajustar la posición de la microvasculatura de destino hasta el punto de que el punto láser.

6. La hepatitis Modelo

1. Los ratones rápidos con acceso libre al agua durante la noche.
2. Prepare una20 mg por ml de solución de acetaminofeno (APAP) en DMSO.
3. Inyéctela intraperitonealmente a 1 ml/100 g de peso corporal (es decir, 200 mg / kg de peso corporal). Después de la inyección, el ratón se puede dar acceso libre a comida y agua ^5.
4. 24 horas después de la inyección, anestesiar el ratón y exponer el hígado, al hacer una incisión mediana. Si se logra la hepatitis, necrosis en la región pericentral será fácilmente visible para el ojo desnudo.

7. Los resultados representativos

Imágenes de ejemplo de la microcirculación hepática se muestra en la Figura 1, donde (a) es una imagen de luz transmitida y (b) es una imagen de fluorescencia. Individuales de los eritrocitos FITC marcado se observan en la película de vídeo, y vénulas portales, sinusoides y vénulas centrales son reconocidos por la dirección del flujo de sangre.

Como se muestra en la Figura 2, el punto láser irradiar una vénula central a través de una lente de objetivo x100 era aproximinmediatamente 10 micras de diámetro. Intravascular pO ₂ en la microcirculación hepática se midió en C57BL macho / 6 ratones, y la Figura 3 (a) muestra las relaciones entre pO ₂ y el diámetro del vaso en vénulas portales y central. La PO ₂ gradiente desde el portal de vénulas centrales indica que los glóbulos rojos liberan oxígeno de manera eficiente al pasar por sinusoides. Como se muestra en la Figura 3 (b), el promedio de pO ₂ fue de 59,8 mmHg en los vasos portales, 48,2 mmHg en sinusoides, y 38,9 mmHg en vénulas centrales.

Cuando se produce una hepatitis aguda mediante la inyección de APAP intraperitoneal, intravascular pO ₂ fue significativamente elevado en cada parte de la microcirculación hepática: p <0,05 en las venas porta y p <0,01 en los sinusoides y venas centrales (Figura 3 (c)).

Figura 1. Baja magnificación iLos magos que muestra la microcirculación hepática con (a) de luz transmitida y fluorescencia (b).

Figura 2. Imagen del punto láser irradiar una vénula dirigido central de PO ₂ de medición.

Figura 3. PO ₂ gradiente en la microcirculación hepática de ratones sanos y ratones con lesión hepática inducida por paracetamol. (A) muestra PO ₂ en comparación con el diámetro del vaso para el portal de vénulas (PV) y el centro de las vénulas (CV), y (b) muestra el gradiente de oxígeno del PV a la CV a través de los sinusoides (S). La PO ₂ diferencia entre PV y el CV refleja el consumo de oxígeno de los hepatocitos y otras células del parénquima. (C) muestra que en las condiciones de la hepatitis inducida por la administración de APAP, pO ₂ fue significativamente elevado en Puerto Vallarta, S, y el CV y la pO ₂gradiente de disminución, lo que indica que el consumo de oxígeno hepático se ha visto comprometida.

Entrega de oxígeno a los tejidos es una función esencial de la microcirculación, y un montón de artículos describen las enfermedades relacionadas con la anatomía y la reología de los microvasos ^6. Flujo sanguíneo hepático es una combinación de la sangre arterial y venosa. Aproximadamente el 30% del flujo de sangre hacia el hígado es bien oxigenada sangre proporcionada por la arteria hepática y la otra 70%, suministrado por la vena porta, es la salida de sangre venosa mal oxigenada desde el bazo y el tracto gastrointestinal ^7. Las enfermedades hepáticas como el hígado graso, una descarga, o cambio el tumor del flujo sanguíneo en la microcirculación hepática. Para determinar oxigenación de los tejidos, hay que medir tanto el flujo sanguíneo y la concentración de oxígeno en la microcirculación. La falta de instrumentos disponibles en el mercado para hacer estas mediciones en la microcirculación hepática ha hecho que sea difícil obtener datos fisiológicos en este campo.

Un punto importante en los pasos de preparación de los animales es la fijación deel hígado en una placa de plástico. Resultados flojos de fijación en el movimiento sincronizado con la respiración del hígado, lo cual interfiere con la observación microscópica y hace difícil el análisis. La fijación apretada, sin embargo, hace que el flujo de sangre estasis. Condiciones de flujo de sangre deben ser observados a través de un microscopio de baja potencia durante el procedimiento quirúrgico. Láseres de alta potencia fácilmente lesionar microvasos, por lo que la frecuencia de la irradiación deben ser minimizados. 1 Hz es suficiente para la medición temporal ^8. Sin embargo, una sola medición de pO ₂ toma menos de 1 ms, lo que significa que la frecuencia de repetición se puede aumentar a 1 kHz para un rápido cambio de pO _2, según sea necesario. Además, la reacción fotoquímica de Pd-TCPP genera oxígeno singlete que los daños microvasos e induce la agregación plaquetaria ^9. La combinación de imágenes de fluorescencia y la medición PO ₂ puede medir la dinámica del flujo sanguíneo y la concentración de oxígeno todos juntos. La irradiación lámpara de mercurioFITC interesante también excita Pd-TCPP, sin embargo, lo que genera oxígeno singlete mucho y que conduce a la estasis del flujo sanguíneo. Cuando tanto el flujo sanguíneo y la tensión de oxígeno se midió en el mismo animal, la formación de imágenes con FITC debe hacerse antes de Pd-TCPP se administra. Además, el nivel de oxígeno sistémica es indicativo del consumo de oxígeno en el tejido. Es preferible llevar a cabo la gestión de las vías respiratorias durante los experimentos y analizar los niveles de gases en sangre después de los experimentos.

Se utilizó la APAP para inducir hepatitis aguda, en parte debido a una alta dosis de APAP se sabe para llevar a la necrosis celular en la región pericentral ^10. Medición de la presión parcial de oxígeno mostró el 20,9 mmHg de PO ₂ diferencia entre vénulas portales y vénulas centrales en los ratones de control se redujo a 16,9 mmHg en los ratones tratados con APAP y que el PO ₂ fue más alta en la microcirculación hepática. El gradiente de oxígeno en la microcirculación hepática es principalmente el resultado de suppl de oxígenoIED de vénulas portales que se consumen en los hepatocitos. La dosis más alta de APAP induce necrosis en la región pericentral ^{11, 12,} y que podría reducir el consumo de oxígeno aguas abajo como se muestra en la Figura 3c. Para determinar los mecanismos que subyacen a la hepatitis de hígado detallados, especialmente la relación entre la necrosis de los tejidos y nivel de oxígeno, la cuantificación de la extensión de la necrosis, y los niveles séricos de bilirrubina, ALT, AST, y citoquinas inflamatorias deben ser medidos. Una gran cantidad de enfermedades hepáticas están relacionadas con la microcirculación hepática, en otras palabras, para la distribución del flujo sanguíneo, el suministro de oxígeno, y el consumo de oxígeno en el tejido hepático. En los casos de ingesta de alcohol crónica, aproximadamente 10-15% de alcohol es metabolizado por el microsomal etanol-oxidante del sistema, y la molécula P450IIE1 inducida por el alcohol genera NAPQI ^13, un metabolito tóxico que conduce a la necrosis pericentral hepatocitos ^14.

En conclusión, nuestra óptica measurement método puede ser utilizado para investigar los mecanismos fisiológicos y patológicos mediante el análisis de la estructura microvascular, el diámetro, la velocidad del flujo de sangre, y la tensión de oxígeno.

No tenemos nada que revelar.

Los autores gracias a la Sra. Risa Otsuka de asistencia técnica y ayudar a los experimentos. Esta investigación fue financiada parcialmente por el Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes y Cultura, Grant-en-Ayudas a Jóvenes Científicos (B), 2010, 22700476 y Suzuken Memorial Foundation 2010 para KT Y este estudio fue apoyado por la investigación y el desarrollo de la simulación integrada de próxima generación de la materia viva, una parte del desarrollo y la utilización del proyecto del superordenador de última generación de MEXT, y en parte por JST ERATO Proyecto Biológico Suematsu gas.