Simples e robusto In vivo E In vitro Abordagem para o Estudo Assembléia Virus

Uma maneira simples, eficiente e robusta para sincronizar a entrega de múltiplos componentes virais para as células vegetais através Agrobacterium Mediada expressão transiente é descrito. Esta abordagem é favorável para estudar a replicação, encapsidação seguido por In vitro Remontagem de componentes não-virais do genoma empobrecido ópticos fantasmas virais adequados para aplicações biomédicas.

Em vírus com sentido positivo patogênico genomas RNA de seres humanos, animais e plantas, de encapsidação progênie em viriões maduros e estáveis ​​é uma fase cardeal durante o estabelecimento da infecção em um determinado host. Consequentemente, o estudo de encapsidação decifra as informações sobre o know-how do mecanismo de regulação montagem do vírus para formar virions infecciosos. Essa informação é vital na formulação de novos métodos de contenção propagação do vírus e controle da doença. Encapsidação vírus pode ser estudada in vivo e in vitro. Encapsidação Genoma in vivo é um processo altamente regulado seletiva envolvendo interações macromoleculares e compartimentalização subcelular. Portanto, estudar levando a dissecar eventos abrangendo encapsidação vírus in vivo seria fornecer conhecimentos básicos para compreender como os vírus se proliferam e montar. Recentemente, em encapsidação vitro tem sido explorada para a pesquisa na área de biomédica imaging e aplicações terapêuticas. Vírus não-envelopados plantas estão muito à frente no empreendimento de encapsidação em vitro da matéria carregada negativamente estrangeira. Brome vírus do mosaico (BMV), um não encapsulado multicomponente patogenicidade do vírus de RNA para plantas, tem sido utilizado como um sistema modelo para estudar embalagem genoma in vivo e in vitro. Para os ensaios de encapsidação em plantas de Nicotiana benthamiana, mediada por Agrobacterium de expressão transiente, se referem como agroinfiltration, é uma técnica eficiente e fiável para a entrega sincronizado e expressão de componentes múltiplos para a mesma célula. Nesta abordagem, uma suspensão de células de Agrobacterium tumefaciens que transportam binários vectores plasmídicos transportando cDNAs de mRNAs desiredviral é infiltrado no espaço intercelular folha withina usando nada mais sofisticado que uma seringa de 1 ml descartável (sem agulha). Este processo resulta na transferência de inserção de ADN em células vegetais; o T-DNAinserto permanece transientemente no núcleo e, em seguida, é transcrito pelo hospedeiro polimerase II, que conduz à expressão transiente. A transcrição do mRNA resultante (nivelado e poliadenilado) é então exportado para o citoplasma para a tradução. Após aproximadamente 24 a 48 horas de incubação, as secções de folhas infiltradas pode ser amostrada para microscopyor análises bioquímicas. Agroinfiltration permite um grande número (centenas a milhares) de células a serem transfectadas simultaneamente. Para na encapsidação vitro, partículas virais purificadas de BMV são dissociados em proteína da cápside por diálise contra a dissociação de cloreto de cálcio tampão contendo seguido por remoção de RNA e un-dissociados viriões por centrifugação. Genoma empobrecido subunidades da proteína da cápside são reagrupados com desejados componentes do genoma viral ou não virais, tais como componentes indocianina corante.

1. O material vegetal

1. Plantas de Nicotiana benthamiana a serem utilizados no ensaio de encapsidação deve estar na fase 4 folhas (plantas semana aproximadamente 3-4 de idade).

2. Entrega e expressão de componentes funcionais do genoma viral para plantar células por agroinfiltration

1. Dia 1: A estirpe de Agrobacterium (por exemplo, EH 105 ou GV 3101) abrigando o RNA pCass-BMV 1, BMV RNA 2 e 3 BMV RNA ^1,2 são cultivadas em placas de LB agar suplementado com 50 mg / ml de canamicina (selecciona para o vetor pCASS) e 100mg/ml de rifampicina (seleciona para o Agrobacterium). A incubação é realizada a 28 ° C durante dois dias.
2. Dia 3: única colónia Inocular a partir da placa de agar LB em 2 ml de caldo LB contendo 50 mg / ml de canamicina e 100 mg / ml de rifampicina durante 1 dia a 28 ° C em agitador orbital fixado em 250 RPM.
3. Dia 4: Inocular 50 ml de suplemento de caldo LBed com 50 mg / ml de canamicina e 100 mg / ml de rifampicina, 10 mM de MES pH 5,6 e 100 mM de acetoseringona com um ml de cultura em um 250 ml de Erlenmeyer durante 16 horas a 28 ° C em agitador orbital a 250 rpm .
4. Dia 5: Transferência da cultura (quando OD ₆₀₀ atingiu 1,0) para um tubo Oak Ridge ou tubo Falcon estéril e centrifugar durante 10 minutos a 5000 rpm a 4 ° C.
5. Dissolve-se o pellet em 10 ml de 10 _mM de MgCl2 e centrifuga-se durante 10 minutos a 5000 rpm a 4 ° C, Repetir este passo mais uma vez para assegurar a remoção completa do antibiótico.
6. Suspender o sedimento em 10 ml de tampão contendo 10 _mM de MgCl2 e 10 mM de MES (pH 5,6).
7. Medir a OD ₆₀₀ para cada cultura de BMV RNA 1, 2 e RNA do RNA 3 e ajusta-se 0,1 OD ₆₀₀ utilizando 10 _mM de MgCl2 e 10 mM de MES (pH 5,6).
8. Misturar 1 ml cada todos os três 0,1 OD ₆₀₀ suspensões de cultura.
9. Adicionar 100 mM de acetoseringona, mix gently e manter a mistura não perturbada à temperatura ambiente durante 3 horas.
10. Desenhar a suspensão de cultura em 1 ml. seringa sem agulha.
11. Infiltrar-se na suspensão cultura acima no lado abaxial de 2-3 bem expandidos folhas de N. benthamiana (5 folhas, as plantas fase de 3-4 semanas de idade), pressionando cuidadosamente a seringa para uma metade da superfície abaxial de folha.
12. Repita este procedimento de infiltração para outras folhas.
13. Mantenha as plantas infiltradas na casa verde com 24 ° C.
14. Colheita infiltrada folhas de 3 a 4 dias depois da infiltração (dpi).

3. Purificação de viriões BMV

1. Colete N. benthamiana deixa agroinfiltrated com uma mistura contendo todos os três agrotransformants tipo selvagem BMV.
2. Moer folhas em um pilão e almofariz estéril com um volume igual (w / v) de tampão de extracção BMV (0,5 M NaAc; 0,08 M ​​MgAc, pH 4,5 e volume 1/100 de β-mercaptoetanol, que é para ser adicionado imediatamente antes da utilização) ^3. Para maximizar o rendimento do vírus, é recomendável adicionar areia lavada ácido (~ 0,5-1 g) que facilita rompimento celular fácil trituração e eficiente.
3. Filtrar o extrato da folha através de 2-3 camadas de musselina e recolher a enxurrada.
4. Novamente moer a parte retida sobre o pano de musselina com igual volume de tampão de extracção BMV ao peso inicial do material de folha.
5. Repita o procedimento de filtração, utilizando pano de musselina. Estes passos devem ser realizadas a 4 ° C.
6. Transferir a solução de filtrado para um tubo de centrífuga e adicionar volume igual de pré-refrigeradas clorofórmio e vórtice (ou agitação) durante 5 minutos à temperatura ambiente até que a cor da suspensão vira verde claro.
7. Centrifugar a solução emulsionada durante 15 minutos a 12.000 rpm a 4 ° C.
8. Recolher a fase aquosa e agita-se durante 30 minutos em um agitador magnético para remover qualquer clorofórmio residual.
9. Transferir a suspensão para um tubo de ultracentrifuga estéril.
10. Underlay 1 ml. Sacarose a 10% (preparada no tampão de extracção de vírus) como um ³ almofada.
11. Centrifugar a 30.000 rpm durante 3 horas numa ultracentrífuga Beckman a 4 ° C.
12. Descartar o sobrenadante e suspender o pellet em volume desejado de BMV tampão de suspensão (para preparar a suspensão de tampão de tampão de extracção diluído BMV a 1/10 com água destilada estéril).
13. A preparação do virião parcialmente purificada a partir do passo acima é submetida a 10-40% centrifugação em gradiente de sacarose de densidade para 150 min a 28000 rpm a 4 ° C.
14. Coletar a banda de vírus manualmente ou por um fraccionamento. A banda vírus aparecem em azul sob iluminação de luz branca.
15. Dilui-se a solução de sacarose contendo amostra de vírus pelo menos 50% com tampão de suspensão de vírus.
16. Centrifugar diluída vírus solução de sacarose contendo durante 3 horas à 30.000 rpm numa ultracentrífuga Beckman a 4 ° C.
17. Finalmente suspender o vírus altamente purificada pelete num volume desejado de Virnos suspensão buffer.
18. Medir a concentração do virião (mg / ml) usando espectrofotómetro a OD _260.

Nota: Com base no conteúdo de ARN, o coeficiente de extinção para BMV é 5 ^4.

19. Verificar a pureza de viriões por visualização sob MET (Fig. A)

4. Preparação de subunidades de proteínas da cápside de montagem in vitro

1. Prepare 1 litro de tampão 1x vírus dissociação (0,5 M _de CaCl2, 50 mM Tris HCl, pH 7,5; 1,0 mM de EDTA, 1,0 mM de DTT e 0,5 mM de PMSF) ^5.
2. Preparar membrana de diálise de acordo com Sambrook et ai ^6.
3. Pipetar concentração necessária de vírus purificado em um saco de diálise.
4. Coloque o vírus saco de diálise contendo a um copo contendo o vírus 1x tampão de dissociação.
5. Dialisar 24 horas a 4 ° C whilagitação e.
6. Recolher a solução a partir do saco de diálise, após 24 horas e centrifugar a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Isto irá separar o ARN a partir dos viriões BMV dissociados.
7. Recolher o sobrenadante e centrifugar a 35.000 rpm em centrífuga Beckman durante 3 horas a 4 ° C para sedimentar quaisquer partículas de vírus un-dissociados.
8. Recolher o sobrenadante.
9. Nesta fase é fundamental para remover todos os contaminantes a partir de RNA virion dissociados subunidades da proteína do capsídeo. Para fazer isto, o sobrenadante do passo 8 deve ser submetido a outro ciclo de noite sobre a remontagem das subunidades de proteínas da cápside, sem adicionar qualquer RNA (em tampão de montagem RNA 1x, ver abaixo), seguido de uma centrifugação a alta velocidade (30.000 rpm, durante 3 horas à 4 ° C) para sedimentar quaisquer viriões montadas. Após este passo remontagem, o sobrenadante contendo subunidades de proteína revestimento seria livre de quaisquer contaminantes residuais RNA. No entanto, para garantir que esta, é aconselhável realizar um adicional em vitro remontagem com subunidades da proteína usando casaco apenas RNA tampão 1x montagem. Depois de durante a noite remontagem, a preparação deve estar livre do vírus da montados (verificar usando MET).
10. Determinar a concentração de subunidades de proteína da cápside por medição em OD 254 e 280 nm ou por outros métodos, como ensaio de Bradford.
11. Realizar 12-15% de SDS-PAGE seguido por Western blot para determinar a integridade dos dissociados subunidades da proteína da cápside.

5. In vitro montagem de RNA contendo os viriões

1. Preparar transcritos de RNA de ser re-montados em viriões e calcular a concentração de ^7.
2. Misturar subunidades da proteína da cápside e RNA transcrito a uma razão de 1:5 (peso / peso) ^5.
3. Distribua a mistura acima para um saco de diálise e garantir de forma adequada para evitar vazamentos.
4. Prepare 1.000 ml. de RNA 1x montagem tampão (50 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,2; 10 mM de KCl, 5 _mM de MgCl2, 1,0 mM de DTT) ^5.
5. Coloque o saco de diálise contendo a mistura de reacção contra a 1x tampão de montagem para o copo e agitar.
6. Dialisar a reacção a montagem, a 4 ° C durante 24 horas por agitação suave.
7. Recolher-se a mistura a partir do saco de diálise, após 24 horas e adicionar 1,5 ml de tampão de RNA de montagem.
8. Passa esta mistura através de uma coluna Centricon-100 por centrifugação a baixa velocidade (2000 xg) durante 30 minutos.
9. Lavar a coluna uma vez com 1,5 ml de tampão de montagem, a 4 ° C durante 30 min.
10. Repetir o passo de lavagem acima duas vezes.
11. Finalmente, eluir os viriões re-montado por centrifugação a 10.000 g, a 4 ° C durante 5 min.
12. Estimar a concentração de OD virion 260 nm.

6. Fabricação de óptica Ghosts Viral (OVGs)

1. Adicionar verde de indocianina (ICG) ⁸ para a proteína purificada da cápside em rácio de concentração desejada (a proporção em peso de Indocianina proteína verde e cápside utilizado neste relatório foi 1:10) um d misture bem por pipetagem.
2. Dialisar a proteína da cápside e solução ICG contra o tampão de montagem OVG (1 M de NaCl, 50 mM de NaAc; 1 mM de EDTA e 1 mM de DTT, pH4.8), a 4 ° C durante 24 horas.
3. Após 24 horas, recolher a solução a partir do saco de diálise (12 kDa tamanho de poro) e centrifugar a 90.000 rpm durante 1 hora a 4 ° C (Fig. B)
4. Remover o sobrenadante e suspender o sedimento em tampão BMV suspensão em vórtice ou permitindo que a suspensão, por si só em tampão BMV suspensão durante a noite a 4 ° C.
5. Verifique a morfologia de OVGs por TEM (Fig. C).
6. Medir a absorvância de 240 nm a 950 nm utilizando espectrofotômetro (Cary 50, Varian Inc.); a presença de ICG é confirmada por picos de absorvância de assinatura cerca de 700 nm e 790 nm ^8. (Fig. D)
7. Os típicos ICG picos de fluorescência em ~ 700 nm e ~ 800 nm pode ser visto sobre 620 nm de excitação de solução OVG (Fig. D) utilizando espectrofluorímetro (Fluorolog 3, Jobin-Yvon).

Figura A. Imagem TEM de viriões coradas negativamente VMB purificadas de N. benthamiana plantas agroinfiltrated com uma mistura de todos os três agroconstructs tipo selvagem BMV (Barra de escala = 100 nm).

Figura B. Pellet da in vitro montado ICG OVGs contendo sequência de alta velocidade de centrifugação.

Figura C. imagem TEM de coradas negativamente ICG OVGs contendo (barra de escala = 100 nm).

Figura Absorbância D. (Top) e fluorescência de espectros (fundo) de OVGs. O comprimento de onda de excitação utilizado para OVG emissão wcomo 620 nm.

Abordagem Agroinfiltration aqui apresentadas podem ser amplamente aplicável a uma ampla gama de vírus de plantas. Uma característica marca desta abordagem é sincronizado entrega de agroconstruct múltipla para a célula-a mesma desvantagem importante geralmente associado com rotineiramente utilizado inoculação mecânica de vírus de plantas. In vivo e in vitro de montagem, utilizando brome vírus do mosaico como um modelo pode ser conduzida de forma eficiente pela a seguir algumas dicas. (i) para a infiltração bem-sucedida de N. benthamiana deixa, não regar as plantas durante 24 horas antes da infiltração, (ii) Agrobacterium cultura em suspensão se espalhasse em espaços intracelulares com facilidade, se a infiltração foram realizadas entre 4-5 PM; (iii) A densidade óptica da cultura não deve exceder 1.0 a OD _600. Infiltração de agrocultures com maior densidade de células é conhecida por induzir toxicidade celular e senescência foliar ^9,10 que poderia afetar gravemente a replicação viral e posterior virionformação, (iv) Durante de infiltração sob pressão suave deve ser aplicada no lado abaxial da folha para evitar danos extensos para a folha, que pode desencadear a resposta imune em planta, (v) gradiente de densidade de sacarose de 10% a 40% pode ser feita em um tubo, tornando 25% de sacarose em tampão BMV suspensão (por adição de a concentração mais elevada e mais baixa concentração e dividindo-o por 2 ou seja, 10% + 40% / 2 = 25%) e imediatamente congelar a -80 ° C durante 2 hr -4 e continuar a possibilitar a sacarose para descongelar lentamente, mantendo-o durante a noite a 4 ° C em uma posição recta.

Não temos nada a divulgar.

Os autores gostariam de agradecer a vários membros do laboratório para as suas sugestões valiosas para o desenvolvimento de agroinfiltration e em ensaios in vitro de montagem. Este trabalho foi financiado por uma bolsa da Universidade da Califórnia. Este estudo foi financiado em partes por uma concessão do National Science Foundation (CBET-1144237).