Einfach und robust In-vivo- Und In-vitro- Ansatz für das Studium Virusassemblierung

Eine einfache, effiziente und robuste Art, die Bereitstellung von mehreren viralen Komponenten auf Pflanzenzellen zu synchronisieren über Agrobacterium-Vermittelte transiente Expression beschrieben. Dieser Ansatz ist zugänglich für die Untersuchung der Replikation, gefolgt von Enkapsidierung In-vitro- Zusammenbau von nicht-viralen Komponenten in optischen viralen Genoms erschöpft Geister geeignet für biomedizinische Anwendungen.

Bei Viren mit positiv-sense-RNA-Genome pathogen für Mensch, Tier und Pflanzen, Nachkommen Enkapsidierung zu reifen und stabilen Virionen ist ein Kardinal Phase während die Etablierung der Infektion in einem bestimmten Host. Folglich entziffert Studie von Enkapsidierung die Informationen bezüglich des Know-how des Mechanismus zur Regelung Virus Montage zu infektiösen Virionen zu bilden. Solche Informationen sind bei der Formulierung neuer Methoden zur Eindämmung des Virus Ausbreitung und Bekämpfung der Seuche von entscheidender Bedeutung. Virus Einkapselung kann in vivo und in vitro untersucht werden. Genome Enkapsidierung in vivo ist ein stark regulierter Prozess, der selektive makromolekularen Interaktionen und subzelluläre Kompartimentierung. Daher untersuchen, die zu sezieren Veranstaltungen umfasst Enkapsidierung Virus in vivo würde Basiswissen vermitteln zu verstehen, wie Viren und vermehren sich versammeln. Kürzlich in vitro Einkapselung für die Forschung auf dem Gebiet der biomedizinischen ima ausgenutztGing und therapeutische Anwendungen. Nicht-umhüllten Viren Anlage stehen weit vorne in der Venture von In-vitro-Verpackung der negativ geladenen Fremdkörper. Trespenmosaik-Virus (BMV), ein nicht-umhülltes RNA-Virus Mehrkomponenten pathogenen Pflanzen, wurde als Modellsystem für die Untersuchung Genom Verpackung in vivo und in vitro verwendet. Für Assays Einkapselung in Nicotiana benthamiana, Agrobacterium-vermittelte transiente Expression als Agroinfiltration beziehen, ist eine effiziente und robuste Technik für die synchronisierte Zuführung und Expression von mehreren Komponenten zu der gleichen Zelle. Bei diesem Ansatz wird eine Suspension von Agrobacterium tumefaciens-Zellen, die binäre Plasmid-Vektoren, die Durchführung von cDNAs desiredviral mRNAs in den Interzellularraum withina Blatt mit nichts komplizierter als einer 1 ml Einwegspritze (ohne Nadel) infiltriert. Dieses Verfahren führt zu der Übertragung von DNA-Inserts in Pflanzenzellen, die T-DNAEinsatz bleibt vorübergehend in dem Kern und wird dann durch den Host-Polymerase II transkribiert, die zur transienten Expression. Das resultierende mRNA-Transkript (Obergrenze und die polyadenylierte) wird dann in das Zytoplasma für die Übersetzung ausgeführt. Nach etwa 24 bis 48 Stunden Inkubation, können Teile des infiltrierten Blätter microscopyor biochemische Analysen entnommen werden. Agroinfiltration ermöglicht eine große Anzahl (Hunderte bis Tausende) von Zellen gleichzeitig transfiziert werden. Für In-vitro-Einkapselung sind gereinigten Virionen von BMV dissoziiert Kapsidprotein durch Dialyse gegen Dissoziationspuffer, enthaltend Calciumchlorid durch Entfernen von RNA und undissoziiert Virionen, gefolgt von Zentrifugation. Genome abgereicherten Kapsid-Protein-Untereinheiten werden dann mit den gewünschten viralen Genoms Komponenten oder nicht-viralen Komponenten wie Indocyanin Farbstoff zusammengesetzt.

1. Pflanzenmaterial

1. Nicotiana benthamiana Pflanzen in der Einkapselung des Tests verwendet werden bei 4 Blätter Stufe (etwa 3-4 Wochen alten Pflanzen) sein.

2. Lieferung und Expression von funktionellen viralen Genom-Komponenten zu Zellen, die durch Agroinfiltration pflanzen

1. Tag 1: Der Agrobacterium-Stamm (zB EH 105 oder GV 3101) beherbergt, die pCass-BMV-RNA 1, 2 und BMV-RNA BMV-RNA 3 ^1,2 auf LB-Agarplatten mit 50 mg / ml Kanamycin gezüchtet werden (wählt für die pCASS Vektor) und 100mg/ml von Rifampicin (wählt für die Agrobacterium). Die Inkubation wird bei 28 ° C für zwei Tage durchgeführt.
2. Tag 3: inokulieren einzelnen Kolonie von der LB-Agarplatte in 2 ml LB-Bouillon, die 50 mg / ml Kanamycin und 100 mg / ml Rifampicin für 1 Tag bei 28 ° C in Orbitalschüttler bei 250 RPM.
3. Tag 4: inokulieren 50 ml des LB-Brühe Ergänzunged mit 50 mg / ml Kanamycin und 100 mg / ml Rifampicin, 10 mM MES, pH 5,6 und 100 mM mit einem ml der Kultur in einem 250 ml Erlenmeyerkolben Acetosyringon für 16 Stunden bei 28 ° C am Schüttler bei 250 rpm .
4. Tag 5: Übertragen Sie die Kultur (bei ​​OD ₆₀₀ 1,0 erreicht) zu einem Oak Ridge Röhrchen oder sterile Falcon-Röhrchen und zentrifugieren Sie für 10 Minuten bei 5000 rpm bei 4 ° C
5. Das Pellet in 10 ml 10 mM MgCl ₂ und Zentrifuge für 10 Minuten bei 5000 rpm bei 4 ° C Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal um die vollständige Entfernung des Antibiotikums zu gewährleisten.
6. Hängen Sie das Pellet in 10 ml Puffer mit 10 mM MgCl ₂ und 10 mM MES (pH 5,6).
7. Messen Sie die OD ₆₀₀ für jede Kultur des BMV-RNA 1, 2 und RNA-RNA-3 und justieren zu 0,1 OD ₆₀₀ mit 10 mM MgCl ₂ und 10 mM MES (pH 5,6).
8. Mischen Sie je 1 ml alle drei 0,1 OD ₆₀₀ Kultur Suspensionen.
9. In 100 mM Acetosyringon, mischen Gently und halten das Gemisch bei Raumtemperatur ungestört für 3 Stunden.
10. Zeichnen Sie die Kultur-Suspension in 1 ml. Spritze ohne Nadel.
11. Infiltrieren Sie die oben genannten Kultur-Suspension in der abaxialen Seite von 2-3 gut ausgebildeten Blättern von N. benthamiana (5 Blätter Bühne, 3-4 Wochen alten Pflanzen) durch leichten Druck auf die Spritze, um eine Hälfte des abaxialen Oberfläche des Blattes.
12. Wiederholen Sie diesen Vorgang Infiltration zu anderen Blättern.
13. Halten Sie infiltrierten Pflanzen im Gewächshaus bei 24 ° C.
14. Ernte-infiltrierten Blätter 3 bis 4 Tage nach der Infiltration (dpi).

3. Die Reinigung des BMV Virionen

1. Sammeln Sie N. benthamiana verlässt agroinfiltrated mit einem Gemisch, das alle drei Wildtyp BMV agrotransformants.
2. Grind Blätter in einem sterilen Mörser mit einem gleichen Volumen (w / v) von BMV Extraktionspuffer (0,5 M NaAc, 0,08 M ​​MgAc, pH 4,5 und 1/100 Volumen von β-Mercaptoethanol, die unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt werden soll) ^3. Um Virus zu maximieren, ist es empfehlenswert, mit Säure gewaschenen Sand (~ 0,5-1 g), die einfach und effizient Schleifen Zellaufschluss erleichtert hinzuzufügen.
3. Filtern Sie die Blatt-Extrakt durch 2-3 Lagen Baumwolltuch und sammeln die Flut.
4. Auch hier schleifen die einbehaltene auf Baumwolltuch mit gleichen Volumen BMV Extraktionspuffer auf das Ausgangsgewicht von Blattmaterial.
5. Wiederholen Sie den Vorgang mit Filtration Baumwolltuch. Diese Schritte sollten bei 4 ° C durchgeführt werden
6. Das Filtrat Lösung zu einem Zentrifugenröhrchen eingewogen und mit gleichem Volumen vorgekühlte Chloroform zugeben und vortexen (oder schütteln) für 5 Minuten bei Raumtemperatur, bis die Farbe der Suspension wird hellgrün.
7. Zentrifugieren der emulgierten Lösung für 15 Minuten bei 12.000 rpm bei 4 ° C
8. Sammeln Sie die wässrige Phase und rühren für 30 Minuten auf Magnetrührer, um das restliche Chloroform zu entfernen.
9. Die Suspension in ein steriles Röhrchen Ultrazentrifuge.
10. Unterlage 1 ml. 10% Saccharose (hergestellt in Extraktionspuffer Virus) als Kissen ^3.
11. Zentrifugieren bei 30.000 rpm für 3 Stunden in einem Beckman-Ultrazentrifuge bei 4 ° C
12. Überstand verwerfen und Pellet in auszusetzen gewünschte Volumen der BMV Suspensionspuffer (bis Suspensionspuffer verdünnter BMV Extraktionspuffer auf 1/10 vorbereiten mit sterilem destilliertem Wasser).
13. Das teilweise gereinigte Virion Herstellung von oben durchgeführt wird, um 10-40% Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation 150 min bei 28.000 rpm bei 4 ° C unterworfen
14. Sammeln des Virus Band entweder manuell oder durch einen Fraktionator. Das Virus Band erscheint blau unter Beleuchtung mit weißem Licht.
15. Verdünnen der Lösung, die Saccharose-Virus Probe mindestens 50% mit der Virussuspension Puffer.
16. Zentrifuge verdünnten Virus, enthaltend Saccharose-Lösung für 3 Stunden bei 30.000 UpM in einer Beckman-Ultrazentrifuge bei 4 ° C
17. Schließlich setzt die hochgereinigten Viruspellet in einem gewünschten Volumen von viruns Suspensionspuffer.
18. Messen der Konzentration des Virions (mg / ml) unter Verwendung Spektrophotometer bei OD _260.

Hinweis: Basierend auf RNA-Gehalt ist der Extinktionskoeffizient für BMV 5 ^4.

19. Überprüfen Sie die Reinheit der Virionen, indem Sie unter TEM (Abb. A)

4. Vorbereitung der Kapsid-Protein-Untereinheiten für die In-vitro-Montage

1. Planen 1 Liter 1x-Virus Dissoziationspuffer (0,5 M CaCl _2, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 mM EDTA, 1,0 mM DTT und 0,5 mM PMSF) ^5.
2. Planen Dialysemembran nach Sambrook et al ^6.
3. Dosiernadel erforderliche Konzentration des gereinigten Virus in einen Dialyseschlauch.
4. Setzen Sie den Virus enthält Dialyseschlauch in ein Becherglas mit der 1x Virus Dissoziationspuffer.
5. Dialysieren 24 Stunden bei 4 ° C while Rühren.
6. Sammeln der Lösung aus dem Dialysebeutel nach 24 Stunden und Zentrifuge bei 12.000 × g für 15 min bei 4 ° C Dadurch wird die BMV-RNA aus den dissoziierten Virionen zu trennen.
7. Sammeln Sie den Überstand und Zentrifuge bei 35.000 rpm in Beckman-Zentrifuge für 3 Stunden bei 4 ° C bis Pellet jeder un-dissoziierten Viruspartikel.
8. Die überstehende Flüssigkeit.
9. In diesem Stadium ist es zwingend erforderlich, um alle verunreinigenden Virion-RNA aus dissoziierten Kapsidprotein Untereinheiten zu entfernen. Um dies zu tun, sollte der Überstand aus Schritt 8 bis eine weitere Runde von über Nacht Remontage von Kapsid-Protein-Untereinheiten ohne Zugabe von RNA (RNA in 1x Montage-Puffer, siehe unten) von einem Hochgeschwindigkeitszentrifugation (30.000 rpm für 3 Stunden bei gefolgt unterzogen werden 4 ° C) Pelletierung nicht montiert Virionen. Nach diesem Zusammenbau Schritt würden die enthaltende Überstand Hüllprotein-Untereinheiten frei von jeglichen restlichen kontaminierender RNA. Doch um dies zu gewährleisten, ist es ratsam, eine zusätzliche in v ausführenITRO Zusammenbau mit nur Hüllprotein-Untereinheiten mittels RNA 1x Montage-Puffer. Nach dem Zusammenbau über Nacht, muss die Zubereitung frei von Virionen zusammengebaut (Überprüfung mittels TEM).
10. Die Konzentration von Kapsid-Protein-Untereinheiten durch Messen der OD 254 und 280 nm oder durch andere Verfahren, wie Bradford-Assay.
11. Führen 12-15% SDS-PAGE, gefolgt von Western Blot, um die Integrität der dissoziierten Kapsid-Protein-Untereinheiten zu bestimmen.

5. In-vitro-RNA, die Montage der Virionen

1. Bereiten RNA-Transkripte in Virionen wieder zusammengebaut werden und die Konzentration ^7.
2. Mischen Kapsid-Protein-Untereinheiten und RNA-Transkript in einem Verhältnis von 1:5 (w / w) ^5.
3. Pipettieren Sie die obige Mischung in einen Dialyseschlauch und ordnungsgemäß zu sichern, um jegliches Auslaufen zu vermeiden.
4. Bereiten 1.000 ml. Anordnung von RNA 1x Puffer (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM KCl, 5 mM MgCl _2, 1,0 mM DTT) ^5.
5. Legen Sie den Beutel mit der Dialyse Reaktionsgemisch gegen 1x Montage-Puffer in das Becherglas und rühren.
6. Dialysieren des Re-Assembly Reaktion bei 4 ° C für 24 Stunden unter leichtem Rühren.
7. Sammeln Sie die Mischung aus dem Dialyseschlauch nach 24 Stunden und 1,5 ml der RNA-Montage-Puffer.
8. Übergeben dieses Gemisch durch eine Centricon-100-Säule durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (2000 × g) für 30 Minuten.
9. Die Säule wird einmal mit 1,5 ml Anordnung Puffer bei 4 ° C für 30 min.
10. Wiederholen Sie den obigen Waschschritt zweimal.
11. Schließlich eluieren wieder zusammengesetzt Virionen durch Zentrifugation bei 10.000 g bei 4 ° C für 5 min.
12. Schätzen Sie die Virion-Konzentration bei OD 260 nm.

6. Herstellung von optischen Viral Ghosts (OVGs)

1. Fügen Sie Indocyaningrün (ICG) ⁸ dem gereinigten Kapsidprotein an gewünschten Konzentrationsverhältnis (das Gewichtsverhältnis von Indocyaningrün und Kapsidprotein in diesem Bericht verwendet wurde, war 1:10) ein d gründlich mischen durch Pipettieren.
2. Dialysieren des Kapsidprotein und der ICG-Lösung gegen die OVG Anordnung (1 M NaCl, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA und 1 mM DTT, pH 4,8) bei 4 ° C für 24 Stunden.
3. Nach 24 Stunden, sammeln die Lösung von der Dialysebeutel (12 kDa Porengröße) und Zentrifuge bei 90.000 UpM für 1 Stunde bei 4 ° C (Bild B)
4. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in auszusetzen BMV Suspensionspuffer durch Vortexen oder so dass sie von selbst in BMV Suspensionspuffer über Nacht auszusetzen bei 4 ° C
5. Überprüfen Sie die Morphologie der OVGs durch TEM (Abb. C).
6. Messen Sie die Absorption von 240 nm bis 950 nm mit Spektralphotometer (Cary 50, Varian Inc.), das Vorhandensein von ICG ist durch Unterschrift Absorptionspeaks etwa 700 nm und 790 nm ⁸ bestätigt. (Abb. D)
7. Die typischen ICG Fluoreszenzpeaks bei ~ 700 nm und ca. 800 nm auf 620 nm Anregung OVG Lösung (Bild D) unter Verwendung Spektrofluorometer (Fluorolog 3, Jobin Yvon-) gesehen werden.

Abbildung A. TEM-Aufnahme von negativ gefärbten BMV Virionen von N. gereinigt benthamiana agroinfiltrated mit einer Mischung aus allen drei Wildtyp BMV agroconstructs (Maßstab 100 nm).

Abbildung B Pellet von in vitro zusammengebaut ICG-haltigen OVGs nach Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation.

Abbildung C TEM-Aufnahme von negativ gefärbten ICG mit OVGs (Maßstab 100 nm).

Abbildung D. Absorption (oben) und Fluoreszenz (unten) Spektren von OVGs. Die Anregungswellenlänge für OVG Emission w verwendetals 620 nm.

Agroinfiltration hier vorgestellte Ansatz kann allgemein anwendbar auf eine Vielzahl von Pflanzenviren. Ein Erkennungsmerkmal dieses Ansatzes erfolgt die Lieferung mehrerer agroconstruct zu derselben Zelle ein großer Nachteil häufig mit routinemäßig zur mechanischen Inokulation von Pflanzenviren verbunden synchronisiert. In vivo und in vitro-Studien mit Montage Trespenmosaik-Virus als Modell effizient durch geführt werden folgenden einige Tipps. (i) Für die erfolgreiche Infiltration von N. benthamiana verlässt, nicht gießen für 24 Stunden vor der Infiltration, (ii) Agrobacterium-Suspension in Kultur würde intrazellulären Räume mit Leichtigkeit zu verbreiten, wenn die Infiltration zwischen 4-5 Uhr durchgeführt wurden, (iii) Die optische Dichte der Kultur nicht überschreiten 1,0 bei OD _600. Die Infiltration von agrocultures mit höherer Zelldichte ist bekannt, Zelltoxizität und Blattseneszenz ^9,10, die stark beeinflussen könnten virale Replikation und nachfolgende Virion induzierenBildung, (iv) Während der Infiltration leichtem Druck sollte auf der unterseitigen Seite des Blattes, um erhebliche Schäden an dem Blatt, die Immunantwort in Anlage auslösen könnten, zu verhindern angewendet werden, (v) Saccharose-Dichtegradienten von 10% bis 40% vorgenommen werden können, in einem Rohr, indem 25% der Saccharose in BMV Suspensionspuffer (indem die höchste Konzentration und niedrigsten Konzentration und durch 2 geteilt und das heißt, 10% + 40% / 2 = 25%) und sofort bei -80 ° C einfrieren für 2 -4 h und weiter Erlauben, das Sucrose-zu langsam aufgetaut, indem sie es über Nacht bei 4 ° C in einer geraden Position.

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Autoren bedanken sich bei mehreren Mitgliedern des Labors für ihre wertvollen Anregungen bedanken bei der Entwicklung von Agroinfiltration und In-vitro-Assays Montage. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der University of California finanziert. Diese Studie wurde in Teilen durch ein Stipendium der National Science Foundation (CBET-1144237) unterstützt.