Anotação da função do gene da planta através de Genômica combinados, metabolômica e Informática

Combinação de genômica, co-expressão de genes de análise e identificação de compostos-alvo através do metabolismo dar anotação gene funcional.

Dado o crescente número de espécies de plantas modelo para os quais seqüências genômicas completas estão disponíveis ea abundância de recursos biológicos, tais como mutantes knockout, adesões e as populações selvagens de criação avançados, há um crescente fardo para anotação gene funcional. Neste protocolo, a anotação da função planta gene através da análise combinada gene co-expressão, metabolômica e informática é fornecida (Figura 1). Esta abordagem é baseada na teoria da utilização de genes alvo de função conhecida para permitir a identificação de genes não-anotadas susceptível de ser envolvido num certo processo metabólico, com a identificação de compostos alvo através de metabolômica. Estratégias são propostas para aplicar essa informação sobre as populações geradas por ambas as abordagens direta e inversa genética, apesar de nenhum deles é fácil. Por corolário esta abordagem pode também ser usado como uma abordagem para caracterizar picos desconhecidos que representam si novo ou específicametabólitos condary nos tecidos limitados, espécies vegetais ou de tratamento de estresse, que é actualmente o julgamento importante para a compreensão do metabolismo da planta.

1. Preparação da Amostra

1. Materiais de plantas são colhidas e imediatamente congelados.
2. Materiais vegetais congelados são pulverizados por moinho misturador (ou argamassa) e armazenados em Falcon tubo ou tubo Eppendorf a -80 ° C.

2. Extração de perfil metabólico

1. Aliquota congelada material de planta em um tubo Eppendorf 2 ml.
2. Adicionar 5 uL de tampão de extracção por miligrama de peso fresco de material vegetal congelado.
3. Adicionar um metal (ou gilconia) bola e homogeneizar de pó congelado com o moinho oscilante durante 2 min a 25 ls ^{@ 1.}
4. Centrifugar 10 min a 12.000 rpm.
5. Transferir o sobrenadante para NANOSEP filtro centrífugo.
6. Centrifugar 2 min a 4.000 rpm.
7. Transferir o sobrenadante para novo tubo Eppendorf, e armazenar a -20 ° C até à utilização.

3. Perfil metabólico por LC-MS

1. Configure HPLC e verificar a temperatura do forno da coluna e bandeja de amostra.
2. Configure condição MS e verificar o estado de vácuo e aquecimento capilar.
3. Realizar m / z calibração do detector de MS.
4. Transferência de 50 uL de extractos de frasco de vidro para LC-MS.
5. Injectar 5 uL de extractos de LC-MS.

4. Análise de Dados

1. Configurar Xcalibur ou Metalign ⁴ e seleccionar a análise dos dados a serem processados.
2. Prepare uma tabela de picos detectados de seu interesse, de acordo com classe de compostos na Tabela I.
3. Identificar os picos por co-eluição de compostos padrão.
4. Anotar detectados picos usando MS análise ^2, pesquisa bibliográfica, pesquisa de banco de dados metabolito (Figura 2, ^12,13).

5. Previsão da via metabólica

1. Construir um caminho possível com compostos detectados. Predição da via usando anotações pico deve basear-se na estrutura química do composto detectados, prevendo ligando funções enzimáticas da via metabólica ^13. Etapas biossintéticas estruturantes devem ser conduzidas com anotação de pico precisa. Mas a determinação da estrutura química detalhada, por exemplo porção de açúcar, não é indispensável, neste passo, porque a predição de porção de açúcar e posição aduzido é muito difícil identificar por análise de MS. Determinação do tipo de açúcar, tais como hexoside e pentoside será identificada pelo ensaio enzimático de dador de açúcar no último passo de projecto. Principalmente construção de predição da via deve ser realizado como molécula pequena é intermediário de molécula maior, excepto nos casos alguns tais como reacção de desidratação. Lista de peso molecular atómica, por exemplo 16 m / z para diferença entre-H e-OH porção (oxidação), 14 m / z (átomo de carbono) para a diferença entre-OH e-OMe (metilação) e 162 m / z ( _MW-H2O) para hexose (glicosilação), é útil para a predição. Determinação dotipo de modificação com a análise de correlação de especificidades tecidos ajuda a previsão da via metabólica. Banco de dados da via metabólica geral, tais como KEGG banco de dados ( http://www.genome.jp/kegg/ ) e PlantCyc ( http://plantcyc.org/~~V ), é muito eficaz para a previsão de via metabólica de seu interesse.

6. Preparação da lista com Gene ID Gene Arabidopsis ortólogos

1. Baixe lista de identificação de genes de banco de dados genômicos.
2. Adicionar ID gene Arabidopsis do gene ortólogos, em caso de sua planta não é alvo de Arabidopsis.
3. Prepare uma lista de genes em seu caminho de interesse. Anotação de dados via Arabidopsis e dados da família de genes estão disponíveis no site TAIR ( http://www.arabidopsis.org/~~V ). Se você preparou uma lista de genes ortólogos de Arabidopsis, você pode, posteriormente, combine-los.

7. Co-expressa Análise Gene

1. Teste usando a lista de identificação de gene preparado para procurar o melhor banco de dados para o seu caminho, verificando a correlação usando pares de genes bem conhecidos em seu caminho de interesse (Quadro II). Se for co-expressão banco de dados ou a expressão do gene não estão disponíveis na planta de seu interesse, base de dados de co-expressão de Arabidopsis deve ser usado com uma lista de Arabidopsis genes ortólogos. No caso de cevada, arroz, choupo, trigo, Medicago e soja, a co-expressão de análise de espécies de plantas pode ser utilizado (Tabela II).
2. Construa o quadro para o seu destino de rede co-expressão com base nas conexões dos genes bem conhecidos em seu caminho de interesse.
3. Adicionar genes candidatos correlação (r <0,4 ~ 0,90, no valor aproximado de valor do coeficiente entre as conexões dos genes bem conhecidos em seu caminho de interesse) e verificar a sua anotação de genes em seu prfamílias edicted para as conexões desta rede para encontrar genes candidatos melhores (Figura 3). Limite de valor do coeficiente deve ser coordenada de acordo com a estrutura de rede e densidade de genes correlatos.
4. Faça lista de genes que você é capaz de diminuir como sendo especializado para o seu caminho de destino.
5. Verifique a expressão gênica das especificidades de órgãos e as respostas de estresse de seus genes candidatos.

8. Integração de todas as informações para prever Novos Caminhos

1. Adicionar genes bem caracterizados que têm sido utilizados para consulta de co-expressão de análise para predito via metabólica.
2. Verifique se as peças descaracterizados por essa via, por exemplo descaracterizados etapas enzimáticas, proteínas de transporte e fatores de transcrição.
3. Prever anotação gene mais adequado para estes passos em falta não caracterizadas.
4. Combinar os resultados de perfil metabólico e genes candidatos de in silico gene expressão com base no percurso previsto.
5. Dispor genes candidatos seus na via predito de acordo com a função do gene, por exemplo, acetiltransferase para acetilado metabolito, glicosiltransferase para glicósido, P450 para o composto oxidado. A análise filogenética árvore de sequências de aminoácidos é útil para alguns família de genes de largura, tais como citocromo P450 e glicosiltransferase.
6. Verifique a consistência das especificidades do tecido ou respostas de estresse entre acúmulo de metabólitos e níveis de expressão gênica de genes candidatos.
7. Verifique as conexões para o metabolismo outro para fornecer substrato e estresse genes responsivos.

9. Experimentos para identificação de genes usando Bio-recursos

1. Verifique a disponibilidade de recursos biológicos para a facilitação de experimento para identificação de genes candidatos.
2. Realizar um experimento para identificação da função do gene usando recursos biológicos, tais como KO biblioteca mutante e full-length biblioteca de cDNA. Tele experimentos para identificação funcional de genes com a preparação de plantas superexpressão e mutantes knockout, ensaio e ensaio enzimático promotor de ligação, tem que ser feita para os melhores genes candidatos na sua previsão. Ensaio de proteína recombinante para a caracterização das propriedades da proteína e preparação de plantas superexpressão melhor ser realizada após a confirmação do perfil dos metabolitos usando KO mutante uma vez que leva muito mais tempo para preparar a proteína recombinante e clonagem de genes para a transformação.

10. Os resultados representativos

O procedimento de análise integrada descrito neste protocolo tem muitas possibilidades, dependendo finalidade experimental especificado e escolha de combinações biológicas e analíticas. Escolha dos procedimentos e desenho experimental deve ser efectuada adequadamente na base da sua via de alvo, os compostos e as espécies de plantas. A estratégia de integração descritos neste protocolo é foc usado em anotação da função do gene vegetal ea descoberta de funções de genes novos com um uso eficiente de vários bio-e os dados de recursos. Resultado esperado é prometido para fornecer com o único caso de previsão conclusivo. Este facto indica que se evidências suficientes não pode ser dada por perfis de combinação, experiência não deve ser iniciado. Por esta razão, em qualquer dos casos, experiências preliminares adicionais tais como o perfil alvo expressão do gene por RT-PCR, pode suportar a sua previsão da função do gene. Precisão e exatidão da previsão correlaciona maior dependendo diferença qualitativa e número de variação de combinação. Além disso, bons candidatos e os resultados válidos só pode vir de previsão acurada das vias. Anotação de pico deve ser conduzida pela combinação de várias abordagens, por exemplo, levantamento da literatura, extrato vegetal de referência, a análise MS ^n, a especificidade do órgão e análise mutante ^13.

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Figura 1. Descrição geral do fluxo experimental de anotação gene através da abordagem combinada. Em alguns casos, os projectos começar com a descoberta de um novo pico o qual é detectado em condições especiais ou tecidos, eo desejo de compreender o seu papel no seu metabolismo. Em outros casos, o objetivo do projeto é a identificação de genes ou descoberta dos principais fatores de regulação, tais como fatores de transcrição. Concepção de experiência deve ser aplainada com um conjunto de dados que mostra diferenças claras de níveis de metabolitos no seu caminho alvo, utilizando uma grande variedade de amostras de tecido a partir de diferentes órgãos, e para as plantas cultivadas diferencialmente ou plantas expostas a condições de stress, e sujeitando o material para perfil metabólico. As plantas mutantes e transgénicos, bem como material de reprodução QTL guarida também representam o material genético apropriado para estes estudos. Previsão da nova via deve ser realizada com cuidado e com precisãoanotação de pico e aproximação da combinação com diferentes tipos de metabolotype como títulos de órgãos e as respostas de estresse de acordo com dados de expressão gênica do seu percurso de interesse. Na última etapa, o perfil metabolito e transcrição deve ser realizada que eventualmente, quando combinado com análise in silico de web-recursos e caracterização in vitro da expressão de genes através de expressão heteróloga, conduzir à confirmação do gene candidato e elucidação da sua função ea posição dentro de uma via metabólica. Abreviaturas: QTL, locos de características quantitativas.

Figura 2. Fluxo de trabalho do abordagem combinatória para a anotação de pico. Um procedimento para a identificação de pico e anotação pelo composto padrão, a comparação de tipo selvagem e mutantes knock out, multi-dimensional de espectrometria de massa do pico alvo referindo-se a espectros de massa de COM puroquilos a partir dos ¹² bancos de dados. Abreviaturas: DB, banco de dados; KO, knock-out; 1-D, unidimensional; 2-D, bidimensional, RMN, ressonância magnética nuclear; IR, infra-vermelho, MS ^n, a massa de massa spectrometries.

Figura 3. Exemplo de análise de rede de co-regulação da via antocianina. Análises foram realizadas utilizando a co-expressão do PRIME ( http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index ) com base nos dados constantes da versão 3 ATTEDII ^8,2 com a Pajek programa ( http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ). Correlações positivas (r <0,5) são usados ​​para fazer conexões de rede. Red nó: doze genes antocianinas enzimáticos (At5g13930, caps, TT4 chalcona sintase; At3g55120, CHI, TT5, chalcona isomerise; At3g51240, F3H, TT6, flavanona 3-hidroxilase; At5g07990, F3'H, TT7, flavonóides 3'-hidroxilase; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonóide 3 - O-glicosiltransferase; At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, diidroflavonol redutase; At4g22880, ANS / LDOX, TT18, Synthese anthocyanidin; At4g14090, A5GT, antocianinas 5 - O-glicosiltransferase; At5g54060, A3G2 "XT, antocianina putativo 3 - O glicosídeo-2" - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, antocianinas 5 - O glicosídeo-6'' '- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, antocianina 3 - O glicosídeo-6 "- O - p-coumaroyltransferase) e dois fatores de transcrição para a produção de antocianina (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) foi usado para procurar genes candidatos genes candidatos foram encontrados por uma "interseção de conjuntos de" pesquisa com um valor limiar, com um coeficiente de r <./ Em >> 0,50 consultado por interseção de conjuntos de todos os genes consultadas (Quatorze genes de biossíntese de antocianina). Uma rede de co-expressão, incluindo genes candidatos correlatas (68 genes) e genes consultados (14 genes), foi re-construída por uma "interligação de conjuntos de" pesquisa com r> 0,50 utilizando o banco de dados PRIME. Os arquivos de saída que foram formatados com um arquivo 'net'. Do banco de dados PRIME e redes foram desenhadas usando um software Pajek. Nó azul indica genes candidatos que se relacionaram com genes de antocianinas.

Tabela I. Os principais metabolitos secundários em espécies de plantas do modelo.

Tabela II. Banco de dados de expressão disponível gene para análise in silico co-expressão.

Dado que Transcritômica e tecnologias metabolómica têm sido utilizados desde há vários anos, o processo de integração de dados para metabolômica assistidas anotação gene geralmente começa com a identificação de um novo pico representando um metabolito desconhecido. Este facto leva a que a fase seguinte é o de avaliar a variância quantitativa em picos metabolito ou os genes candidatos a novos pensados ​​para ser responsável pela sua biossíntese. A estratégia descrita neste protocolo, no entanto, tem três grandes problemas i) dificuldade de anotação de pico, ii) a complexidade da previsão caminho, III), resolução de informação genética e qualidade de dados de expressão gênica. Para contrariar o primeiro problema, anotação pico deve ser realizado com a co-eluição de compostos-padrão ou de informação abordagem combinatória utilizando a partir do MS ^{N da} análise, o extracto de referência, a análise de mutante, a pesquisa do banco de dados metabolito e pesquisa da literatura (Figura 2, ^12). Para a second problema, a previsão de caminho só pode ser obtido pela anotação correta de pico. No entanto, o perfil de especificidade de tecido metabolito também pode ser anotação pico suporte, porque a acumulação metabolito devem ser correlacionados com as expressões de genes de genes relacionados. Portanto perfis de combinação de diferentes tecidos e condições de crescimento podem ser úteis para este segundo problema. O terceiro problema diz respeito à resolução de informação gene depende do progresso de dados de sequência. No caso da planta modelo sem conclusão da sequência do genoma, a co-expressão de análise usando genes ortólogos em plantas outro modelo é útil. Comparação alinhamento e análise detalhadas árvore filogenética da seqüência de aminoácidos pode suportar para se conectar organismos modelo para outras espécies.

Este protocolo é adequada para todos os metabolismos. É mais eficiente na análise de metabolismos intermediários e secundário, que estão bem caracterizados para ser sujeito a transcrição c forteONTROLO ^1,5,11,16. Em alguns exemplos, a co-expressão de análise conseguiu ser realizada na assimilação de enxofre, os genes para β-oxidação, de cadeia ramificada degradação do ácido amino, repartição de clorofila, eo catabolismo da lisina ^3, o metabolismo da parede celular ^10,7 e luz cascata de sinalização ^14. Anotação da função dos genes através de genômica combinados, metabolômica e informática não é apenas para o gene biossintético e regulador direto de fator de transcrição, mas também para compreender o processo fisiológico e resposta (ver Figura exemplo 3. ^14).

Para desenvolver essa abordagem a partir de plantas modelo para as espécies cultivadas, a comparação metabólico de diferentes espécies vegetais é poderosa abordagem em alguns metabolismos gerais. Por exemplo, se mesmo composto é detectada em diferentes espécies de plantas, e alguns genes ortólogos são encontrados nestas espécies de plantas, entre espécies análise de co-expressão usando ortólogos genes pode fornecer strong suporte para sua previsão. Esta abordagem pode ser realizada em Arabidopsis, choupo, Medicago, além culturas importantes, tais como a cevada, arroz, trigo e soja, por co-expressão de análise de espécies de plantas ^(6, PlaNet: http://aranet.mpimp-golm.mpg . de / ,; ^9, COP: http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/ ; ver um exemplo, ^15).

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecemos ao Prof Kazuki Saito em RIKEN PSC e Bjoern Dr. Usadel em MPIMP para discussões úteis. TT é apoiado por uma bolsa da Fundação Alexander von Humboldt.