شرح وظيفة الجينات النباتية عن طريق الجينوم المشترك، الايض والمعلوماتية

مزيج من الجينوم، وشارك في تحليل التعبير الجيني، وتحديد الهدف من المركبات عن طريق عملية التمثيل الغذائي إعطاء الشرح الجينات الوظيفية.

بالنظر إلى العدد المتزايد من أي وقت مضى من الأنواع النباتية نموذج لتسلسل الجينوم الكامل الذي تتوفر ووفرة الموارد الحيوية مثل المسوخ خروج المغلوب، الانضمامات البرية والسكان التربية المتقدمة، هناك عبء المتزايد على الشرح الجينات الوظيفية. في هذا البروتوكول، وشرح وظيفة الجينات النباتية باستخدام مجتمعة تحليل الجينات المشاركة في التعبير، وتقدم الايض والمعلوماتية (الشكل 1). ويستند هذا النهج على نظرية باستخدام الجينات المستهدفة من وظيفة معروفة للسماح بتحديد غير مشروحة الجينات التي يحتمل أن تشارك في عملية التمثيل الغذائي معينة، مع تحديد الهدف من المركبات عن طريق الايض. ووضع الاستراتيجيات إلى الأمام لتطبيق هذه المعلومات على السكان الناتجة عن كلا النهجين علم الوراثة الى الامام وعكس على الرغم من أن أيا من هذه هي مجهود. ويمكن بواسطة هذا النهج أيضا نتيجة طبيعية يمكن استخدامها كمدخل لوصف القمم غير معروف حد ذاته يمثل جديدة أو محددةcondary الأيضات في الأنسجة محدودة، والأنواع النباتية أو معالجة التوتر، والذي هو حاليا محاكمة هامة لفهم عملية التمثيل الغذائي النباتي.

1. عينة تحضير

1. ويتم حصاد المواد النباتية وتجميدها على الفور.
2. ومسحوقة المواد النباتية المجمدة بواسطة طاحونة خلاط (أو هاون) وتخزينها في أنبوب الصقر أو أنبوب إيبندورف في -80 درجة مئوية.

2. استخراج لتحديد ملامح الأيضة

1. قسامة تجميد المواد النباتية في أنبوب 2 إيبندورف مل.
2. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة استخلاص لكل مليغرام من الوزن الرطب من المواد النباتية المجمدة.
3. إضافة واحد المعدنية (أو gilconia) الكرة والتجانس من مسحوق المجمدة مع مطحنة الخلاط لمدة 2 دقيقة عند 25 ليرة سورية ^-1.
4. منبذة 10 دقيقة في 12000 دورة في الدقيقة.
5. نقل وطاف على NANOSEP فلتر الطرد المركزي.
6. منبذة 2 دقيقة في 4000 دورة في الدقيقة.
7. نقل وطاف على أنبوب إيبندورف جديدة، ومخزن في -20 درجة مئوية حتى استخدامها.

3. المستقلب التنميط بواسطة LC-MS

1. إعداد HPLC والتحقق من درجة حرارة الفرن العمود وصينية عينة.
2. إعداد MS حالة والتحقق من حالة الفراغ والتدفئة الشعرية.
3. نفذ م / ض معايرة للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد.
4. نقل 50 ميكرولتر من مقتطفات لقنينة زجاجية للLC-MS.
5. حقن 5 ميكرولتر من مقتطفات لLC-MS.

4. تحليل البيانات

1. تكوين Xcalibur أو Metalign ⁴ وتحديد وتحليل البيانات التي سيتم تجهيزها.
2. إعداد جدول القمم الكشف عن الاهتمام الخاص وفقا للفئة مركب في الجدول الأول.
3. تحديد قمم بواسطة شطف المشترك للمركبات القياسية.
4. الكشف عن تعليم قمم باستخدام MS ² تحليل، دراسة الأدب، والمستقلب البحث في قاعدة البيانات (الشكل 2، ^12،13).

5. التنبؤ المسار الأيضي

1. بناء مسارا محتملا مع الكشف عن المركبات. وينبغي أن يستند التنبؤ طريق استخدام شروح الذروة في التركيب الكيميائي لمركب الكشفق من خلال التنبؤ ربط الوظائف الأنزيمية على المسار الأيضي ^13. وينبغي إجراء خطوات السكروز هيكلة مع الشرح ذروة دقيقة. لكن تقرير مفصل من التركيب الكيميائي، لشاردة السكر سبيل المثال، لا غنى عنها في هذه الخطوة، لأنه التنبؤ شاردة السكر وموقف adducted من الصعب جدا التعرف عن طريق تحليل MS. وسيتم تحديد تحديد نوع السكر مثل hexoside وبنتوزيد بواسطة فحص الأنزيمية من الجهات المانحة السكر في الخطوة الأخيرة من المشروع. يجب أن يتم تنفيذ بناء معظمها من التنبؤ المسار كما هو جزيء صغير وسيطة من أكبر جزيء ما عدا في بعض الحالات مثل رد فعل الجفاف. قائمة من الوزن الجزيئي الذري، على سبيل المثال 16 م / ض عن الفرق بين-H-OH وشاردة (الأكسدة)، و 14 م / ض (ذرة كربون) للفرق بين-OH-وأومه (تيكو) و 162 م / ض ( MW-H ₂ O) لهيكسوز (ارتباط بالغليكوزيل)، مفيد للتنبؤ. تقرير مننوع التعديل مع تحليل الارتباط من خصوصيات الأنسجة ويساعد التنبؤ المسار الأيضي. قاعدة البيانات من المسار الأيضي العامة مثل قاعدة البيانات KEGG ( http://www.genome.jp/kegg/ ) وPlantCyc ( http://plantcyc.org/~~V )، هي فعالة جدا للتنبؤ المسار الأيضي من اهتمامك.

6. إعداد قائمة جين مع Arabidopsis معرف جين Orthologous

1. تحميل الجين قائمة معرف من قاعدة بيانات الجينوم.
2. إضافة Arabidopsis معرف جينة من الجينات orthologous، في حالة وجود مصنع تستهدفها ليس Arabidopsis.
3. إعداد قائمة من الجينات في المسار الخاص بك من الفائدة، من. حاشية من البيانات والبيانات مسار Arabidopsis أسرة جين متوفرة في موقع طير ( http://www.arabidopsis.org/~~V ). إذا كنت أعد قائمة من الجينات orthologous Arabidopsis، يمكنك نقل الركاب والحمولات في وقت لاحقNE لهم.

7. شارك في تحليل وأعرب جين

1. اختبار باستخدام معرف الجينات أعدت قائمة للبحث أفضل قاعدة بيانات للمسار الخاص بك عن طريق التحقق من ارتباط باستخدام أزواج الجينات المعروفة في المسار الخاص بك من الفائدة، من (الجدول الثاني). إذا شاركت في التعبير عن قاعدة البيانات أو قاعدة بيانات الجينات التعبير لا تتوفر في المصنع من اهتمامك، ينبغي استخدام Arabidopsis شارك في التعبير عن قاعدة بيانات مع قائمة من الجينات orthologous Arabidopsis. في حالة من الشعير، ويمكن استخدام الأرز والحور، والقمح، وفول الصويا medicago، وشارك في تحليل التعبير من أنواع النباتات (الجدول الثاني).
2. بناء إطار لشبكة زملائك في التعبير الهدف بناء على اتصالات من الجينات المعروفة في المسار الخاص بك من الفائدة، من.
3. إضافة الجينات مرشح مترابطة (ص <0.4 ~ 0.90، ضمن القيمة التقريبية لقيمة معامل بين الاتصالات من الجينات المعروفة في المسار الخاص بك من الفائدة، من) والتحقق من الشرح على الجينات في العلاقات العامة الخاصة بكedicted الأسر على الاتصالات لهذه الشبكة للعثور على جينات أفضل مرشح (الشكل 3). وينبغي تنسيق عتبة قيمة معامل وفقا لهيكل الشبكة وكثافة من الجينات المترابطة.
4. جعل قائمة من الجينات التي كنت قادرا على تضييق باعتبارها متخصصة للمسار التي تستهدفها.
5. فحص الجينات من خصوصيات الجهاز واستجابات التوتر من الجينات المرشحة لديك.

8. تكامل جميع المعلومات إلى توقع سبلا جديدة

1. إضافة جينات جيدا اتسم التي كانت تستخدم للاستعلام من المشاركة في التعبير عن تحليل وتوقع على المسار الأيضي.
2. فحص أجزاء uncharacterized في هذا المسار، على سبيل المثال uncharacterized خطوات الأنزيمية، والبروتينات والنقل وعوامل النسخ.
3. توقع أنسب الشرح الجيني لهذه الخطوات المفقودة uncharacterized.
4. جمع نتائج المستقلب التنميط والجينات مرشح من شركة جنرال الكتريك في السيليكوالتعبير شمال شرق استنادا إلى المسار المتوقع.
5. ترتيب الجينات مرشح الخاص بك على المسار المتوقع وفقا لوظيفة الجينات، وعلى سبيل المثال، للأسيتيل الأسيتيل ناقلة الغليكوزيل، المستقلب لغليكوزيدات، P450 لمجمع المؤكسدة. تحليل شجرة النشوء والتطور من سلاسل من الأحماض الأمينية مفيد لبعض أسرة جين واسعة مثل P450 و ناقلة الغليكوزيل.
6. تحقق من التناسق خصوصيات الأنسجة أو استجابات التوتر بين تراكم المستقلب والجينات مستوى التعبير عن الجينات مرشح.
7. تحقق من وصلات إلى عملية التمثيل الغذائي الأخرى لتوفير الركيزة والاجهاد استجابة الجينات.

9. التجارب لتحديد الجينات باستخدام الموارد البيولوجية

1. التحقق من توافر الموارد الحيوية للتيسير على تجربة لتحديد الجينات مرشح.
2. إجراء تجربة لتحديد وظيفة الجينات باستخدام الموارد الحيوية، مثل مكتبة متحولة KO وكامل طول مكتبة [كدنا]. تيانه التجارب لتحديد الجينات الوظيفية مع إعداد النباتات overexpression والمسوخ خروج المغلوب، فحص الأنزيمية وفحص المروج ملزم، يجب أن يتم لجينات أفضل مرشح في التنبؤ الخاص بك. المؤتلف فحص بروتين لتوصيف خصائص البروتين وإعداد أفضل للنباتات overexpression التي ستنفذ بعد التأكد من الملف المستقلب باستخدام KO متحولة لأنه يأخذ وقتا أطول بكثير لإعداد بروتين المؤتلف والاستنساخ الجيني للتحول.

10. ممثل النتائج

إجراء تحليل متكامل المبينة في هذا البروتوكول لديه احتمالات كثيرة تبعا لغرض محدد التجريبية واختيار التركيبات البيولوجية والتحليلية. يجب أن يتم الاختيار من الإجراءات وتصميم تجريبية بشكل صحيح على أساس المسار تستهدفها، والمركبات والأنواع النباتية. استراتيجية التكامل وصفها في هذا البروتوكول هو FOC المستخدمة في الشرح من وظيفة الجينات النباتية واكتشاف وظائف الجينات رواية مع الاستخدام الفعال لعدة الحيوي والموارد البيانات. ووعد النتيجة المتوقعة لتقديم مع الحالة الوحيدة للتنبؤ قاطع. هذه الحقيقة تشير إلى أنه إذا كان لا يمكن أن الأدلة ما يكفي أن تعطى من قبل مجموعة ملامح، لا ينبغي أن تبدأ التجربة. لهذا السبب، في أي الحالات، يمكن أن التجارب الأولية إضافية مثل استهداف الجينات التنميط التعبير بواسطة RT-PCR، دعم التنبؤ الخاص بك من وظيفة الجين. دقة وصحة التنبؤ يرتبط أعلى اعتمادا على اختلاف نوعية وعدد من اختلاف التركيبة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرشحين ونتائج جيدة صالحة يأتي إلا من التنبؤ الدقيق لمسارات. وينبغي إجراء الشرح الذروة من قبل مجموعة من النهج عدة، لدراسة الأدب سبيل المثال، مرجع مستخلصات نباتية، MS تحليل ^ن، والنوعية وتحليل الجهاز متحولة ^13.

(1) "SRC =" / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg "/>
الشكل 1. نظرة عامة على تدفق التجريبية من الشرح الجينات عبر نهج موحد. وفي بعض الحالات، والمشاريع تبدأ مع اكتشاف ذروة الرواية التي تم الكشف عنها في ظروف خاصة أو الأنسجة، والرغبة في فهم دورها في عملية التمثيل الغذائي لها. في حالات أخرى والغرض من هذا المشروع هو تحديد الجينات أو اكتشاف العوامل التنظيمية الرئيسية مثل عوامل النسخ. وينبغي تصميم مسطح من التجربة مع مجموعة من البيانات التي تظهر اختلافات واضحة في مستويات الأيض في المسار تستهدفها، وذلك باستخدام مجموعة واسعة من عينات الأنسجة من الأجهزة المختلفة، والنباتات التي تزرع بشكل مختلف أو النباتات المعرضة لظروف الإجهاد، وإخضاع هذه المواد إلى المستقلب التنميط. النباتات المعدلة وراثيا ومتحولة وكذلك QTL مواد التربية إيواء تمثل أيضا مادة وراثية مناسبة لهذه الدراسات. يجب أن يتم تنفيذ التنبؤ مسار الرواية بعناية مع دقيققمة الشرح والنهج بالاشتراك مع نوع مختلف من metabolotype مثل الأوراق المالية الأعضاء واستجابات التوتر وفقا لبيانات التعبير الجيني الخاص بك مسار المصلحة، من. في الخطوة الأخيرة، يجب إجراء التنميط المستقلب والذي نص في نهاية المطاف، وعندما يقترن في silico من على شبكة الانترنت لتحليل الموارد وتوصيف في المختبر في التعبير الجيني عن طريق تعبير مغايرة، تؤدي إلى تأكيد مرشح الجينات وتوضيح وظيفتها والموقف داخل المسار الأيضي. الاختصارات: QTL، الامكنه سمة الكمي.

الشكل 2. تدفق العمل من نهج التوافقية لشرح الذروة. هناك إجراءات لتحديد الذروة والشرح من قبل المجمع القياسية، والمقارنة بين نوع البرية وضرب المسوخ، متعددة الأبعاد قياس الطيف الكتلي للقمة في اشارة الى الهدف الأطياف كتلة COM نقيجنيه من قواعد البيانات ^12. الاختصارات: DB، قاعدة البيانات؛ KO، بالضربة القاضية، 1-D، أحادية البعد، 2-D، ثنائي الأبعاد، الرنين المغناطيسي، الرنين المغناطيسي النووي، الأشعة تحت الحمراء، الأشعة تحت الحمراء، والسيدة ^ن، كتلة الكتلة spectrometries.

الشكل 3. تم إجراء تحليل سبيل المثال شبكة شارك في تنظيم المسار الأنثوسيانين. تحليلات Coexpression باستخدام الوزراء ( http://prime.psc.riken.jp/؟action=coexpression_index ) استنادا إلى مجموعة البيانات من النسخة ATTEDII 3 ^8،2 مع Pajek برنامج ( http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ). وتستخدم الارتباطات الإيجابية (ص <0.5) لإجراء اتصالات الشبكة. العقدة الحمراء: الجينات الأنثوسيانين 12 الأنزيمية (At5g13930، CHS، TT4، كالكون سينسيز؛ At3g55120، Cمرحبا، TT5، كالكون isomerise؛ At3g51240، F3H، TT6، فلافانون 3-هيدروكسيلاز؛ At5g07990، F3'H، TT7، الفلافونويد 3'-هيدروكسيلاز؛ At5g17050، Fd3GT، UGT78D2، الفلافونويد 3 - O-ناقلة الغلوكوزيل؛ At5g17220، AtGSTF12، TT19 ؛ At5g42800، DFR، TT3، dihydroflavonol اختزال؛ At4g22880، ANS / LDOX، TT18، synthese أنثوسيانيدين؛ At4g14090، A5GT، الأنثوسيانين 5 - O-ناقلة الغلوكوزيل؛ At5g54060، A3G2 "XT، الأنثوسيانين المفترضة 3 - O-غلوكوزيد 2" - O - xylosyltransferase؛ At3g29590، A5GMaT، الأنثوسيانين 5 - O-غلوكوزيد 6'' '- O-malonyltransferase؛ At1g03940، A3GCouT، الأنثوسيانين 3 - O-غلوكوزيد 6 "- O - P-coumaroyltransferase)، وعوامل النسخ اثنان لإنتاج الأنثوسيانين (At1g56650، وقد استخدم At1g66390، PAP2) للبحث عن الجينات مرشح تم العثور على جينات المرشح من قبل "تقاطع مجموعات" بحث مع قيمة عتبة مع معامل ص <؛ PAP1./ >> م 0.50 الاستعلام بواسطة تقاطع مجموعات من قبل جميع الجينات وتساءل (أربعة عشر جينات السكروز الأنثوسيانين). وكان شارك في شبكة التعبير، بما في ذلك الجينات مرشح مترابطة (68 الجينات) والجينات وتساءل (14 الجينات)، وإعادة بناء من قبل "الربط بين مجموعات" بحث مع آر> 0،50 باستخدام قاعدة بيانات الوزراء. ووضعت ملفات الإخراج التي تم تنسيقها مع ملف '. صافي من قاعدة بيانات رئيس مجلس الوزراء والشبكات باستخدام البرمجيات Pajek. العقدة الزرقاء تشير إلى الجينات التي ترتبط مع مرشح الجينات الأنثوسيانين.

الجدول أولا المركبات الثانوية الرئيسية في الأنواع النباتية نموذج.

الجدول الثاني. متاح قاعدة بيانات التعبير الجيني للتحليل في المشاركة في التعبير السيليكو.

نظرا إلى أن استخدمت transcriptomics والتكنولوجيات الايض لعدة سنوات، وعملية تكامل البيانات عن الايض ساعد الشرح الجين يبدأ عادة مع تحديد ذروة الرواية يمثل مستقلب غير معروف. هذا الواقع يؤدي الى المرحلة التالية التي هي لتقييم فرق كمي في قمم المستقلب أو الجينات مرشح رواية يعتقد أنها المسؤولة عن التركيب الحيوي لها. الاستراتيجية المبينة في هذا البروتوكول، ومع ذلك، يواجه ثلاث مشاكل رئيسية ط) صعوبة الشرح الذروة، والثاني) تعقد تنبؤ مسار، ثالثا) من قرار المعلومات الجينية ونوعية البيانات التعبير الجيني. لمواجهة المشكلة الأولى، ينبغي أن يتم الشرح خارج الذروة مع شطف المشترك للمركبات معيار أو اندماجي معلومات نهج الاستفادة من MS ^ن التحليل، وانتزاع المرجعية، تحليل متحولة، المستقلب بحث قاعدة البيانات ودراسة الأدب (الشكل 2، ^12). لقمشكلة econd، لا يمكن التنبؤ مسار يمكن الحصول عليها عن طريق الشرح ذروة الصحيح. ومع ذلك، التنميط المستقلب من خصوصية نسيج يمكن أن يكون أيضا دعما الشرح الذروة، لأنه يجب ارتباطا تراكم المستقلب مع تعبيرات جين من الجينات ذات الصلة. ولذلك يمكن تعريف مجموعة من الأنسجة المختلفة وظروف نمو يكون من المفيد لهذه المشكلة الثانية. المشكلة الثالثة تتعلق قرار من معلومات الجينات تتوقف عن التقدم المحرز في تسلسل البيانات. في حالة النبات نموذج دون الانتهاء من تسلسل الجينوم، وشارك في تحليل التعبير باستخدام جينات النباتات orthologous في نموذج آخر مفيد. ويمكن مقارنة مفصلة المحاذاة والنشوء والتطور تحليل شجرة تسلسل الأحماض الأمينية دعم لربط الكائنات نموذج للأنواع الأخرى.

هذا البروتوكول هو مناسبة لجميع الأيض. هو الأكثر فعالية في تحليل الأيض المتوسطة والثانوية التي تتميز بشكل جيد لتكون خاضعة لج النسخي قويontrol ^{1،5،11،16.} في بعض الأمثلة، وشارك في تحليل التعبير نجحت التي يتعين القيام بها في استيعاب الكبريت، وجينات أكسدة، β، تشعب سلسلة تدهور الأحماض الأمينية، وانهيار الكلوروفيل، وهدم ليسين ^3، جدار الخلية والتمثيل الغذائي ^10،7 ضوء يشير تتالي ^14. شرح وظيفة الجينة عبر الجينوم المشترك، والايض المعلوماتية ليست فقط لجينة السكروز والمنظم المباشر للعامل النسخ ولكن أيضا لفهم عملية الفسيولوجية والاستجابة (انظر الشكل المثال 3. ^14).

لتطوير هذا النهج من محطات نموذجية لأنواع المحاصيل، مقارنة التمثيل الغذائي عبر الأنواع النباتية هي طريقة فعالة في بعض الأيض العام. على سبيل المثال، إذا تم الكشف عن المركب نفسه في نوع من النباتات المختلفة، وتوجد بعض الجينات orthologous في هذه الأنواع النباتية، ويمكن عبر الأنواع شارك في التعبير التحليل باستخدام الجينات orthologous توفير stronز الدعم للتنبؤ بك. لا يمكن أن يؤديها هذا النهج في Arabidopsis، الحور، medicago، بالإضافة المحاصيل الهامة مثل، الشعير القمح والأرز وفول الصويا، التي شاركت في التعبير عن تحليل أنواع النباتات ^(6، الكوكب: http://aranet.mpimp-golm.mpg . دي / ، و ^9، ومؤتمر الأطراف: http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/ ، وانظر على سبيل المثال، ^15).

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نشكر الأستاذ كازوكي سايتو في PSC بتبريد والدكتور بيورن Usadel في MPIMP لإجراء مناقشات مفيدة. ويدعم TT بواسطة زمالة من مؤسسة الكسندر فون همبولت.