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* Estes autores contribuíram igualmente
Nós descrevemos um protocolo que permite imagens de mitocôndrias na vida neurônios através de microscopia de fluorescência durante muito tempo. Imagem por longos períodos é realizado através de lentivírus mediada expressão de uma proteína fluorescente mitochondrially alvo e uso de uma infra-top estágio incubadora que foi projetada e construída em nosso laboratório.
Para entender a relação entre o transporte mitocondrial e função neuronal, é fundamental observar o comportamento mitocondrial em viver neurônios cultivados por longos períodos 1-3. Isto é agora possível através do uso de corantes vitais e proteínas fluorescentes com que os componentes do citoesqueleto, organelas, e outras estruturas em células vivas podem ser rotulados e então visualizados através de microscopia de fluorescência dinâmica. Por exemplo, nos neurônios de frango embrionárias Simpático, movimento mitocondrial foi caracterizada utilizando o corante vital rodamina 123 4. Em outro estudo, as mitocôndrias foram visualizados nos neurônios do prosencéfalo rato por transfecção de eYFP mitochondrially alvo 5. No entanto, imaging de neurônios primários ao longo de minutos, horas ou mesmo dias apresenta uma série de questões. Lugar entre estes estão: 1) manutenção das condições de cultivo, como temperatura, umidade e pH durante as sessões de imagem longa, 2) um forte sinal estável fluorescentes para garantir a qualidade das imagens adquiridas e medição precisa da intensidade do sinal durante a análise de imagem; e 3) limitar tempos de exposição durante a aquisição de imagens para minimizar e evitar fotobranqueamento fototoxicidade.
Aqui, nós descrevemos um protocolo que permite a observação, visualização e análise do movimento mitocondrial em culturas de neurônios do hipocampo com alta resolução temporal e sob condições de apoio ótima vida. Temos construído um preço acessível estágio-top incubadora que fornece boa regulação da temperatura e fluxo de gás na atmosfera, e também limita o grau de evaporação media, assegurando pH estável e osmolaridade. Esta incubadora é conectado, via de entrada e saída de mangueiras, com um padrão de cultura de tecidos da incubadora, que oferece níveis de umidade constante e uma atmosfera de CO% 05-10 fevereiro de ar /. Este projeto oferece uma alternativa de baixo custo para incubadoras microscópio significativamente mais caros que não necessariamente garantem a viabilidade das células durante muitas horas ou mesmo dias. Para visualizar as mitocôndrias, que infectar as células com um lentivírus que codifica uma proteína fluorescente vermelha que é direcionado para a mitocôndria. Isso garante um sinal forte e persistente, que, em conjunto com o uso de uma fonte estável de luz xenon, que nos permite limitar tempos de exposição durante a aquisição de imagem e tudo, mas impede fotobranqueamento e fototoxicidade. Duas portas de injeção na parte superior da incubadora estágio-top permitir que a administração aguda de neurotransmissores e outros reagentes destinados para modular o movimento mitocondrial. Na expressão de soma, mediada por lentivírus de uma organela-alvo a proteína fluorescente vermelha ea combinação de nosso palco-top incubadora, um microscópio invertido de fluorescência convencional, câmera CCD, e fonte de luz xenon nos permitem adquirir imagens de lapso de tempo de transporte mitocondrial em neurônios vivos mais durações mais longas do que as possíveis em estudos a implantação convencional corantes vitais e off-the-shelf sistemas de suporte de vida.
1. Descrição do Lab-built Stage-top Incubadora
Manter as células vivas em um estágio do microscópio por longos períodos oferece três grandes desafios: 1) controle de temperatura do ambiente ea regulação; 2) controle de umidade, ou seja, manter a umidade da atmosfera ambiente, e 3) manutenção do pH adequado no meio de cultura. Estas questões "suporte de vida" são essenciais para experimentos envolvendo a observação a longo prazo de neurônios cultivados, células que são particularmente sensíveis às mudanças de temperatura e pH. A seguir, descrevemos um simples laboratório construído estágio-top incubadora que nós concebidos e construídos para imagens ao vivo dos neurônios mais longos períodos. Esta incubadora é ligada, através de um circuito fechado, a um padrão de cultura de tecidos incubadora (Thermo Scientific, Asheville, Carolina do Norte), que fornece um estábulo aquecida (37 ° C), atmosfera úmida de CO 10% de ar 2 / 90%.
2. Preparação de culturas primárias Hippocampal
Todo o trabalho é realizado tanto em capela de fluxo laminar ou um BSL2 em uma bancada de fluxo laminar. Primária os neurônios do hipocampo estão isolados do E18 embriões de ratos de acordo com procedimentos padrão 6-7, e são cultivadas em meio livre de soro que tem sido condicionada pela principal astrócitos corticais. Células gliais são preparados de acordo com métodos publicados 7. O meio condicionado consiste em baixa de glicose DMEM, suplementado com prolina (1,76 ug / ml), asparagina (0,83 ug / ml), vitamina B12 (0,34 ug / ml), glicose (20mM), rica em lipídios BSA (0,5 mg / ml ) e 2% do B27 8-10. Não antibióticos são adicionados ao meio como eles podem interferir com a transcrição do gene neuronal.
3. Preparação de proteína recombinante Lentivirus Encoding Red Fluorescent
Para os investigadores que não têm acesso às instalações para a produção de lentivírus recombinante, produção sob encomenda por uma entidade comercial por exemplo, Sistema de Biociências (Mountain View, CA) é uma opção.
A mitochondrially-alvo gene da proteína fluorescente vermelha (MitoTurboRFP; Axxora LLC, San Diego, CA) é inserido em uma auto-inativação do vírus da imunodeficiência felina recombinante sob o controle transcricional do enhancer do gene promotor citomegalovírus principais imediato início de 11. Lentivírus recombinantes são produzidos por transitoriamente transfecting células 293T.
4. Infecção de neurônios cultivados
Culturas de neurônios do hipocampo estão infectados em 14 dias in vitro simplesmente adicionando a quantidade de vírus para infectar estimada em até 50% de todos os neurônios com base em dados de citometria de fluxo. Não polibrene é usado. Culturas são mantidas por 3 dias antes de verificar a expressão da proteína fluorescente. Se o sinal é muito fraco, então, a cultura é devolvido à cultura de tecidos incubadora e retestados após vários dias.
5. Manutenção geral do Sistema de Suporte Closed Circuit Vida
6. Aplicação da tampa de membrana para GBM e Colocação em Estágio-top Incubadora
7. Aquisição de imagem
Note-se que a maioria das plataformas de software disponíveis de imagem têm funcionalidade comparável em uma ampla gama de microscópios e hardware relacionados. Uma variedade de aquisição de imagem e plataformas de software de análise estão disponíveis, incluindo Metamorph e programas concebidos para marcas específicas de microscópio, como Leica Application Suite, da Nikon NIS Elements, e AxioVision Carl Zeiss. Neste protocolo, descrevemos a aquisição de imagem e procedimentos de análise foi realizada utilizando Slidebook 5 (Intelligent imagem Innovations, Denver, CO). No entanto, as etapas constituintes de cada operação descrita no presente protocolo pode ser facilmente adaptado para o uso de uma variedade de outros programas.
Descrição do microscópio de fluorescência invertido, configurações de filtro, câmera CCD, fonte de luz xenon, e software de imagem:
Para imagens dinâmicas de transporte mitocondrial em neurônios do hipocampo, usamos uma Leica DMI-6000B microscópio invertido de fluorescência e Modelo 11-522-068 estágio motorizado (Leica Microsystems GmbH CMS, Wetzlar, Alemanha) equipado com um Sensicam Cooke EQ câmera CCD (A Cooke Corporation, Romulus, MI), um Sutter Lambda 02/10 roda de filtros e controlador (Sutter Instrument Company, Novato, CA), e um Sutter DG-4 300W fonte de luz xenon. Para visualizar as mitocôndrias rotulados com a proteína fluorescente vermelha MitoTurbo, usamos a combinação de um filtro de 555nm na fonte DG-4 luz para excitação e filtros de 600nm (pico; Sedat Quad Modelo refletores 86100bs montado Leica DM cubo filtro de série, tecnologia Chroma Corp, Bellows Falls, VT) e 617nm no microscópio e roda de filtros, respectivamente, para a emissão.
Para aquisição e análise de imagem, usamos o microscópio digital de pacote de software de imagem Slidebook 5. Este é um pacote abrangente que permite o controle totalmente automatizado do microscópio, palco, roda de filtros, câmera e fonte de luz durante a aquisição de imagem, bem como uma variedade de módulos de processamento de imagem e análise.
Abaixo, fornecemos específico, passo-a-passo para a aquisição de imagens de lapso de tempo de mitocôndrias movendo-se em neurônios fluorescentes rotulados com Slidebook 5.
8. Análise de Imagem
9. Resultados representante
Pelo monitoramento e análise de movimento mitocondrial em culturas de neurônios do hipocampo, temos demonstrado uma ligação entre o tráfico de neuromodulação e mitocondrial. Especificamente, nós descobrimos que a serotonina (5-HT) ou o agonista do receptor 5-HT1A, 8-OH-DPAT, estimula o movimento mitocondrial (Figura 2A-C) 8, enquanto que a dopamina (DA) ou do agonista do receptor D2, a bromocriptina, inibe mitocondrial movimento (Figura 2D-G) 9.
Figura 1. Concepção de sistema fechado de circuito fase-top incubadora Os seguintes componentes do sistema de incubadora são mostrados: resistente ao calor invólucro de plástico delrin (A); abertura retangular de policarbonato janela de plástico (B); base de alumínio da incubadora (C); buracos. a aceitar postes de aço de base (D); buraco de diâmetro 35,1 milímetros com lábio recessed fina no centro de incubadora de base para acomodar pratos GBM 35mm (E); mangueiras Nalgene (conexões entre cultura de tecidos e estágio-top incubadoras; armadilhas umidade) ( F, G, N); cultura de tecidos incubadora (H); aquário bomba (I); hermética caixa de plástico ABS (habitação para bomba de aquário) (J); Erlenmeyer 2000ml (silenciador para a supressão de vibração na mangueira antes da fase-top incubadora) (K); invólucro plástico para ventilador de arrefecimento (L); armação de plástico para 35mm tampa GBM (M); posição de torneiras de plástico (O). Localização dos portos para a administração dos reagentes são indicados por setas amarelas em (II).
Figura 2. Resultados representativos: a regulamentação do transporte mitocondrial A.. Axônio de um neurônio de rato típico do hipocampo em cultura. Mitocôndrias rotulados com uma proteína fluorescente lentivírus-codificados são mostrados em verde; axônios immunolabeled com neurofilamento fosfo-anticorpos são mostrados em vermelho. Extensão do axônio é indicado por setas amarelas. Imagem é composta de quatro micrografias sobrepostas. B. Exemplo de uma série de imagens de lapso de tempo que mostre alterações no movimento mitocondrial após a administração de 5-HT. Imagens foram adquiridas através de um microscópio invertido de fluorescência e armazenadas como seqüências que foram posteriormente convertidos em filmes Quicktime. Uma seqüência de imagens representativas mostras individuais mitocôndrias em diferentes momentos antes (painel esquerdo) e administração (painel direito) após de 8-OH-DPAT, um agonista do receptor 5-HT1A. Retângulo vertical vermelha destaca uma mitocôndria estacionária (esquerda) e uma mitocôndria oscilatório (direita) ao longo de vários pontos do tempo. A mitocôndria oscilatório indicado (painel esquerdo) está se movendo em direção ao terminal axonal após o tratamento com 8-OH-DPAT (painel direito; vermelho com borda setas brancas). A linha vertical amarela (painel direito) indica a posição inicial da mitocôndria em movimento. Intervalos de tempo são mostradas no canto inferior do lado direito de cada frame. Ampliação (63 ×) é indicado no canto inferior direito do painel direito. C, Lotes D. mostre alterações no movimento mitocondrial após a administração de 5-HT. Mudanças no movimento mitocondrial antes (C) e depois (D) administração de 5-HT são apresentados como parcelas de velocidade (eixo X) versus posições iniciais das mitocôndrias individuais ao longo do axônio (eixo Y). Velocidade e proporção de estacionárias (vermelho), oscilatório (azul), e direcional em movimento (verde) mitochondria são representados em gráficos e gráficos de pizza (inserções acima parcelas), respectivamente. Red linhas pontilhadas projetando a partir regiões destacadas do axônio cartoon para o eixo Y de cada parcela indicar a localização aproximada e extensão do segmento axônio que foi fotografada. E, Terrenos F. mostre alterações no movimento mitocondrial após a administração de DA. Mudanças no movimento mitocondrial antes (E) e depois (F) a administração de DA são apresentados como parcelas de velocidade (eixo X) versus posições iniciais das mitocôndrias individuais ao longo do axônio (eixo Y). Velocidade e proporção de estacionárias (vermelho), oscilatório (azul), e direcional em movimento (verde) mitocôndrias são representados em gráficos e gráficos de pizza (inserções acima parcelas), respectivamente. Red linhas pontilhadas projetando a partir regiões destacadas do axônio cartoon para o eixo Y de cada parcela indicar a localização aproximada e extensão do segmento axônio que foi fotografada. G, H. kymographs Representante mostrando movimento mitocondrial em um neurônio cultivadas antes de (G) e depois (H) A administração do agonista do receptor D1R, bromocriptina. O neurônio foi fotografada por uma hora antes (G) e uma hora após a administração (H) de bromocriptina.
Empregando lentivírus mediada expressão de uma proteína fluorescente alvejado a mitocôndria em neurônios cultivados infectados e uma incubadora barata laboratório construído estágio-top que permite imagens de células vivas por longos períodos, temos sido capazes de investigar a ligação entre o movimento mitocondrial e os sinais de neuromoduladores , como a serotonina (5-HT), dopamina (DA) e acetilcolina (ACh). Nossos estudos têm ajudado a elucidar uma via de sinalização que, pela primeira vez, links tráfico mitocondrial para mudanças na atividade dos neurônios-modulado por neurotransmissores como a 5-HT e DA - que são o cerne da função neural. Nós achamos que o uso de proteínas fluorescentes alvo permite a observação de mitocôndrias rotulados na vida neurônios cultivados por longos períodos que podem ser mais fisiologicamente relevante do que a duração muito mais curta que são possíveis usando corantes vitais. Além disso, a intensidade do sinal de uma proteína fluorescente nos permite manter os tempos de exposição curtos durante a aquisição de imagem, minimizando a possibilidade de fotodegradação ou fototoxicidade. Finalmente, um estágio-top simples e barato incubadora que mantém a temperatura ambiente, umidade e níveis de CO 2, enquanto minimiza a evaporação da mídia, nos permite acompanhar o movimento mitocondrial em neurônios vivos por horas ou mesmo dias. Pesquisadores que desejam fabricar uma incubadora de estágio-top para as observações a longo prazo de mitocôndrias nos neurônios viver não precisa seguir os detalhes precisos do nosso projeto, desde que as propriedades dos materiais utilizados (por exemplo, o gás membrana permeável para evitar a evaporação da mídia ) e os princípios aplicados (por exemplo, controle de temperatura e umidade, o buffer de manutenção do pH, da osmolaridade) são geralmente consistentes com o que é descrito neste protocolo.
Gostaríamos de agradecer Donald Hutson para contribuir seus conhecimentos técnicos e muita habilidade durante o projeto e fabricação da incubadora em estágio superior. Estamos também gratos a Ayda Dashtaei por sua excelente assistência técnica. Todo o trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Neurociências.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Quantidade | Descrição (e localização na Figura 1) | ||
---|---|---|---|
1 | Cultura de tecidos incubadora (H) | ||
1 | Resistente ao calor gabinete plástico (delrin ou comparáveis) (A) | ||
1 | Armação de plástico para 35mm tampa GBM (para a aposição de membrana para placa de Petri) (M) | ||
02/01 | linear pé Limpar PFTE material da membrana (Teflon) | ||
4 | Polegar parafusos de latão | ||
2 | Pequena 10kOhm resistores dissipador de calor (usados como elementos de aquecimento no interior estágio-top gabinete incubadora) | ||
1 | Transformador (fonte de corrente 9V para resistores) | ||
1 | Terrário controlador de temperatura e sonda (regulação termostática de poder para resistores dissipador de calor através de transformador) | ||
1 | 2000ml Erlenmeyer (silenciador para a supressão de vibração na mangueira antes da fase-top incubadora) (K) | ||
1 | 1 / 8 "folha Sorbothane (junta material para base de estágio-top incubadora) | ||
1 | Hermético ABS (ou comparável) caixa de plástico (carcaça para a bomba de aquário) (J) | ||
1 | Aquário da bomba (I) | ||
1 | Ventilador pequeno computador | ||
1 | Invólucro de plástico para ventilador de arrefecimento (L) | ||
1 | 9V transformador para computador ventoinha de refrigeração | ||
20-30 pés | Nalgene ou silicone mangueira (conexões entre cultura de tecidos e-top estágio incubadoras; armadilhas umidade) (F, G, N) | ||
2 | Torneiras de plástico (para abrir e fechar o fluxo de ar antes e depois do estágio-top incubadora) (O) | ||
4 | Conectores de bronze farpado mangueira (mangueira para conexões de / para o estágio-top incubadora e gabinete de bomba de aquário) | ||
2 | Acopladores de bronze rápida (para conexões de mangueira de / para o estágio-top incubadora) | ||
2 | Acopladores de bronze rápida (para conexões de mangueira de / para o estágio-top incubadora) |
Tabela 1. Stage-top incubadora feita com partes:
Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo |
---|---|---|
Poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P7280-5mg |
laminina | Roche Applied Science | 11243217001 |
35 milímetros com fundo de vidro pratos | Mattek | P35GC-0-14-C |
DMEM | Life Technologies | 10567 |
B27 | Life Technologies | 17504-044 |
Glutamax | Life Technologies | 35050 |
Rica em lipídios BSA | Life Technologies | 11020-021 |
L-Asparagina | Sigma-Aldrich | P0380-100G |
L-Proline | Sigma-Aldrich | A8381-100G |
A vitamina B-12 | Sigma-Aldrich | V2876-100mg |
5-HT | Sigma-Aldrich | H9523-25mg |
8-OH-DPAT | Sigma-Aldrich | H8520-25mg |
Dopamina | Sigma-Aldrich | H8502-5G |
Bromocriptina | Sigma-Aldrich | B2134-25mg |
SKF38393 | Sigma-Aldrich | D047-100mg |
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