神经调节和线粒体运输：在较长的时间里，海马神经元的实时成像

我们描述了一个协议，允许在较长的时间，通过荧光显微镜观察生活中的神经元线粒体成像。过长时间的成像是通过一个mitochondrially有针对性的荧光蛋白，并利用一种廉价的舞台上方的孵化器，在我们的实验室设计和内置的慢病毒介导的表达。

要了解线粒体运输和神经功能之间的关系，关键是^观察 1-3延长工期的生活培养的神经元线粒体的行为。这是现在可以通过使用重要的染料和荧光蛋白与细胞骨架，细胞器，并在活细胞中的其他结构可以被标记，然后通过动态的荧光显微镜，可视化。例如，在鸡胚交感神经元，线粒体运动的特点，使用的重要染料罗丹明¹²³ 4 。在另一项研究中，线粒体mitochondrially针对性EYFP ⁵转染大鼠前脑神经元的可视化。然而，初级神经元，超过分钟，小时，甚至天的成像提出了一些问题。其中最重要的是：1）维护的培养条件，如温度，湿度，pH值在长成像会话; 2）一个强大，稳定的荧光信号，以确保获得的图像质量和信号强度的精确测量，在图像分析; 3）限制在图像采集的曝光时间，以尽量减少漂白，避免光毒性。

在这里，我们描述了一个协议，允许观察，可视化和高时间分辨率和最佳的生活支持条件下培养的海马神经元线粒体运动分析。我们已经构建了一个负担得起的阶段顶孵化器提供了良好的温度调节和大气中的气体流量，也限制了媒体蒸发的程度，以确保稳定的pH值和渗透压。这个孵化器连接，通过进口和出口软管，一个标准的组织培养孵化器，它提供恒定的湿度水平_和 5-10％的CO 2 /空气气氛。这种设计提供了一个成本效益的替代昂贵得多显微镜孵化器不一定保证了许多数小时甚至数天的细胞活力。为了形象化线粒体，我们与编码，有针对性地线粒体红色荧光蛋白的慢病毒感染的细胞。这保证了强大的和持久的的信号，配合稳定的氙气光源的使用，使我们能够限制在图像采集的曝光时间，但排除漂白和光毒性。舞台上方的孵化器顶部的两个注射口允许的神经递质和其他试剂的急性政府调节线粒体运动。总之，表达慢病毒介导的细胞器有针对性的红色荧光蛋白和我们的舞台上方的孵化器，传统的倒置荧光显微镜，CCD摄像头，以及氙气光源的结合使我们能够获得线粒体运输时间推移图像生活过较长的持续时间可能比那些在研究部署常规重要的染料和关闭的，现成的生命支持系统的神经元。

1。实验室建舞台上方的孵化器的说明

保持活细胞，在显微镜延长工期阶段提供了三大挑战：1）环境温度的控制和调节; 2）湿度控制，即保持水分含量的环境氛围; 3）维持适当的pH值在培养基中。这些“生命支持”问题是涉及长期培养的神经元，在温度和pH值的变化特别敏感的细胞，观察实验的关键。下面，我们描述了一个简单的实验室建造的舞台上的孵化器，我们在设计和建造实时成像神经元对延长工期。这个孵化器相连，通过一个封闭的回路，一个标准的组织培养培养箱（Thermo Scientific的阿什维尔，北卡罗来纳州），它提供了一个稳定的温水（37℃），10％的_CO 2 / 90％的空气加湿的气氛。

1. 孵化器外壳：孵化器的身体（图1（Ⅰ，Ⅱ），A）是一个计算机化的C＆C的铣床制造一个坚实的一块黑色聚甲醛塑料。它措施97.74毫米（长）x73.60毫米（宽）x28.58毫米（H）（96.74毫米内部尺寸x72.60毫米x27.58毫米）提供一个封闭容积约一万九千三百七十〇厘米^3。在外壳的两端钻两个孔和安装螺纹铜管倒钩/组织培养箱培养，以适应进口和出口软管。测量70.0毫米x43.0毫米一个矩形开口被碾在机箱的顶部，以便安置聚碳酸酯塑料窗口（图1（Ⅰ，Ⅱ），B） 。 （C，图1（一，二，三）顶视图和详细的个人资料显示在左上角）的孵化器基地，从3 / 16“铝库存碾磨，措施159.77毫米（L）x109.86毫米（宽）×3.175毫米（D）和设计，以适应到了Leica机动插入3盘阶段（型号11-522-068，徕卡有限公司，德国莱比锡）。四个带内螺纹钢职位休会连接到平齐安装的平头螺丝thebase角落，这些孵化器的外壳，已在每一个角落钻出接受的职位（图1（Ⅱ，Ⅲ），D）提供坚实的附着点。 sorbothane垫片（麦克马斯特卡尔，艾姆赫斯特，白细胞介素），切割和装配基地，提供一个密封外壳/基接口。四线程黄铜指旋螺丝匹配的职位，是用于保护外壳基地（图1（二，三）; D）被 ​​切开一个用薄凹唇35.1毫米直径的孔在中心孵化基地，以适应（ 图1（三）35毫米GBMS; E，在左上角的细节）;额外基地已设计，以适应其他培养皿大小。
2. 孵化器的外壳的内壁上都贴有加热元件：两个10千欧的散热片电阻（的Digi - Key公司，明尼苏达，Thief River Falls的）。这些被连接到一个9V DC，500MA变压器是插入到阿利费1000W水晶球温度控制器（卡罗莱纳州的宠物用品，Irmo，SC）。通过垫片放置在孵化器的外壳聚碳酸酯窗口有线探头检测到内部环境的温度和电阻决定电流的流动。结合组织培养孵化器，电阻器提供了一个环境温度控制的补充措施。
3. 闭路气氛系统：提供一个恒定的10％的_CO 2 / 90％的空气加湿和加热的气氛，舞台上方的“孵化器”连接， 通过入口和出口软管（图1（i），F ，G）的 ​​，在标准，水套式组织培养孵化器（ 图1（一），H）;备考的科学模型3154 Thermo Scientific的公司，阿什维尔，北卡罗来纳州）。就在舞台上方，进水管孵化器（ 图1（i），F）连接到运行到一个标准水族馆泵（ 图1（i）;我 ; Lifegard QuietOne 1200型号，Pentair公司游泳，埃尔蒙特，加利福尼亚）已封闭在一个密封的ABS塑料盒（ 图1（i），J; 1150型号，派力肯产品公司，托伦斯，CA），以维持一个封闭的回路。该泵从组织文化的孵化器促进的连续气流舞台上方的孵化器。进水软管泵的阶段后，运行一个1500毫升锥形瓶中（ 图1（i），K）作为消声器，以尽量减少泵的振动传递到舞台上方的“孵化器“的行为。从舞台上方的“孵化器”领导组织培养孵化器（图1（一 ），H） 插座软管（图1（i），G）是装有一个封闭的电脑风扇（图1（i）， L），其中，泵一样，也是为了促进持续的气流。
4. PFTE为35mm大紫荆勋章的膜盖：放置在舞台上方的孵化器成像神经元的文化之前，安装的35mm大紫荆勋章是一个特殊的我mbrane盖子（ 图1（二，四）; M，在右上角显示的细节），使气体交换，并在同一时间，最大限度地减少培养液的蒸发。此盖由一个聚甲醛塑料RIM和PFTE膜（聚四氟乙烯;美国Durafilm有限责任公司，Holliston马）的预切板，已伸过来的边缘，并在举行与氟橡胶垫片，成单聚甲醛塑料RIM沿一侧的凹槽通道。
5. 注射口：两洞钻入聚碳酸酯舞台上方的“孵化器”窗口（图1（二），中心详细，乙附近的黄色箭头）。这些装有不锈钢汉密尔顿注射器结束管理过程中一个给定的实验的5 - HT，DA，各种受体激动剂和拮抗剂，和其它试剂为注射口。

2。海马文化的制备

所有的工作是在一个BSL2层流罩，或在层流台。海马神经元是从E18大鼠胚胎中分离根据标准^程序 6-7，空调已经由初级皮层星形胶质细胞的无血清培养基中生长。根据公布的方法^7，神经胶质细胞的准备。由低与脯氨酸补充的糖DMEM（1.76微克/毫升），天冬酰胺（0.83微克/毫升），维生素B12（0.34微克/毫升），血糖（20MM），富含脂质的BSA（0.5毫克/毫升的条件培养基）和B27的^8-10％。无抗生素添加到中期，因为它们可能会干扰神经细胞的基因转录。

1. 盖与聚- D -赖氨酸（0.05毫克/毫升的PBS），一个35mm的玻璃底培养皿的中央玻璃盖玻片部分（GBM）和离开站在了两个小时，在37 ° C。吸聚- D -赖氨酸的解决方案，允许干为20分钟在BSL2层流罩。盖与层粘连蛋白（0.01毫克/毫升的PBS）的大紫荆勋章的D -聚赖氨酸涂层的盖玻片部分，并删除多余的层粘连蛋白解决方案，至少40分钟前离开。预留了20分钟。
2. 剖析从E18大鼠胚胎大脑海马区，并游离于他们在当前的协议中所述^神经 6 。
3. 稀释成游离细胞生长介质，让110,000每GBM细胞密度。根据GBMS你将准备在您的主结构计算必要的细胞浓度。
4. 在孵化器设置ATA温度37℃，大气中10％的_CO 2 / 90％的空气混合的种子GBMS。
5. 三，五天后，取决于神经元的生长条件，加入阿糖胞苷℃（0.14毫微克/毫升）的文化，以抑制神经胶质增生。
6. 允许文化的慢病毒感染前两个星期的增长。在此期间，中等量的三分之一，每三天更换新鲜培养基在每个大紫荆勋章。不要超过这个金额的媒体，因为这可能导致渗透压冲击和细胞死亡。

3。重组慢病毒编码的红色荧光蛋白的制备

对于那些没有获得生产重组慢病毒的设施的调查，由一个商业实体，如系统生物科技公司（美国加州Mountain View）的定制生产是一种选择。

增强巨细胞病毒主要立即早期基因启动子¹¹的转录调控下一个mitochondrially针对性的红色荧光蛋白基因（MitoTurboRFP; Axxora有限责任公司，加利福尼亚州圣迭戈）插入一个自我失活的重组猫免疫缺陷病毒。重组慢病毒产生的瞬时转染293T细胞。

1. 板〜75000细胞/平方^厘米 ，翌日，与编码的重组病毒载体，FIV的gag和pol基因，水疱性口炎病毒摹的糖蛋白基因的质粒共同转染细胞，密度293T细胞使用的PolyJet （SignaGen实验室，马里兰州盖瑟斯堡）。共有12微克的DNA（病毒载体4.8微克，4.8微克gagpol质粒，和2.4微克的VSV摹质粒）是用于293T细胞中的每一个10cm的培养皿中。
2. 24小时后，吸出培养基和无酚红汉克斯平衡盐溶液洗涤细胞，以去除残留的DNA。添加无血清神经基础培养基用50μg/ml的富含脂质的BSA和Glutamax10毫升。
3. 翌日，通过0.2微米的低蛋白结合滤波器收获上清，过滤器，并添加到一个Vivaspin 20聚醚砜超滤装置（德国赛多利斯，美国协和，）。预治疗的顺序，组织文化品位的水，70％的乙醇和磷酸盐缓冲液洗涤Vivaspin单位。精矿含病毒上清〜50倍1500xg离心30分钟。分装病毒的制备和储存在液态_氮。
4. 估计病毒感染大鼠B104细胞浓缩病毒等分，72小时后通过流式细胞仪测量荧光蛋白的表达量。阳性细胞百分比提供了一个浓缩病毒的病毒需要获得在给定数量的初级神经元荧光蛋白的表达，即量的估计金额。

4。感染培养的神经元

通过简单地增加病毒的数量，估计感染高达50％基于流式细胞仪数据的所有神经元海马神经元培养在14天的体外感染。没有聚凝胺是用来。文化是保持3天前检查荧光蛋白的表达。如果信号太弱，那么文化是几天后返回到组织培养的孵化器和复检。

5。闭路生命支持系统的一般维护

1. 要保持适当的湿度，确保孵化器的水套，定期检查，并在必要时填补。一定要放在培养箱内含有水（25毫米深），灭藻剂的体积小，不锈钢或铝盘。
2. 必要时，清除排空收集的水从集水区管的进气口和孵化器的气氛电路插座的软管。定期用70％乙醇冲洗软管。

6。应用膜盖GBM和安置在舞台上方的孵化器

1. 在舞台上方的孵化器内的大紫荆勋章的位置，取代膜覆盖，在组织培养罩盖的塑料盖。一旦做到这一点，你可以动议显微镜所覆盖的大紫荆勋章。
2. 仔细座位膜覆盖在舞台上方的“孵化器”的基础上盖子凹陷开放的大紫荆勋章。为了避免拥挤的大紫荆勋章，确保该基地已经在显微镜舞台上的地点;基地剪辑阶段有一定的难度，因为，它是最好的地方的大紫荆勋章后，基地位置。
3. 对准钢铁岗位上的孵化基地的孵化器的外壳和降低底座上的外壳。拧紧螺钉，直到良好的密封外壳和底座之间实现。

7。图像采集

注意，大部分可用的成像软件平台，通过广泛的显微镜和相关的硬件相媲美的功能。各种图像采集和分析软件平台，包括MetaMorph和具体的显微镜使设计的方案，如徕卡，尼康的NIS元素应用套件，和卡尔蔡司AxioVision。在这个协议中，我们描述的图像采集和分析程序，我们使用Slidebook 5（智能成像创新，丹佛，CO）执行。然而，在本协议中所述的每个操作步骤的组成可以很容易适应使用的其他各种方案。

倒置荧光显微镜，过滤器配置，CCD摄像头，氙灯光源，和图像处理软件的描述 ：

海马神经细胞线粒体运输的动态影像，我们使用了Leica DMI - 6000B倒置荧光显微镜和型号11-522-068机动阶段（莱卡微系统公司的CMS，韦茨拉尔，德国）装上一个库克Sensicam均衡CCD摄像头（“库克公司，罗穆卢斯，MI），一个萨特LAMBDA 10-2滤光轮和控制器（萨特仪器公司，诺瓦托，CA），和一个萨特DG - 4 300W氙气光源。可视化线粒体MitoTurbo红色荧光蛋白标记，我们使用一个为555nm的过滤器相结合，在DG - 4光源激发和600nm处的过滤器（峰值;塞达特四分光型号86100bs安装徕卡DM系列过滤器立方体，色度技术公司，波纹管瀑布，VT）和617nm，在显微镜和滤光轮，分别对排放。

图像采集和分析，我们使用数字显微成像软件包Slidebook 5。这是一个综合包，允许显微镜阶段，滤光轮，摄像头，光源，图像采集期间，以及各种图像处理和分析模块的全自动化控制。

下面，我们提供具体的，一步一步的指示获取时间的推移图像移动线粒体荧光标记使用Slidebook 5的神经元。

1. 确保显微镜，滤光轮控制器，光源和CCD相机已关闭开放前Slidebook 5。
2. 线粒体的实时成像，切换到一个63X的油浸目标，降低目标炮塔显微镜下面的阶段目标，以提供足够的访问（和舞台顶孵化器），并仔细适用于石油，直接到目标表面。 Slidebook工具栏上点击“焦点的窗口”图标，打开焦点的窗口。在重点窗口，打开的明灯标有“灯”的滑块滑动明强度调整到一个合适的水平。收购重点领域的细胞，并找到一个利益的单元格。
3. 在“范围”选项卡，选择“CY3”福陆公司。荧光灯照明下使用的目镜，找到已与三刀TurbRed蛋白标记的细胞线粒体的焦平面。一旦你已经获得通过目镜的焦点，切换到CCD摄像头，并重新获得焦点，如果必要。
4. Slidebook工具栏上点击“图像捕捉”图标，打开图像采集窗口。从最初的曝光时间为100ms，使用“测试”和“最佳”按钮，或者，您可以使用“一旦”按钮，找到最佳的曝光时间。请记住，曝光时间应该提供足够的强度在整个图像领域的传播（如0-2500，在图像采集窗口底部的直方图表示）最低期限内（如200 - 800毫秒）。
5. 图像采集开始前的时间推移，通过点击“高级”选项卡内的图像采集窗口仍然打开“高级”窗口。找到“焦点访谈”标签，检查“Autofous”在time-lapse/multipoint捕获“选项，并调整时间推移图像采集自动对焦设置。一般来说，我们使用自动对焦以下参数：更新重点每隔2-3帧;选择自动对焦通道成像福陆公司标记的线粒体，即，CY3，共搜索范围63X放大倍率为2 UM。
6. 在“捕获”窗口，在“捕捉类型”框中，检查“Timelapse”选项，在“Timelapse捕获”选项中选择所需的成像间隔和成像会议期间“。时间推移成像在我们的研究，对线粒体交通的神经调影响，在一个小时的会议，共360张图像图像之间的10秒的时间间隔收购。
7. 在底部，右侧点击“捕获”窗口“开始”按钮，启动时间推移图像采集。
8. 初期，或控制，成像会议后，通过舞台上方的孵化器港口管理和其他试剂的神经递质，并开始一个新的成像会话。

8。图像分析

1. 打开图像文件保存后，最后成像会议。
2. 个人线粒体可自动或手动标记在时间推移的形象系列，采用掩蔽所提供的功能Slidebook 5。
3. 在“面具”菜单，从菜单栏中选择“分部”。通过滑动门槛低和高线的“直方图”工具，在整个图像屏蔽所有的蓝色颗粒，涵盖所有的过程中所载的线粒体，但离开尽可能离散颗粒。应用口罩，整个形象系列。
4. 创建第二个面具（“面具”菜单下，选择“创建”），覆盖整个图像，除了利益的过程，其中的颗粒已经由以前的面具突出。这是完成的，首先使用最厚的“铅笔”工具跟踪的过程之外的领域的边界，然后，使用“油漆桶”工具，以填补在范围内的地区，。套用这个面具到整个图像系列。
5. “面具下，”选择“面具行动”和执行“减”行动，即，第二个面具减去从拳头面具（除整个过程形象）。将产生第三个口罩，其中只有利益的过程中突出显示。请注意，这个新的面具将被应用到整个图像系列。
6. 在“批注”，选择“对象ID。”
7. 验证的连续性和个人数字转让蒙面通过手动审查的形象系列线粒体（Slidebook 5，“玩”，“前进框架”和“反向帧”按钮，图像窗口下方可以用于此目的）。
8. 选择菜单栏上的“面具”标签。在“面具”，选择“粒子跟踪和运行的基本的粒子跟踪”来产生“路径”统计“，包括每个蒙面线粒体的质心坐标。
9. 由两个相邻的图像帧之间的每个线粒体走过的距离计算每个粒子的每一帧中的坐标。
10. 在我们以前的研究线粒体运动神经调质的作用，我们确定了三个不同人群的线粒体：“静止”，“振荡”，和“定向移动”如果线粒体旅行小于0.2微米（或2个像素，63X放大倍率下，1像素= 0.10235微米），在一小时内，它的特点是“固定”。如果线粒体移动至少有0.2微米，但小于2。5微米，在顺行，逆行周期，它被定义为“振荡”。“最后，如​​果一个线粒体旅行了超过2.5微米在一个方向的净的距离，它是归类为移动方向。 图2所示是一个柱状图显示的所有标记的线粒体在有代表性的实验，以及饼图呈现出三个不同人群线粒体的百分比分配运动。
11. 平均每个线粒体的速度是根据在一个给定的成像会话走过的总距离。线粒体人口平均计算速度增加个人的速度和除以总数的线粒体跟踪。
12. Kymographs使用Slidebook 5提供了一个模块，可以生成。使用“面具”的功能，画出一条细线，横跨整个一个给定的进程（例如轴突）的范围;，一定要通过尽可能多的线粒体重心的通过尽可能。转到“面具”选项卡，在菜单栏上选择“高级操作”，然后“平滑曲线分析。”流畅的曲线分析中使用的默认设置，或根据需要定制。运行流畅的曲线分析模块。在分析结束时，将显示成像会议kymograph。
13. 转到菜单栏并选择“查​​看”，然后“输出TIFF。”
14. 打开保存。tif文件包含在Photoshop kymograph或类似的图像处理程序，将图像转换到倒的灰度。

9。代表性的成果

通过跟踪和分析在培养海马神经元线粒体运动，我们已经证明神经调节和线粒体贩运之间的联系。具体来说，我们发现，5 -羟色胺（5 - HT）或5 - HT1A受体激动剂8 - OH - DPAT， 刺激线粒体运动（ ^图 2A - C）8，而多巴胺（DA）D2受体激动剂，溴隐亭，抑制线粒体运动（ 图2D - ^G）9。

图1。闭路阶段孵化器系统的设计孵化器的系统的下列组件：耐热聚甲醛塑料外壳（A），聚碳酸酯塑料窗口的矩形开口（B），铝的孵化器基地（三）;孔。接受钢铁基地（四）职位;在孵化基地的中心凹唇薄35.1毫米直径的孔，以容纳35毫米大紫荆勋章菜（五）; NALGENE软管（组织培养和顶部阶段，孵化器之间的连接;水分陷阱）（ F，G，N）的组织培养孵化器（H）;水族馆泵（一）;气密ABS塑料盒（水族水泵房）（J）;2000毫升锥形瓶（软管抑制振动消声器前阶段顶部孵化器）（K）冷却风扇的塑料外壳（L）为35mm GBM的盖子的塑料架（M）;塑料活塞的位置（海外）。 （二）中的黄色箭头表示试剂的管理端口的位置。

图2。代表性的成果：调控线粒体运输答：文化的一个典型的大鼠海马神经元的轴突。用慢病毒编码的荧光蛋白标记的线粒体显示绿色; immunolabeled轴突与磷酸化神经丝蛋白抗体显示为红色。轴突的程度上是由黄色箭头表示。图像是由四个相互重叠的显微照片。 B.时间推移​​图像显示线粒体运动的一系列变化，给药后5 - 羟色胺的例子。通过倒置荧光显微镜图像收购和储存，后来转化为Quicktime电影的序列。代表序列的图像显示个人在不同时间点前（左图）和8 - OH - DPAT，5 - HT1A受体激动剂后（右图）管理的线粒体。垂直的红色矩形突出一个固定的线粒体（左）和振荡的多个时间点的线粒体（右）。振荡线粒体（左图）表示正在走向治疗后的轴突终端与8 - OH - DPAT（右面板;红边的白色箭头）。垂直的黄色线（右图）表示移动线粒体的起始位置。显示在右下角的角落，每帧的时间间隔。在右侧面板右下角的放大倍率（63 ×）表示。 C，D图解显示给药后5 - 羟色胺的线粒体运动的变化。线粒体运动的变化之前（C）和（四）5 - 羟色胺的管理地块的速度（X轴）与个体线粒体的初始位置，沿着轴突（Y轴）。固定（红色），振荡（蓝色），和定向移动（绿色）米的速度和比例itochondria表示在图和饼图（上述地块的插图），。突出地区的卡通轴突投射到每个小区的Y轴的红色虚线表示的大致位置和程度的轴突部分是成像。 E，F图解显示给药后DA的线粒体运动的变化。更改之前在线粒体运动（E）和（F）的DA的行政地块的速度（X轴）与个体线粒体的初始位置，沿着轴突（Y轴）后。速度和比例固定（红色），振荡（蓝色），和定向移动（绿色）的线粒体图，饼图（上述地块的插图），分别代表。突出地区的卡通轴突投射到每个小区的Y轴的红色虚线表示的大致位置和程度的轴突部分是成像。 G，H.代表kymographs显示在培养的神经细胞线粒体运动前（G）和（H）的D1R受体激动剂，溴隐亭管理。成像神经元一小时前（G）和1小时后（H）溴隐亭管理。

采用有针对性地在感染培养的神经元线粒体荧光蛋白的慢病毒介导的表达和廉价的实验室建阶段顶的孵化器，允许延长工期的活细胞成像，我们已经能够进行调查线粒体运动和neuromodulatory信号之间的联系5 - 羟色胺（5 - HT），多巴胺（DA），乙酰胆碱（ACH）等。我们的研究有助于阐明信号通路，第一次，链接线粒体贩运活动的神经递质，如5 - HT和DA神经元调制的变化 - 心脏神经功能。我们发现，使用有针对性的荧光蛋白许可证标记长时间，可能会比更短的工期可以使用重要的染料有关的生理，生活培养的神经元的线粒体观察。此外，荧光蛋白信号的强度，使我们能够保持在图像采集的曝光时间短，最大限度地减少漂白或光毒性的可能性。最后，一个简单和廉价的阶段顶部的孵化器，保持环境的温度，湿度_，和二氧化碳水平，同时尽量减少媒体的蒸发，使我们能够按照居住超过几小时甚至几天的神经细胞线粒体运动。想编造一个阶段顶部的“孵化器”在活的神经元线粒体的长期观测的研究人员需要按照我们的设计提供精确的细节，使用（例如，透氧膜，以避免媒体蒸发的材料特性）和应用（例如，温度和湿度控制，pH值，渗透压维护的缓冲）的原则一般是在本议定书中所描述的一致。

我们要感谢他在舞台上方的孵化器的设计和制造技术的专业知识和高超的技巧贡献唐纳德赫特森。我们也感谢Ayda Dashtaei为她出色的技术援助。所有的工作是研究基金会的神经科学的支持。