본 연구는 과립 하이드로겔의 고유한 특성을 활용하여 세포의 움직임과 조직 재생을 위한 기능을 조사하는 데 중점을 두고 있습니다. 미세환경에 대한 세포 반응은 번역 영향에 대한 의미를 이해하는 데 있어 모델링하는 데 중요합니다. 3D 포트 스캐폴드의 사용이 증가함에 따라 상처 치유 환경에서 세포 거동을 더 잘 복제할 수 있는 포괄적인 3D 마이그레이션 분석의 필요성도 증가하고 있습니다.
우리는 세포의 움직임과 in vitro 이동을 조사하기 위해 골격 개발에서 이미징 및 분석에 이르기까지 3차원인 두 개의 파이프라인을 개발했습니다. 이 두 가지 새로운 분석을 통해 우리는 상처 치유의 두 가지 뚜렷한 단계, 즉 벌크 조직으로부터의 초기 골격 침투와 복잡한 골격으로 둘러싸인 세포 이동에서 반응하는 세포를 추적할 수 있는 능력을 얻었습니다. 먼저, 96웰 플레이트의 최소 6웰에 평방 센티미터당 120,000개의 인간 피부 섬유아세포 세포를 플레이트화합니다.
하룻밤 배양 후 흡인기 또는 피펫을 사용하여 세포 웰에서 배지를 제거합니다. 각 겔 상태의 20마이크로리터에 있는 염료를 용적 치환 피펫을 사용하여 웰에 추가합니다. 섭씨 25도로 설정된 플레이트 회전 로터 원심분리기 부착물을 사용하여 100g에서 15초 동안 플레이트를 회전시키고 가속 및 감속을 8로 설정하여 젤을 평평하게 만듭니다.
플레이트를 180도 뒤집고 다시 회전하여 웰 바닥에 젤이 고르게 분포되도록 합니다. 겔을 무균 방식으로 광 가교하려면 365나노미터의 집중된 빛을 30초 동안 적용하여 골격을 어닐링합니다. 모든 골격을 형성한 후 각 웰에 200마이크로리터의 매체를 추가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.
컨포칼 현미경을 사용하여 세포를 이미지화하고 이동 거동을 캡처합니다. 이미지 분석을 위해 일괄 변환을 위해 Imaris 이미지 변환 소프트웨어를 엽니다. 현미경 이미지를 변환 소프트웨어로 끌어다 놓고 소프트웨어 영역 내의 폴더를 선택하여 파일을 가져옵니다.
각 파일을 개별적으로 선택하여 복셀 크기를 설정합니다. 모두 시작을 눌러 변환을 시작합니다. 다음으로 Imaris Arena Software에서 처리를 시작할 경기장의 이미지를 선택합니다.
메인 도구 모음에서 Image Pros 탭을 클릭합니다. 이제 채널 1의 드롭다운 메뉴를 클릭하고 배경 빼기를 선택합니다. 확인을 눌러 3D 보기로 돌아갑니다.
작은 도구 모음에서 Add New Surfaces(새 표면 추가)라고 표시된 둥근 파란색 모양이 있는 아이콘을 클릭하여 Surfaces 1이라는 편집 가능한 개체 탭을 만듭니다. 파란색 화살표 버튼을 사용하여 모든 반복실험에 대한 파라미터를 수동으로 생성합니다. 표면 세부 정보를 0.7마이크로미터로 설정하고 배경 빼기, 로컬 대비를 선택합니다.
개체 상자에 맞는 가장 큰 구의 지름에 평균 셀 길이를 입력합니다. 임계값 설정의 경우, 가장 밝은 셀만 분할하도록 강도 히스토그램을 결정합니다. Split Touching Objects, Region Growing을 활성화하고 시드 포인트 지름을 이전에 사용한 지름과 일치하도록 설정합니다.
배치 분석을 위해 생성 매개변수를 저장하려면 Creation이라고 표시된 지팡이 아이콘을 클릭합니다. store parameters for batch(배치에 대한 매개 변수 저장)를 클릭하고 파일 이름을 지정한 다음 OK(확인)를 클릭합니다. 모든 셀 높이를 수집하려면 세부 탭을 클릭하십시오. 특정 값을 선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 Z 위치를 지정합니다.
저장 아이콘을 클릭하여 모든 Z 위치 및 분류를 XLS 파일로 내보냅니다. 시작하려면 PBS를 층류 후드 아래의 페트리 접시에 붓고 세포 배지 용액의 20마이크로리터 방울을 페트리 접시의 거꾸로 된 뚜껑에 피펫팅합니다. 뚜껑을 접시에 다시 놓고 접시를 배양하여 매달린 액적 배양 3D 스페로이드를 얻습니다.
PLOSMA를 설정하려면 용적식 피펫을 사용하여 15마이크로리터의 겔을 투명한 96웰 플레이트의 웰에 무균 방식으로 첨가합니다. 플레이트 회전 로터 원심 분리기 부착물을 사용하여 1, 000g에서 플레이트를 10초 동안 회전시켜 젤을 평평하게 만듭니다. 플레이트를 180도 뒤집고 다시 회전시켜 젤이 균일하게 분포되도록 합니다.
그런 다음 365나노미터의 집중된 빛을 30초 동안 적용하여 골격을 어닐링하고 상단에서 젤을 광 가교 결합합니다. 매달려 있는 물방울의 페트리 접시를 조직 배양 후드로 무균 상태로 옮기고 뚜껑을 뒤집습니다. 20마이크로리터 피펫을 사용하여 스페로이드가 피펫 팁에 들어갈 때까지 물방울을 천천히 흡인하고 웰 중앙의 골격으로 물방울을 배출합니다.
웰 플레이트를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하여 스페로이드가 골격에 부착될 수 있도록 합니다. 배양 후 각 스페로이드 위에 15마이크로리터의 젤을 추가로 피펫으로 주입합니다. 젤이 고르게 분포되도록 각 방향으로 300g에서 15초 동안 플레이트를 원심분리합니다.
앞에서 설명한 것처럼 자외선을 사용하기 위해 젤의 최상층을 어닐링합니다. 플레이트를 컨포칼 현미경 아래에 놓고 가장 낮은 Z-평면과 가장 높은 Z-평면을 선택한 후 스페로이드를 이미지화합니다. 이미지를 Imaris Arena Software로 가져온 후 채널 1의 드롭다운 메뉴를 클릭하고 배경 빼기를 선택합니다.
패널 아래쪽에 있는 확인을 누릅니다. 3D 보기의 경우 디스플레이 조정 팝업 창에서 모든 채널 자동 조정을 누르고 필요에 따라 수정합니다. 더 작은 도구 모음에서 Add New Reference Frame 아이콘을 클릭하여 Reference Frame 1이라는 탭을 만듭니다.
세 평면 모두에서 원점을 회전 타원체의 중심으로 이동합니다. 동일한 도구 모음에서 주황색 구가 있는 아이콘을 클릭하여 새 스폿을 추가하고 Spots 1이라는 탭을 만든 다음 파란색 화살표 버튼을 눌러 계속 진행합니다. 임계값을 적용하려면 강도 히스토그램을 조정하여 가장 밝은 부분만 분할합니다.
슬라이서를 사용하여 정확성을 위해 이미지 스택을 탐색합니다. 파란색 다음 화살표를 세 번 누릅니다. Render on Slicer(슬라이서에서 렌더링)를 선택 취소하거나 설정 패널에서 노란색 사각형 아이콘을 클릭합니다.
Statistics 탭을 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 특정 값과 원점 참조 프레임으로부터의 거리를 선택합니다. 저장 아이콘을 클릭합니다.
모든 변경 사항 및 분석을 저장하려면 기본 도구 모음에서 저장 아이콘을 클릭합니다. 이 방법은 조직 계면에서 세포 침투를 평가하는 데 사용되었습니다. 이동하는 세포의 Z축에서 중앙값 위치는 0시간에서 24시간으로 크게 증가하여 눈에 띄는 수직 세포 이동을 나타냅니다.
Z축을 따른 세포 이동의 접힘 변화는 24시간 후에 두 배로 증가했습니다. PLOSMA 방법을 사용하여 파종된 세포는 24시간 후 스페로이드 코어에서 상당한 확산 및 이동을 보여주었습니다. 3차원 렌더링은 24시간 후에 PLOSMA 골격에서 광범위한 세포가 퍼지는 것을 보여주었으며 눈에 보이는 돌출부는 바깥쪽으로 확장되었습니다.
스팟(Spots) 기능을 사용하여 처리된 3D 이미지는 골격에 분산된 세포 위치를 보여주었으며, 이는 광범위한 이동을 나타냅니다. 세포는 평균 200마이크로미터 이상의 거리를 이동했으며 샘플 전반에 걸쳐 일관된 결과를 보였습니다. PLOSMA 스캐폴드에서 세포의 Z-높이 폴드 변화는 약 4였으며, 이는 상당한 상향 이동을 나타냅니다.
