我们的研究重点是利用颗粒水凝胶的独特特性来研究细胞运动和组织再生的功能。细胞对微环境的反应对于理解翻译影响的影响非常重要。随着 3D 端口支架使用的增加，对全面的 3D 迁移检测的需求也在增加，以便在伤口愈合环境中更好地复制细胞行为。
我们开发了两个三维管道，从支架开发到成像和分析，用于研究体外细胞的运动和迁移。通过这两种新的检测方法，我们获得了在伤口愈合的两个不同阶段跟踪反应细胞的能力:来自大量组织的初始支架浸润和细胞运动，一旦被复杂的支架包围。首先，在 96 孔板的至少 6 个孔中每平方厘米接种 120， 000 个人真皮成纤维细胞。
孵育过夜后，使用吸液器或移液器从细胞孔中取出培养基。使用外置活塞式移液器将 20 μL 每种凝胶条件中的染料添加到孔中。使用设置为 25 摄氏度的板旋转转子离心机附件，以 100 g 离心板 15 秒，加速和减速设置为 8 以使凝胶变平。
将板翻转 180 度并再次旋转，以确保凝胶在孔底均匀分布。要对凝胶进行无菌光交联，请在 365 纳米处施加聚焦光 30 秒，以对支架进行退火。形成所有支架后，向每个孔中加入 200 微升培养基，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。
使用共聚焦显微镜对细胞进行成像并捕获它们的迁移行为。对于图像分析，请打开 Imaris 图像转换软件进行批量转换。将显微镜图像拖放到转换软件中，然后在软件领域中选择一个文件夹以导入文件。
单独选择每个文件以设置 体素大小.新闻 全部开始 开始转换。接下来，在 Imaris Arena 软件中，从 Arena 中选择一张图像以开始处理。
单击主工具栏中的 Image Pros 选项卡。现在，单击通道 1 的下拉菜单，然后选择 背景减法.按 OK 返回 3D 视图。
在小工具栏中，单击标记为 Add New Surfaces 的带有圆角蓝色形状的图标，以创建名为 Surfaces 1 的可编辑对象选项卡。使用蓝色箭头按钮为所有仿行手动生成参数。将表面细节设置为 0.7 微米，然后选择 Background Subtraction（背景减去）、Local Contrast（局部对比度）。
将平均单元长度输入到适合对象框的最大球体的直径中。对于阈值，确定强度直方图以仅分割最亮的单元格。启用 Split Touching Objects 和 Region Growing，并设置种子点直径以匹配以前使用的直径。
要保存创建参数以进行批量分析，请单击标记为 Creation 的棒图标。单击 store parameters for batch（存储批处理的参数），为文件命名，然后单击 OK（确定）。要收集所有像元高度，请单击 Detailed 选项卡。选择特定值，然后从下拉菜单中选择 Position Z。
单击 Save 图标将所有 Z 位置和分类导出到 XLS 文件中。首先，将 PBS 倒入层流罩下的培养皿中，并将 20 微升细胞培养基溶液液滴移到培养皿的倒盖上。将盖子放回培养皿上并孵育板以获得悬挂的液滴培养的 3D 球体。
要设置 PLOSMA，请使用外置活塞式移液器在无菌条件下将 15 μL 凝胶添加到透明 96 孔板的孔中。使用板旋转转子离心机附件，将板以 1， 000g 离心 10 秒以使凝胶变平。将板翻转 180 度并再次旋转以确保凝胶分布均匀。
然后，在 365 纳米处施加聚焦光 30 秒，使支架退火，并从顶部光交联凝胶。在无菌条件下将悬挂液滴的培养皿移入组织培养罩中，并倒置盖子。使用 20 微升移液器，缓慢吸出液滴，直到球体进入移液器吸头，然后将液滴喷射到孔中心的支架上。
将孔板在 37 摄氏度下孵育 2 小时，以使球体附着在支架上。孵育后，在每个球体顶部再吸取 15 μL 凝胶。将板以 300 g 离心力向每个方向离心 15 秒，以确保凝胶分布均匀。
如前所述，对凝胶的顶层进行退火以使用紫外线。将板放在共聚焦显微镜下，并在选择最低和最高的 Z 平面后对球体进行成像。将图像导入 Imaris Arena 软件后，单击通道 1 的下拉菜单，然后选择背景减法。
按面板底部的 OK。在 3D 视图中，按显示调整弹出窗口中的自动调整所有通道，然后根据需要进行校正。在较小的工具栏中，单击 Add New Reference Frame 图标以创建标记为 Reference Frame 1 的选项卡。
将原点移动到所有三个平面中椭球体的中心。在同一工具栏中，单击带有橙色球体的图标以添加新点，创建名为 Spots 1 的选项卡，然后按蓝色箭头按钮继续。对于阈值，请调整强度直方图以仅分割最亮的部分。
使用切片器在图像堆栈中导航以确保准确性。按蓝色的 Next 箭头三次。取消选中 Render on Slicer 或单击设置面板上的黄色方形图标。
单击 Statistics 选项卡。在下拉菜单中，选择特定值和距原点参考系的距离。单击 Save 图标。
要保存所有更改和分析，请单击主工具栏中的 Save 图标。该方法用于评估组织界面的细胞浸润。迁移细胞 Z 轴的中位位置从 0 到 24 h 显著增加，表明细胞垂直运动显著。
24 小时后，细胞沿 Z 轴迁移的倍数变化翻了一番。使用 PLOSMA 方法接种的细胞在 24 小时后显示出从球状体核心的显著扩散和迁移。三维渲染显示 24 小时后，细胞在 PLOSMA 支架中广泛扩散，可见突起向外延伸。
使用 Spots 函数处理的 3D 图像揭示了支架中分散的细胞位置，表明广泛迁移。细胞的平均移动距离超过 200 微米，样品间的结果一致。PLOSMA 支架中细胞的 Z 高度折叠变化约为 4，表明显着的向上移动。
