Out lab은 기초 및 중개 신경 과학에 중점을 두고 있습니다. 이는 간질 연구의 강력한 기반과 신경 보호, 신경 염증 및 신경 재생에 대한 혁신적인 접근 방식을 결합하고 있습니다. AI, 고급 E 기계 및 유전학 도구를 플라나리아 신경 조절 장치와 같은 혁신적인 모델과 결합하면 기본 발작 메커니즘을 연구하기 위해 환경을 변화시킬 수 있습니다.
실험적 발작 모델은 간질의 메커니즘을 이해하고 잠재적인 치료법을 테스트하는 데 매우 유용합니다. 그러나 발작의 생물학에 대한 제한된 이해, 무척추 동물 모델에서 인간 및 최소 발작 메커니즘의 복잡성, 행동 및 신경 생리학적 반응에 대한 표준화된 프로토콜의 한계, 다양한 모델에 걸친 약물 효능으로 인해 발작의 번역 효과를 제한하는 몇 가지 과제가 지속되고 있습니다. 우리가 다루고 있는 격차는 용량 의존적, 필로카르핀에 의한 플라나리아 행동과 그에 따른 신경계의 변화 사이의 관계이며, 이는 면역형광 및 골기 염색 기술을 사용하여 조직학적으로 시각화됩니다.
플라나리아는 실험적 발작에 대해 비용 효율적이고 윤리적으로 유리한 모델 역할을 합니다. 다른 무척추동물이나 얼룩말 물고기와 달리 플라나리아는 뉴런을 재생하고 다양한 행동 표현형을 보여 항발작 약물 검사에 대한 가치를 높입니다. 그들의 단순성과 신경 메커니즘의 보존은 기초 연구와 중개 간질 연구를 연결합니다.
플라나리아는 양측 대칭 뇌화(conmemetry encephalization), 신경전달물질 체계 보존, 신경독성 및 경련제에 대한 민감성 때문에 발작 모델로 작용합니다. 이 다재다능한 모델은 무척추동물과 포유류 간질 모델을 연결하여 중개 연구 및 항발작 약물 발견 노력을 발전시킵니다. 이 연구 결과는 발작으로 인한 신경 세포 재생 메커니즘, 신경 세포 연결 변화, 광범위한 신경 독성 연구, 발작 후 유전자 보존 및 약물 치료, 사회적 행동 플라나리아를 조사하여 간질의 동반 질환을 연구하는 데 영감을 줍니다.
시작하려면 샘물에 용해된 1밀리몰과 2밀리몰 농도의 필로카르핀 용액 두 가지를 준비합니다. 각 용액을 3 밀리리터씩 4 X 3 웰 플레이트의 별도 행에 피펫팅합니다. 피펫 팁을 잘라 구멍을 손상시키지 않고 플라나리아에 맞을 만큼 충분히 크게 만듭니다.
절단 팁이 있는 이송 피펫을 사용하여 실험실에서 사육한 2주 된 Dugesia dorotocephala 1개를 12개의 웰 각각에 넣습니다. 정상적인 실내 조명 조건에서 플레이트 위에 카메라를 놓고 1시간 동안 플라나리아의 동작을 기록합니다. 골지 염색의 경우, 안락사된 플라나리아를 골지 염색 키트의 용액 A와 B를 일대일 혼합물로 채운 비커 또는 페트리 접시에 넣습니다.
다음 날, 플라나리아를 용액 A와 B의 새로운 혼합물로 채워진 새 비커로 옮기고, 용액에서 플라나리아를 제거하고 다른 비커의 용액 C에 놓습니다. 다음 날 용액 C를 교체한 후, 플라나리아를 용액 C에서 최소 72시간, 최대 1주일 동안 그대로 두십시오. 이송 피펫을 사용하여 용액 C에서 플라나리아를 제거하고 척에 소량의 OCT 화합물을 삽입합니다. OCT 화합물로 조심스럽게 둘러싸고, 섭씨 영하 24도로 설정된 저온 유지 장치를 사용하여 내장된 플라나리아를 5마이크로미터 섹션으로 가로로 자릅니다.
전사 피펫을 사용하여 플라나리아 절편을 젤라틴으로 코팅된 슬라이드에 C.C.Let in dark in room temperature in room temperature(최대 3일 동안 건조)로 장착합니다. 슬라이드를 더럽히려면 염색 및 세척 용액에 순차적으로 담그십시오. 명시야 현미경으로 관찰하기 전에 조직학적 장착 매체와 커버 슬립을 사용하여 슬라이드를 덮습니다.
1-6 밀리몰 pilocarpine으로 처리 된 Dugesia dorotocephala를 얻습니다. 플라나리아를 안락사시킨 후 최소 24시간 동안 4%파라포름알데히드에 넣습니다. 다음으로, 플라나리아를 20%슈크로오스로 옮기고 용액에 하루 동안 그대로 둡니다.
PBS에서 각각 5분씩 3-4회 헹굽니다. 세척 후에는 얼룩이 질 준비가 될 때까지 보관하기 위해 신선한 20% 자당으로 옮깁니다. 이제 특정 시간 동안 적절한 솔루션에 플라나리아를 순차적으로 배치합니다.
다음으로, 분유로 플라나리아를 1시간 동안 막고 1차 항체 용액에서 섭씨 4도에서 밤새 튜브를 배양합니다. 다음 날, PBS에서 플라나리아를 10분 동안 헹굽니다. 염소 항-마우스 IgG 2차 항체를 PBS에서 밀리리터당 1마이크로그램으로 희석하고 플라나리아 튜브에 항체 용액을 실온에서 밤새 배양합니다.
세척 후 슬라이드에 플라나리아 전체를 장착하십시오. 커버 슬립으로 벌레를 덮으십시오. 수성 장착 매체로 밀봉하고 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰하십시오.
먼저 골지체와 면역염색 후 플라나리아의 이미지를 얻습니다. 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 애플리케이션을 실행하고 애플리케이션에 color deconvolution2 jar 플러그인을 설치합니다. 분석할 이미지를 선택하고 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 애플리케이션으로 드래그합니다.
이미지 탭으로 이동하여 색상을 클릭하고 색상 deconvolution2 버전 2.1을 선택합니다. 벡터 옵션에서 H DAB를 클릭하고 출력 옵션에서 8비트 투과율을 클릭합니다. 색상 3에 대한 제품 간 시뮬레이션된 LUTs, 행렬 표시 및 범례 숨기기가 모두 선택되어 있는지 확인한 다음 확인을 클릭합니다.
흑백 이미지를 선택하여 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 응용 프로그램이 효과적으로 분석할 수 있는지 확인합니다. 이제 이미지 탭으로 이동합니다. adjust(조정)를 클릭하고 threshold(임계값)를 선택합니다.
DAB 염색 또는 전경이 흰색 배경으로 읽히도록 임계값을 조정합니다. analyze(분석)를 클릭한 다음 측정값을 설정합니다. 영역, 최소 및 최대 회색 값, 임계값 제한, 표시 레이블, 중앙값 및 평균 회색 값을 선택하고 확인을 클릭합니다.
그런 다음 analyze(분석)를 클릭한 다음 measure(측정값)를 클릭하여 결과를 얻습니다. 마지막으로 결과 이미지를 클릭한 다음 파일을 클릭하고 다른 이름으로 저장을 선택하여 결과를 저장합니다. 진동과 플릭은 대조군과 비교하여 6밀리몰, 필로카르핀 처리된 플라나리아에서 증가되었습니다.
3밀리몰 필로카르핀에 노출된 플라나리아는 대조군에 비해 우물 중앙에서 훨씬 더 많은 시간을 보냈습니다. 6밀리몰 필로카르핀으로 처리된 플라나리아는 대조군과 3밀리몰 그룹보다 주변에서 더 많은 시간을 보냈습니다. 6밀리몰 필로카르핀 치료는 대조군에 비해 신경 구조의 수를 유의하게 감소시켰다.
