Il nostro laboratorio si sta concentrando sulle basi e sulle neuroscienze traslazionali. Sta combinando solide basi nella ricerca sull'epilessia con approcci innovativi nella neuroprotezione, nella neuroinfiammazione e nella neurorigenerazione. La combinazione di intelligenza artificiale, macchina E avanzata e strumento genetico con modelli innovativi, come i dispositivi di neuromodulazione Planaria, promette di trasformare il panorama per studiare i meccanismi di crisi epilettici di base.
I modelli sperimentali di crisi epilettiche sono molto preziosi per comprendere i meccanismi dell'epilessia e testare potenziali terapie. Tuttavia, persistono diverse sfide che limitano il loro impatto traslazionale a causa della limitata comprensione della biologia delle convulsioni, della complessità dei meccanismi di crisi umane e minime nei modelli di invertebrati, del limite di protocolli standardizzati per il comportamento e le risposte neurofisiologiche e dell'efficacia dei farmaci in diversi modelli. Una lacuna che stiamo affrontando è la relazione tra il comportamento dose-dipendente, indotto da planarie pilocarpina e i successivi cambiamenti nel loro sistema nervoso visualizzati istologicamente con tecniche di immunofluorescenza e colorazione del golgi.
Le planarie fungono da modelli economici ed eticamente favorevoli per le crisi sperimentali. A differenza di altri invertebrati o pesci zebra, le planarie rigenerano i neuroni e mostrano diversi fenotipi comportamentali che ne aumentano il valore per i test antiepilettici. La loro semplicità e la conservazione dei meccanismi neurologici fanno da ponte tra la ricerca di base e gli studi sull'epilessia traslazionale.
Le planarie fungono da modelli convulsivi a causa della loro encefalizzazione a simmetria bilaterale, conservano i sistemi di neurotrasmettitori e la sensibilità agli agenti neurotossici e proconvulsivanti. Questo modello versatile collega i modelli di epilessia degli invertebrati e dei mammiferi, facendo progredire la ricerca traslazionale e gli sforzi di scoperta di farmaci antiepilettici. I risultati ispirano domande che indagano i meccanismi rigenerativi neuronali indotti dalle convulsioni, i cambiamenti della connettività neuronale, la più ampia ricerca sulla neurotossicità, la conservazione genetica e i farmaci dopo le convulsioni e le planarie del comportamento sociale per studiare la comorbilità dell'epilessia.
Per iniziare, preparare due soluzioni di pilocarpina a concentrazioni di uno e due millimolari disciolte in acqua di sorgente. Pipettare tre millilitri di ciascuna soluzione in file separate di una piastra a 4 x 3 pozzetti. Tagliare la punta di una pipetta per rendere l'apertura abbastanza grande da contenere la planaria senza causare danni.
Utilizzando una pipetta di trasferimento con la punta tagliata, posizionare una Dugesia dorotocephala di due settimane allevata in laboratorio in ciascuno dei 12 pozzetti. Posizionare una telecamera sopra la piastra in normali condizioni di illuminazione interna e registrare il comportamento della planaria per un'ora. Per la colorazione del golgi, posizionare la planaria eutanasia in un bicchiere o in una capsula di Petri riempita con una miscela uno a uno delle soluzioni A e B del kit di colorazione del golgi.
Il giorno seguente, trasferire le planarie in un nuovo becher riempito con una miscela fresca di soluzioni A e B. Togliere le planarie dalla soluzione e metterle nella soluzione C in un altro becher. Dopo aver sostituito la soluzione C il giorno seguente, lasciare riposare la planaria per un minimo di 72 ore e fino a una settimana nella soluzione C.Utilizzando una pipetta di trasferimento, rimuovere la planaria dalla soluzione C e incorporarla in una piccola quantità di composto OCT su un mandrino. Circondali accuratamente con il composto OCT e taglia trasversalmente le planarie incorporate in sezioni di cinque micrometri usando una macchina criostatica impostata a meno 24 gradi Celsius.
Utilizzando una pipetta di trasferimento, montare le sezioni di planaria su vetrini rivestiti di gelatina con la soluzione C.Lasciare asciugare i vetrini al buio a temperatura ambiente per un massimo di tre giorni. Per colorare i vetrini, immergerli in sequenza in soluzioni coloranti e di lavaggio. Coprire i vetrini utilizzando il mezzo di montaggio istologico e un vetrino coprioggetti prima di osservarli al microscopio a campo chiaro.
Ottenere Dugesia dorotocephala trattata con pilocarpina da uno a sei millimolari. Dopo che le planarie sono state soppresse, immergerle in paraformaldeide al 4% per almeno 24 ore. Successivamente, trasferisci le planarie al 20% di saccarosio e lasciale nella soluzione per un giorno.
Sciacquali tre o quattro volte in PBS per cinque minuti ciascuno. Dopo il lavaggio, trasferirli in saccarosio fresco al 20% per la conservazione fino al momento di macchiare. Ora, posiziona la planaria in sequenza nelle soluzioni appropriate per un tempo specifico.
Successivamente, bloccare la planaria per un'ora con latte in polvere e incubare la provetta per una notte a quattro gradi Celsius nella soluzione di anticorpi primari. Il giorno seguente, sciacquare la planaria in PBS per 10 minuti. Diluire l'anticorpo secondario IgG anti-topo di capra a un microgrammo per millilitro in PBS e incubare la provetta planaria con la soluzione anticorpale per una notte a temperatura ambiente.
Dopo il lavaggio, montare l'intera planaria sul vetrino. Copri i vermi con un vetrino coprioggetti. Sigillarli con un mezzo di montaggio acquoso e osservare il vetrino al microscopio a fluorescenza.
Per iniziare, ottenere immagini di planaria dopo il golgi e l'immunocolorazione. Avvia l'applicazione software di analisi delle immagini open source e installa il plug-in jar color deconvolution2 nell'applicazione. Seleziona l'immagine da analizzare e trascinala nell'applicazione software di analisi delle immagini open source.
Vai alla scheda immagine, fai clic su Colore e seleziona Color Deconvolution2 versione 2.1. Nell'opzione vettori, fare clic su H DAB e nell'opzione di output, fare clic su Trasmittanza a 8 bit. Assicurati che le LUT simulate incrociano il prodotto per il colore 3, mostra matrici e nascondi legenda siano tutte selezionate, quindi fai clic su OK.
Seleziona l'immagine in bianco e nero per confermare che l'applicazione software di analisi delle immagini open source è in grado di analizzarla in modo efficace. Ora vai alla scheda dell'immagine. Fare clic su Regola e selezionare la soglia.
Regolare la soglia in modo che la colorazione DAB o il primo piano vengano letti con uno sfondo bianco. Fare clic su Analizza, quindi impostare le misurazioni. Selezionare l'area, il valore di grigio minimo e massimo, il limite alla soglia, l'etichetta di visualizzazione, la mediana e il valore medio di grigio e fare clic su OK.
Quindi fare clic su analizza seguito da misura per ottenere i risultati. Infine, fai clic sull'immagine dei risultati, quindi fai clic su file e seleziona Salva con nome per salvare i risultati. Le oscillazioni e i movimenti sono stati aumentati nelle planarie a sei millimolari, trattate con pilocarpina, rispetto al controllo.
Le planarie esposte a pilocarpina a tre millimolari hanno trascorso molto più tempo al centro dei pozzetti rispetto al gruppo di controllo. Le planarie trattate con pilocarpina a sei millimolari hanno trascorso più tempo nel perimetro rispetto ai gruppi di controllo e a tre millimolari. Il trattamento con pilocarpina a sei millimolari ha ridotto significativamente il numero di strutture neurali rispetto al controllo.
