يركز المختبر الخارجي على الأساسيات وعلم الأعصاب الانتقالي. إنه يجمع بين الأساس القوي في أبحاث الصرع والأساليب المبتكرة في الحماية العصبية والالتهابات العصبية والتجديد العصبي. إن الجمع بين الذكاء الاصطناعي وآلة E المتقدمة وأداة علم الوراثة مع النماذج المبتكرة ، مثل أجهزة التعديل العصبي Planaria يبشر بتحويل المشهد لدراسة آليات النوبات الأساسية.
تعتبر نماذج النوبات التجريبية ذات قيمة كبيرة لفهم آليات الصرع واختبار العلاجات المحتملة. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من التحديات التي تقيد تأثيرها الانتقالي بسبب الفهم المحدود لبيولوجيا النوبات ، وتعقيد آليات النوبات البشرية والحد الأدنى من النوبات في نماذج اللافقاريات ، وحدود البروتوكولات الموحدة للسلوك والاستجابات الفيزيولوجية العصبية وفعالية الدواء عبر نماذج مختلفة. الفجوة التي نعالجها هي العلاقة بين سلوك بلاناريا المعتمد على الجرعة والذي يسببه بيلوكاربين والتغيرات اللاحقة في نظامهم العصبي تتصور نسيجيا باستخدام تقنيات الفلورسنت المناعي وتلوين جولجي.
تعمل المستويات كنماذج فعالة من حيث التكلفة ومواتية أخلاقيا للنوبات التجريبية. على عكس اللافقاريات الأخرى أو أسماك الحمار الوحشي ، يجدد المستويين الخلايا العصبية وتظهر أنماطا ظاهرية سلوكية مختلفة تعزز قيمتها لاختبار الأدوية المضادة للنوبات. بساطتها والحفاظ على الآليات العصبية تربط بين البحوث الأساسية ودراسات الصرع الانتقالية.
تعمل المستويئات كنماذج للنوبات بسبب التناظر الثنائي والدماغ ، والحفاظ على أنظمة الناقلات العصبية ، والحساسية للعوامل السامة للأعصاب والعوامل المسببة للاختلاج. يربط هذا النموذج متعدد الاستخدامات بين نماذج الصرع اللافقارية والثدييات ، مما يعزز الأبحاث الانتقالية وجهود اكتشاف الأدوية المضادة للنوبات. تلهم النتائج أسئلة تبحث في آليات تجديد الخلايا العصبية الناجمة عن النوبات ، وتغيرات الاتصال العصبي ، وأبحاث السمية العصبية الأوسع نطاقا ، والحفظ الجيني والأدوية بعد النوبات ، والسلوك الاجتماعي المسطح لدراسة الاعتلال المشترك للصرع.
للبدء ، قم بإعداد محلولين من البيلوكاربين بتركيزات واحد واثنين من الضواحك المذابة في مياه الينابيع. ماصة ثلاثة ملليلتر من كل محلول في صفوف منفصلة من صفيحة بئر 4 × 3. قم بقص طرف الماصة لجعل الفتحة كبيرة بما يكفي لتناسب البلاناريا دون التسبب في تلف.
باستخدام ماصة نقل ذات طرف مقطوع ، ضع ماصة Dugesia dorotocephala التي يتم تربيتها في المختبر وعمرها أسبوعان في كل من الآبار ال 12. ضع الكاميرا فوق اللوحة في ظل ظروف الإضاءة الداخلية العادية وسجل سلوك البلاناريا لمدة ساعة واحدة. لتلوين جولجي ، ضع بلاناريا القتل الرحيم في دورق أو طبق بتري مملوء بمزيج واحد لواحد من المحاليل A و B من مجموعة بقع golgi.
في اليوم التالي ، انقل البلاناريا إلى دورق جديد مملوء بمزيج جديد من المحاليل A و B.قم بإزالة البلاناريا من المحلول وضعها في المحلول C في دورق آخر. بعد استبدال المحلول C في اليوم التالي ، اترك البلاناريا لمدة لا تقل عن 72 ساعة وما يصل إلى أسبوع واحد في المحلول C. باستخدام ماصة النقل ، قم بإزالة المسطح من المحلول C وقم بتضمينه في كمية صغيرة من مركب OCT على ظرف قم بإحاطتها بعناية بمركب OCT ، وقم بتقطيع المستوية المدمجة بشكل عرضي إلى أقسام بحجم خمسة ميكرومتر باستخدام آلة ناظم التبريد مضبوطة على 24 درجة مئوية تحت الصفر.
باستخدام ماصة النقل ، قم بتركيب أقسام المسطح على شرائح مطلية بالجيلاتين باستخدام محلول C. لتلطيخ الشرائح ، اغمرها بالتتابع في محاليل التلوين والغسيل. قم بتغطية الشرائح باستخدام وسائط التثبيت النسيجية وزلة الغطاء قبل مراقبتها تحت مجهر المجال الساطع.
الحصول على Dugesia dorotocephala المعالجة بواحد إلى ستة مللي مولار بيلوكاربين. بعد القتل الرحيم للبلاناريا ، ضعها في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة على الأقل. بعد ذلك ، انقل البلاناريا إلى 20٪ سكروز واتركها في المحلول ليوم واحد.
اشطفها ثلاث إلى أربع مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل منها. بعد الغسيل ، انقلها إلى 20٪ سكروز طازج للتخزين حتى تصبح جاهزة للتلطيخ. الآن ، ضع السطح بالتتابع في الحلول المناسبة لفترة محددة.
بعد ذلك ، قم بسد البلاناريا لمدة ساعة واحدة بالحليب المجفف واحتضان الأنبوب طوال الليل عند أربع درجات مئوية في محلول الجسم المضاد الأساسي. في اليوم التالي ، اشطف بلاناريا في PBS لمدة 10 دقائق. قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي IgG للماعز المضاد للفأر إلى ميكروغرام واحد لكل مليلتر في PBS واحتضان أنبوب بلاناريا بمحلول الجسم المضاد طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
بعد الغسيل ، قم بتركيب البلاناريا بأكملها على الشريحة. قم بتغطية الديدان بقلة غطاء. قم بإغلاقها بوسائط تركيب مائية وراقب الشريحة تحت المجهر الفلوري.
للبدء ، احصل على صور من planaria بعد golgi والتلوين المناعي. قم بتشغيل تطبيق برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر وقم بتثبيت المكون الإضافي Color deconvolution2 jar في التطبيق. حدد الصورة المراد تحليلها واسحبها إلى تطبيق برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر.
انتقل إلى علامة تبويب الصورة ، وانقر فوق اللون ، وحدد اللون deconvolution2 الإصدار 2.1. في خيار المتجهات ، انقر فوق H DAB وفي خيار الإخراج ، انقر فوق نفاذية 8 بت. تأكد من تحديد جميع جداول البحث المتقاطعة للون 3 وإظهار المصفوفات وإخفاء وسيلة الإيضاح، ثم انقر فوق موافق.
حدد الصورة بالأبيض والأسود للتأكد من أن تطبيق برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر يمكنه تحليلها بشكل فعال. الآن ، انتقل إلى علامة تبويب الصورة. انقر فوق ضبط وحدد الحد.
اضبط العتبة بحيث تتم قراءة تلطيخ DAB أو المقدمة بخلفية بيضاء. انقر على تحليل ، ثم قم بتعيين القياسات. حدد المنطقة والحد الأدنى والحد الأقصى للقيمة الرمادية، والحد إلى الحد، واعرض التسمية، والمتوسط، ومتوسط القيمة الرمادية، وانقر فوق موافق.
ثم انقر فوق تحليل متبوعا بالقياس للحصول على النتائج. أخيرا ، انقر فوق صورة النتائج ، ثم انقر فوق ملف وحدد حفظ باسم لحفظ النتائج. زادت التذبذبات والنقرات في ستة ملليمولات ، مسطحة معالجة ببيلوكاربين مقارنة بالسيطرة.
أمضى Planaria المعرضون لثلاثة ملليمولار pilocarpine وقتا أطول بكثير في وسط الآبار مقارنة بالمجموعة الضابطة. قضى Planaria المعالج بستة ملليمولار pilocarpine وقتا أطول في المحيط من كل من المجموعة الضابطة والمجموعة الثلاثة ملليمولية. قلل علاج البيلوكاربين بمقدار ستة ملليمولار بشكل كبير من عدد الهياكل العصبية مقارنة بالسيطرة.
