인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양 (Isolation and culture of human adipose-derived stem cells with an innovative Xenogeneic-free method for human therapy)

인간 지방 유래 줄기 세포의 분리 및 시험관 내 확장을 위한 당사의 외인성 무함유 방법은 번역 적용을 고려할 때 세포 요법과 관련된 생물학적 안전성 문제에 대한 해답입니다. 당사의 격리 및 확장 방법은 복제가 간단하고 빠르며 기술 요구 사항이 적기 때문에 모든 사람에게 유용합니다. 말초 신경 복구를 위한 인간 지방 줄기 세포 기반 치료 전략을 조사합니다.

그러나 우리의 기술은 다양한 임상 연구 환경에서 새로운 지방 줄기 세포가 필요할 때 널리 적용될 수 있습니다. 우리는 더 쉬운 생산성을 보존하기 위해 단순하게 유지했습니다. 무균 상태는 수술실에서 세포 배양까지 주의 깊게 관찰해야 합니다.

시료 조작 및 파편화의 경우 미세 해부는 오염의 위험이 있습니다. 복부 성형 수술에서 지방 조직 샘플을 얻은 후 멸균 가위를 사용하여 약 1 평방 센티미터의 조각으로 자릅니다. 메스를 사용하여 각 조각을 더 작은 조각으로 해부하고 10cm 페트리 접시에 5 개의 조각을 분산시킵니다.

파편 부착의 경우 메스를 사용하여 플라스틱 표면에 절개를 만들고 각 파편을 끕니다. 부드럽게 10 밀리리터의 완전한 배양 배지를 첨가하여 모든 조각을 분리하지 않고 덮고 페트리 접시를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 배양합니다. 인간 지방 유래 줄기 세포(HASC)는 세포가 합류할 때까지 광학 현미경으로 매일 팽창을 모니터링합니다.

배지를 72시간마다 완전한 새 배지로 교체하여 세포 파편을 제거하고 첫 번째 계대까지 성장시킵니다. HASC 배양이 70-80 % 밀도에 도달하면 멸균 핀셋을 사용하여 모든 조직 조각을 제거하고 버립니다. 또한 HASC가 페트리 접시에서 분리되지 않도록 소진 된 매체를 버리십시오.

10 밀리리터의 PBS로 세포를 조심스럽게 씻으십시오. PBS를 제거한 후 동물성 트립신 1mg을 넣고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 광학 현미경으로 세포 분리를 확인하고 필요한 경우 2분 더 배양합니다.

셀 분리를 지지하려면 플라스틱 표면을 가볍게 두드리십시오. 2 밀리리터의 완전 배지를 첨가하여 트립신 작용을 중지하고 15 밀리리터 튜브에 모든 세포를 수집하십시오. 원심분리를 통해 나머지 트립신을 제거합니다.

상청액을 버린 후, 세포를 5밀리리터 완전 배지에 현탁시키고, 세포 현탁액을 새로운 T25 플라스크로 옮긴다. 냉동 보존을 위해 광학 현미경으로 세포 계수기를 사용하여 분리된 분리된 세포의 분취량을 계산합니다. 세포를 300G에서 5분 동안 원심분리합니다.

상청액을 버린 후, 세포를 밀리리터당 10배 내지 6번째 세포의 밀도로 동결 혼합물에 현탁시키고, 세포 현탁액 1밀리리터를 하나의 극저온 바이알에 옮긴다. 섭씨 영하 80도의 냉동 바이알을 분당 섭씨 1도 정도 낮추는 냉동 용기에 넣은 다음 냉동 바이알을 액체 질소로 옮겨 장기 보관합니다. 초기 클러스터 외관에서 HASC는 고전적인 스핀들 모양을 보였으며 FBS가 있는 대조군 셀에 비해 더 작고 길었습니다.

세포 면역 표현형은 두 보충제로 배양된 HASC 간에 유사한 것으로 나타났습니다. HASC의 80 내지 90% 이상이 CD73 및 CD105에 대해 양성이었고, CD34 및 CD45에 대해 5% 미만이 발현되었다. 마지막으로, 증식 분석은 FBS 대조군에 비해 인간 혈소판 용해물을 배지에 첨가했을 때 세포 성장의 현저한 증가를 나타냈다.

가장 중요한 단계는 지방 조각의 미세 해부와 페트리 접시에 메스 절개로 부착하는 것입니다. GMP 생물 안전성 기준에 따라 즉시 사용할 수 있는 인간 지방 유래 줄기 세포 집단을 획득하여 치료 세포 특성을 유지하고 세포 증식을 향상시킵니다.