저자 베 키 마르케스, Sentara Bariatric 센터 환자 검사 및 동의의 과정으로 그녀의 지원에 대 한 임상 코디네이터를 인정 하 고 싶습니다. 이 연구는 머 디 Dobrian에 R15HL114062에 의해 지원 되었다.

동부 버지니아에서 제도적 검토 보드 위원회 연구 및 연구에 사용 하는 인간 지방 조직 샘플의 수집을 승인 했다. 정보 서 면된 동의 환자에서 수집 되었다.
1. 버퍼, 미디어, 악기의 준비
<ol><li>Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered 솔루션 (KRBBS) 준비: 135 m m 염화 나트륨, 5 m m 염화 칼륨, 황산 마그네슘 1 m m, 0.4 m m 칼륨 인산 염 염기, 5.5 m m 포도 당, 1mm 아데노신, 0.01% 항생제/antimycotic 혼합 (50 µ g/mL의 페니실린, 스, gentamicin의 30 µ g/mL, 암포의 15 ng/mL의 50 µ g/mL)와 10 mM HEPES (pH = 7.4). 이 솔루션은 조직 수집 및 소화에 대 한 때마다 신선한 준비가 되어 있습니다.</li>
	<li>신선한 콜라 솔루션 준비: 1 mg/mL의 콜라, 입력 1, KRBSS; 3 mL/g의 지방 확인 합니다. 미리 따뜻한 조직 소화 전에 물 목욕에서 37 ° C에서 콜라 솔루션.</li>
	<li>CD34 셀 절연 버퍼 준비: 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 1 mM EDTA.</li>
	<li>지질 미디어 준비: DMEM/F12, 5 %FBS, 페니실린/스, 1.25 µ L/mL (5 µ g/mL 또는 144 mU/mL), 인간 인슐린의 2.8 m m rosiglitazone (1 µ M)의 0.36 µ L/mL의 50 µ g/mL.</li>
	<li>소 프로 파 놀의 100 mL으로 오로 0.3 g을 용 해 하 여 0.3% 기름 빨간 O (오로) 재고 솔루션 (무게/볼륨)를 준비 합니다.</li>
</ol>2. 지방 Stromal 혈관 분수 절연
참고: 연구 morbidly 비만 타입-2 당뇨병 (T2D)와 비 당뇨병 주제, 18-65 세는 Sentara 신진 대사 및 체중 손실 수술 센터 (Sentara 의료 그룹, 노퍽, 버지니아)에 bariatric 수술의 횡단면 일대를 포함. 배제 기준 포함 타입-1 당뇨병 mellitus, 만성 면역 치료, 항 염증 제 약물, thiazolinendiones, 활성 담배 사용, 만성 또는 급성 감염, 또는 역사를 요구 하는 조건을 포함 한 자가 면역 질환 악성의 지난 12 개월 내 처리. T2D는 단식 플라스마 포도 당 126 mg/dL 이상, 200 mg/dl 이상 2 시간 포도 당 내성 검사, 후 포도 당 또는 antidiabetic 약물의 사용으로 정의 되었다.
<ol><li>Bariatric 수술 인체에서 인간의 omental (OM) 및 피하 (SC) 지방이 많은 직물 (AT)를 수집 합니다.</li>
	<li>옴 및 사우스 캐롤라이나에 행 크의 버퍼링 소금 솔루션 페니실린/스 실 온에서의 50 µ g/mL를 포함 하는 조직 추출 후 즉시 별도 튜브 하십시오.</li>
	<li>신중 하 게 청소 하 고 샘플 조직 추출 후 실험실에 도착 하는 때 70% 에탄올 swabbed가 위, 핀셋을 사용 하 여 조직의 거리와 멎 섹션을 제거 합니다.</li>
	<li>It 5 g (또는 적은) aliquots 콜라 소화에 대 한 파티션 및 지방 조직 무게.</li>
	<li>정밀 하 게가 위의 두 쌍을 사용 하 여 실내 온도에, 섬광 유리병 콜라 솔루션의 5 mL에 AT의 5 g을 말하다.</li>
	<li>15 ml 총 다진된 조직에 콜라 솔루션의 추가 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>연속 떨고와 물 욕조에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 샘플을 소화.</li>
	<li>무뚝뚝한 끝을 20 mL 주사기에서 끝을 잘라.</li>
	<li>250 µ m 메쉬에서 9 cm x 9 cm 사각 고 무뚝뚝한 끝 주사기를 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브에 밀어 중간.</li>
	<li>20 mL 무뚝뚝한 끝 주사기와 소화 되지 않은 조직에서 adipocytes, 혈관 stromal 세포를 분리 하 50 mL 원뿔 튜브에 250 µ m 나일론 메쉬 통해 필터에 샘플을 부 어. 참고: 메쉬 초과 거리 소화 되지 않은 자료로 인해 막힌 얻을 것 이다으로 50 mL 원뿔 튜브, 당의 이상의 5 g를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>그리고 KRBBS의 10 mL와 함께 섬광 유리병 세척 후 잔류 세포를 수집 하는 필터를 통해 그것을 부 어.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 필터링 된 샘플을 품 어. 참고:이 단계는 adipocytes 플 로트 튜브의 하단에 정착 하는 튜브의 상단 및 stromal 혈관 세포의 일부에 대 한 허용 해야 합니다.</li>
	<li>20 mL 주사기 및 20 G x 6 pipetting 바늘 stromal 혈관 일부 레이어를 제거 하 고 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브에 전송에 이용 한다.</li>
	<li>KRBBS의 10 mL을 추가 하 고 샘플을 실 온에서 5 분 동안 벤치에 앉아 허용.</li>
	<li>2.12-2.14 단계를 두 번 반복 합니다. 참고:이 단계는 부동 adipocytes와 stromal 혈관 세포의 오염 없이 지킬 것 이다.</li>
	<li>다음 단계에 설명 된 대로 추가 처리를 위해 얼음에 두 플랫폼에서 stromal 혈관 분수를 유지. 참고: 두지 마십시오 셀 1 시간 이상에 대 한 얼음이 세포 생존 능력에 영향을 있을 수 있습니다. adipocytes 플래시-장기 저장을 위한 액체 질소에서 냉동 또는 신선한 실험을 위해 사용.</li>
</ol>3입니다. 지방 조직 내 피 세포의 고립
<ol><li>4 ° c.에 5 분 동안 500 x g 에서 stromal 혈관 분수 (SVF) 회전</li>
	<li>원심 분리기에서 샘플을 제거 하 고 상쾌한;에서 신중 하 게 부 어 SVF 셀을 포함 하는 펠 릿을 유지.</li>
	<li>부드럽게 PBS의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 참고: AT 센터의 5 g 이상의 여러 aliquots (단계 2.4 참조)으로 처리 된 경우 수영장 셀 펠 릿 함께.</li>
	<li>4 ° c.에 5 분 동안 500 x g 에서 샘플을 회전</li>
	<li>제거는 상쾌한, resuspend, PBS의 1 mL에 셀과 셀. 참고: 여기는 자동 셀 카운터 셀 계산을 위해 사용 되었다. 세포 생존 능력 acridine 오렌지/propidium 요오드 화물 (AO/PI) 솔루션의 12 µ L로 세포 현 탁 액의 12 µ L를 혼합 하 여 얻은 ( 재료의 표참조). 각 창 고에 대 한 AT의 그램 당 세포의 평균 수는: (a) 옴 창 고: 1.69 x 105 ± 4.51 x 104; (b) SC 서비스 센터: 105 ± 6.45 x 104x 1.24. 두 플랫폼에서 세포의 생존 능력은 > 90%.</li>
	<li>작은 샘플 500 x g 4 ° c.에 5 분에서 참고: CD34 immunomagnetic 선택 프로토콜 단계 3.7-3.15 적응 했다 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>CD34 절연 버퍼의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend. 참고: 총 셀 카운트 해야 다음 다시 서 스 펜 션 볼륨: (a) < 2 x 107 셀: 100 µ L;에서 펠 릿 resuspend (b) 2 108–5 x 108 셀 배: 1 mL에 펠 릿을 resuspend. 단계 3.9-3.16, 사용 시 약의 볼륨은 축소에 대 한 < 2 x 107 셀.</li>
	<li>CD34 칵테일의 10 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>마그네틱 구슬의 5 µ L을 추가 하 고 실 온에서 10 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>각 샘플을 CD34 절연 버퍼의 2.5 mL을 추가 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 자석으로 샘플을 배치.</li>
	<li>5 자석 반전 부 절연 버퍼 어 s.</li>
	<li>자석에서 샘플을 제거 하 고 3.10과 3.11 4 x 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>자석에서 튜브를 제거 하 고 CD34 절연 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 5 분 동안 500 x g 에서 셀 펠 렛</li>
	<li>CD34 절연 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend 및 셀. 참고: 여기, AT의 그램 당 세포의 평균 수는: (a) 옴 창 고: 4.75 x 104 ± 3.36 x 104; (b) SC 디포: 1.06 x 104 ± 9.53 x 103. CD31 플라스틱 immunobead 프로토콜 단계 3.16-3.34 ( 재료의 표참조)에 대 한 적응 했다.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g 에서 셀 작은 고 버퍼 b 250 µ L에 250 µ L 워시 버퍼의 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>철저 하 게 vortexing 튜브에 의해 CD31 구슬 resuspend.</li>
	<li>CD31 구슬의 20 µ L를 추가 합니다. 참고: 때문에 총 셀 계산 > 1 x 106, 볼륨 제조업체의 입력에 따라 축소 했습니다.</li>
	<li>실 온에서 30 분, 락과 샘플을 품 어.</li>
	<li>살 균 50 mL 원뿔 튜브에 스 트레이너를 연결 합니다. 참고: 위에 여과기의 더 큰 개통 되어야 합니다.</li>
	<li>셀 분리 이전 equilibrate는 여과기를 세척 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 단계 3.16는 여과기를 생성 된 혼합물을 적용 합니다.</li>
	<li>20 mL의 전체 볼륨에 대 한 원형 모션 워시 버퍼의 5 mL와 여과기를 세척. 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 커넥터를 연결 하 고 luer 잠금 닫습니다.</li>
	<li>커넥터는 여과기를 연결 합니다. 스 트레이너의 벽을 따라 워시 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 활성화 된 버퍼 D는 스 트레이너의 벽을 따라 1 mL를 추가 합니다. 샘플을 부드럽게 소용돌이 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>워시 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 10 배 아래로 pipetting으로 구슬에서 세포를 구분 합니다. 참고: 공기 거품을 생성 하지 마십시오.</li>
	<li>Luer 잠금 열고 50 mL 원뿔 관으로 흐름을 분리 된 세포를 허용 합니다. 스 트레이너 10 세척 세척 버퍼 각 시간의 1 mL x.</li>
	<li>커넥터와 여과기 취소 및 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 샘플을 원심 문화에 대 한 완전 한 EGM-2 미디어의 2 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 참고:이 시점에서의 그램 당 세포의 평균 수는: (a) 옴 창 고: 5.92 x 103 ± 4.27 x 103; (b) SC 디포: 4.12 x 103 ± 2.1 x 103. 두 플랫폼에서 셀의 90% 이상 이었다.</li>
</ol>4. 지질 격리 된 내 피 세포에서의 유도
<ol><li>37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 완전 한 EGM-2 미디어와 6 잘 조직 문화 취급 플레이트에 셀 성장. 대체 미디어 셀 80-90%의 합류를 도달할 때까지 매 3-4 일. 참고: 2-3 일 사이 배로 인구.</li>
	<li>100 mm 페 트리 접시에 그들을 도금 하 여 셀을 확장 하 고 1:3 번 셀을 분할. 이 단계에서 세포 통행 2에 있습니다.</li>
	<li>수 자동 셀을 사용 하 여 셀 카운터 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>6 잘 플레이트 각 서비스 센터와 문화 그들에 2 일 동안 EGM-2 미디어를 완료에 대 한 중복 우물 보장으로 씨 약 100-200, 000 셀입니다.</li>
	<li>어떤 성장 매체 떨어져 발음 하 고 5 %DMEM / F12의 2 mL FBS 50 µ g/mL 페니실린/스 컨트롤에 대 한 세포 및 지질 미디어 (단계 1.4 참조) 치료 세포의 2 mL와 함께 그것을 대체 하 고.</li>
	<li>37 ° c 습도 5%에서 세포를 품 어 CO2 인큐베이터 13 일에 대 한 대체 해당 미디어 매 3 ~ 4 일. 참고: 셀 치료의 4 일 후 지질 축적 시작 됩니다.</li>
	<li>오로 빨간 게시 방법15-17에 따라 얼룩 나 일을 수행 합니다.</li>
	<li>RNA 추출에 대 한 셀을, 6-잘 유도 오븐에서 미디어를 제거 하 고 살 균 PBS의 1 mL와 함께 그것을 씻어.</li>
	<li>Guanidium 안산 클로 페 놀 프롬-솔루션의 350 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 각 음을 5-10 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.</li>
	<li>셀 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 격판덮개 떨어져 긁 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 세포를 전송. 참고: 샘플 RNA 추출 및 추가 나중에 처리-80 ° C 냉동 실에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>적응된 RNA 추출을 사용 하 여 샘플에서 mRNA를 추출 ( 재료의 표참조) 프로토콜.</li>
	<li>실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 다음 프로브를 사용 하 여 유전자 발현을 평가 하기 위해 수행: adiponectin, UCP-1, 그리고 CIDEA ( 재료의 표참조). 참고: 여기, RT-PCR 절차 실행 되었다 다음과 같은 표준 프로토콜을 사용 하 여: 변성 (95 ° C, 15 s), 어 닐 링, 그리고 40 사이클에 대 한 확장 (60 ° C, 1 분). CT 값으로 유전자 표현 샘플 > 35 탐지 여겨졌다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 종이의 초점 절연, 확장 및 adipogenic CD34 + CD31 + 인간 지방 조직의 내장과 피하 창 고에서 내 피 세포의 유도 대 한 방법론을 제공 하는 것입니다.
설치류 또는 인간 CD31 항 체 붙일 표시 또는 자석 구슬18, 결합을 사용 하 여 주로 기법을 포함 하는 다양 한 혈관 침대에서 내 피 세포의 고립에 대 한 보고 된 방법론 19 , 20 , 21 , 22 , 23. 이러한 격리 기술의 보편적인 사용에 대 한 주요 도전 이며 다른 혈관 침대에서 내 피 세포 인구의 섬유 아 세포와 혈관 벽 세포 오염의 높은 위험. 그러나, 이러한 오염 방지 하려면 격리 기술의 상세 보고24되었습니다. 이러한 기술을 사용 하 여, 주로 성숙한 내 피 세포 조직 으로부터 격리 됩니다. 지방이 많은 직물 줄기/뿌리 세포, 내 피 창시자25,26등의 큰 저수지 이다. 몇 가지 서류 보고 CD34 + 및 CD31 + 항 체11,27의 조합을 사용 하 여 인간 지방 조직에서 내 피 세포의 정화. 두 개의 마커를 표현 하는 세포는 성숙한 내 피 세포와 내 피 창시자11,,2829의 혼합된 인구. 몇몇 최근 정액 종이 내 피 (CD31 +) 또는 벽화 (PDGFRβ +) 많은 맥 관 구조에 셀의 작은 하위 집합 체형 창시자5,30의 풍부한 원천이 있는지 보고 합니다. Adipogenic 잠재적으로 이러한 혈관 세포 흰색 또는 갈색/베이 지 adipocytes 생산할 수 있으며 많은 맥 관 구조5에서 활성 신생 연관. 이러한 연구 결과 비만 대사 성능 개선 및/또는 혈관 창시자에서 흰색 또는 thermogenic adipocytes를 생성 하 여 체중 감소를 유도 하는 새로운 치료 기회를 제공할 수 있습니다. 그것은, 그러므로, 간단 하 고 경제 고립, 확장, 및 인간 지방 조직에서 혈관 내 피 세포의 adipogenic 잠재력의 평가 위한 방법론을 식별 하는 관심의.
CD34 + CD31 + 인간의 피하 및 omental 내장 지방 조직 창 고에서 세포 그들의 신생 잠재력, 선 동적인 중개자의 생산, 그들의 노화 마커 및 기타 기능11 에 따라 이전 특징 이었다 , 그러나 31., 이러한 세포의 adipogenic 잠재력에 대 한 게시 된 증거가 있다. CD34 + CD31 + 자석 비즈를 사용 하 여 셀을 구분 하는 이전 게시 과목 (10 이상)11의 많은 수에서 풀링된 셀에서 데이터를 보고 합니다. 이 종이 보고 처음으로 성공적인 분리와 CD34 + CD31 + 피하 및 omental 저장소에서 단일 인간 기증자 로부터 세포의 확장에 대 한 프로토콜. 우리는 절연 하 고 작은 지방이 많은 직물의 2-3 g로에서 셀 확장. CD34 + CD31 + 셀 총 SVF 세포의 3-5%를 대표 하 고 표시 > 격리 후 90% 생존. 이러한 세포 높은 증식 되었고 다양 한 adipogenic 차별화 rosiglitazone와 인슐린 생체 외에서 자극 다음으로 응답을 보였다. 이전 연구는 adipogenic 응답4,32,,3334테스트에 지방 줄기 세포 또는 총 stromal 혈관 인간 지방 조직에서을 사용. 한 최근 연구에서 인간 지방 조직의 microvasculature 단일 셀 정지 사용 하지만 차별화 된 adipocytes 벽화 또는 자연3내 피 었는 지 분명 하지 않다.
CD34 + CD31 + cytometry 사용 하 여 셀의 추가 immunophenotyping CD45 및 CD24 마커 근원의 그들의 창 고에의 그들의 부족을 보여주었다. 중요 한 것은, 우리 문화, 3 구절 후 보여준 CD31 + CD34 + 세포 유지 acetylated LDL의 축적과는 체 외에서 튜브 대형 3D-매트릭스에 의해 입증 그들의 내 피 기능. 또한, 차별화 된 adipocytes 흰색과 베이 지/브라운 그들의 형태학 및 분자 마커, UCP-1 단백질 표정 등에 따라 셀의 혼합된 인구를 표현. 쥐에 있는 이전 연구 보여 지방 조직 맥 관 구조는 모두 흰색의 원천이 될 수 있습니다 갈색 adipocytes5,30 와 최신 데이터 화이트 하 고 기능적으로 차별화에 대해 비슷한 결과 보였다 인간의 많은 맥 관 구조3thermogenic 베이지색 셀.
체 외에창시자의 범위에서 체형 차별화에 대 한 여러 성분을 포함 하는 adipogenic 칵테일을 사용 하는 게시에 대 한 대부분와 달리 우리 rosiglitazone과 인슐린은 필요 하 고는 adipogenic에 대 한 충분 한 발견 CD34 + CD31 + 셀의 감 응 작용입니다. UCP-1 단백질을 포함 하 여 선택 셀에 식을 확인 성숙한 우리가 알고 그 rosiglitazone 혼자 비 지방 세포35, 팬-체형과 브라운/베이 지 체형에 대 한 분자 서명에서 지질 축적을 일으킬 수 있는 반면에, 차별화 된 셀 들의 체형 표현 형입니다. 우리의 2-성분 adipogenic 칵테일 절차 프로토콜을 단순화 하 고 더 저렴 하 게.
중요 한 관측 CD34 + CD31 + 세포의 adipogenic 응답 기증자 제목과 지방 창 고와 함께 매우 다양 했다. 지방 줄기 세포 또는 stromal 혈관 창시자의 왔다 adipogenic에 디포 차이점 보고 있지만 이전32,34, 같은 응답의 주제 다양성은 새로운 관찰 이다. 20 인간의 샘플의 분석, 3 사우스 캐롤라이나 및 7 옴 셀 adipogenic 유도에 응답 하지 않았습니다. 가장 강력한 응답을 보여주었다 > 응답 4 샘플에 대 한 유도에서 사우스 캐롤라이나 그리고 2 샘플 OM. 흥미롭게도 세포의 90%, 우리 있는 응답 부정적인 HbA1c와 상관 하는 에 대 한 응답으로 연결 되지 않습니다 체 외 미 분화 세포에서 인슐린 자극. 우리는 응답에서 차이 기술의 가난한 재현성 때문만 아니다 하지만 오히려 vivo에서 응답을 모방 하는 셀의 개별 지문 반영 논쟁. 이 차동 응답의 보존 필요 추가 유효성 검사 하 고 지질에서 vivo에서자극을 목적으로 대표 치료에 응답에 대 한 상대적으로 쉬운 검사 방법 수 있습니다. 잠재적인 adipogenic에서 개별 가변성의 소스를 더 이해 하기 추가 immunophenotyping은 특정 체형 조상 함수는 CD34 + CD31 + 인구 내의 셀 모집단을 식별 해야 합니다.
이 프로토콜의 제한의 일부 세포 인구;의 불완전 한 특성 포함 상대적으로 긴 확장 및 차별화 시간 (2 주 + 2 주); 인간의 샘플 및 갓 수집된 조직;의 즉각적인 처리에 대 한 필요성을 잠재적인 한계 그리고 차별화 된 셀에 대 한 기능 데이터의 현재 부족. 이 방법론의 재현성 및 하지 노동 집약적인 프로토콜;를 포함 하는 몇 가지 이점이 있다 셀 그 가능성이 유지 그들의 비보에 표현 형;의 지문 아주 적은 양의 상대적으로 낮은 비용; 조직에서 세포의 확장 cryopreserve 셀을 다시 문화;에 따라 그들의 adipogenic 서명 유지 가능성 그리고 미래의 심사 또는 다른 목적을 위해 사용할 수 있도록 이러한 셀의 저장소를 생성 하는 옵션.
이 프로토콜 CD34 + CD31 + 최종 결과로 얻은 세포 기계 연구와 목적을 심사에 대 한 변환 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

최근의 증거는 쥐와 인간에서 지방 조직 맥 관 구조에 있는 셀의 하위 집합 분화 될 수 있다 중 흰색 또는 베이지색/브라운 adipocytes1,2,3으로 보여줍니다. 이러한 세포의 표현 형은 내 피 세포, 평활 근/pericyte, 또는 중간 고기4,5,,67의 스펙트럼을 지 원하는 증거와 함께 논쟁의 주제 이다. 이 방법론을 개발의 범위 CD34 + CD31 + 비만 인간에서 다른 지방 저장소에서 분리 된 내 피 세포의 adipogenic 잠재력을 테스트 했다. 문학에서 다른 연구는 잠재적인 또는 알려진된 체형 창시자2,,89의 총 stromal 혈관 분수의 adipogenic에 초점을 맞추고. 현재 기존 기술 마약 배달10에 대 한 내 피 세포를 지방 조직 구체적으로 타겟팅 할 수 있습니다, adipogenic을 같은 세포의 잠재력을 이해 흰색 또는 베이지색 adipocytes 향해 유도 이므로 중요 한 미래 치료 대상.
다른 그룹 보고 인간 지방 조직11,,1213에서 내 피 세포를 분리 하는 대리 모 알선으로 CD31와 CD34 마커의 조합. 일반적으로, 고립 2 개의 일련의 단계와 긍정적인 선택 마그네틱 비즈를 사용 하 여 사용 하 여 수행 됩니다. 이 보고서에서 immunoseparation CD34 + 자석 구슬 CD31 플라스틱 구슬과 결합을 사용 하 여 이용 되었다. 우리는이 기술은 전형적인 조약돌 내 피 형태학의 보존에 관하여 순차적 자석 immunoseparation에 우수한 발견. 또한, 확장 및 adipogenic 유도에서 작은 지방 1-2 g로 시작에 필요한 충분 한 세포를 생성할 수 있었습니다. 피하 지방의 작은 샘플 생 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 셀의 필요한 수량을 생산 하기 위해 충분 하다. 이 점은 잠재적으로 중요 한 경우에 특히이 방법은 인체에 adipogenic 유도에 응답에 대 한 심사에 활용 됩니다.
다른 시스템과 달리 문학에서 보고,이 방법 활용 CD34 + CD31 + 세포의 adipogenic 유도 대 한만 두 재료: 가진 주 작동 근-rosiglitazone-및 인간의 인슐린. 중요 한 것은, 사용 하는 인슐린의 양을 순환 인간14post-absorptive 인슐린의 정상/높은 범위 내에서 넘어진다. 세포에는 생체 외에서Akt 인 산화에 의해 측정의 인슐린 응답의 정도 칵테일 유도에 대응 하는 능력 연결 되지 않습니다. 흥미롭게도,이 유도 칵테일 및 실험 조건을 사용 하 여, 흰색과 베이 지/브라운 셀의 혼합 얻은 했다 크기와 세포내 지질 방울과 분자 마커의 식의 숫자에 의해 결정 된 대로. 잠재적으로 차별화 된 베이지색의 균형을 변경할 수 있는 에이전트의 심사에 대 한 응답자 셀 (베이 지 화이트 대 )의 표현 형의 양적 평가 함께이 간단 하 고 비용 효율적인 유도 프로토콜 허용 : 화이트 adipocytes.
이 메서드는 또한 인간 지방 조직에서 혈관 내 피 창시자의 지질의 근본적인 메커니즘을 이해 하기 위한 변환 방법을 제공 합니다. 이 특정 격리/차별화 기술을 사용 하 여, 조사 야 위 고 뚱뚱한 인간의 다양 한 지방 창 고에서 책임 지질 혈관 내 피 세포의 하위 집합에 대 한 다양 한 경로 심문 수 있습니다.

isolation, expansion, and adipogenic induction of cd34+cd31+ endothelial cells from human omental and subcutaneous adipose tissue

비만 체형 비 통해 주로 지방 조직에의 개장 하는 광범위 한 함께 제공 됩니다. 극단적인 체형 성장 인슐린, 로컬 hypoxia, 그리고 염증에 빈약한 응답에 결과. 창시자에서 기능 흰색 adipocytes의 분화를 자극 하 여 체형 인구의 급진적인 비를 막을 수 있다, 따라서, 지방 조직의 대사 건강의 감소와 함께 향상 시킬 수 있습니다. 염증입니다. 또한, 베이 지/브라운 adipocytes의 분화를 자극 하 여 몸 전체 에너지 지출을 늘릴 수 있습니다, 체중 감소의 결과로. 이 이렇게 비만 공동 morbidities 2 형 당뇨병 및 심혈 관 질환 등의 개발을 방지할 수 있습니다.
이 종이 절연, 확장, 및 공동 CD31와 CD34 마커를 표현 하는 인간 지방 조직 내 피 세포의 부분 집합에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화에 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 상대적으로 저렴 하 고 노동 집약 되지 않습니다. 그것은 인간의 지방 조직에 대 한 액세스를 요구 한다 고 피하 디포 샘플링에 대 한 적합 합니다. 이 프로토콜에 대 한 병 적으로 뚱뚱한 주제에서 신선한 지방 조직 샘플 [신체 질량 지 수 (BMI) > 35] bariatric 수술 절차 동안 수집 됩니다. Stromal 혈관 분수에서 순차적 immunoseparation를 사용 하 여, 충분 한 셀에서 작은 지방의 2-3 g로 생산 됩니다. 이러한 세포 문화에 10-14 일 동안 확장 될 수 있다, cryopreserved 수 그리고 통로 5-6까지 뿌리고 그들의 adipogenic 속성을 유지 합니다. 세포는 adipogenic 칵테일 인간 인슐린의 조합과 가진 주 작동 근 rosiglitazone을 사용 하 여 14 일에 대 한 처리 됩니다.
이 방법론 지방 내 피 세포에서 adipogenic 응답을 드라이브 하는 분자 메커니즘에 대 한 개념 실험의 증거를 얻기 위해 사용할 수 있습니다 또는 심사는 adipogenic을 향상 시킬 수 있는 새로운 약물에 대 한 응답도 흰색으로 감독 또는 베이 지/브라운 체형 차별화입니다. 작은 피하 biopsies을 사용 하 여,이 방법론을 화면 베이 지/브라운과 흰색 adipocytes 비만 공동 morbidities의 치료에 대 한 자극을 목적으로 하는 임상 시험에 대 한 응답자 비 과목으로 사용할 수 있습니다.

우리의 프로토콜 CD34 + CD31 + 다른 플랫폼의 인간 지방 조직에서 혈관 세포의 adipogenic 잠재력을 결정 하기 위해 생체 외에서 접근을 제공 하는 것을 목표로. 간단한 순서도 다이어그램 그림 1A에 표시 됩니다. 셀을 표현 CD34의 긍정적인 선택을 사용 하 여 첫 번째 단계 갓 고립 된 세포 (그림 1A)의 인구에서 CD34 + 세포 > 95%에서에서 발생 합니다. 중요 한 것은,이 표식 셀 몇 구절에 대 한 교양 후 손실 됩니다. CD34 다양 한 조 혈 및 조 혈 비 창시자에 대 한 일반적인 표식 이므로, 내 피 창시자의 분리에 필요한 다음 단계는 CD31 + 셀 CD34 + 세포 인구 (그림 1A)의 긍정적인 선택 이다. CD31 내 피 세포에 대 한 표식 이지만, 그것은 또한 조 혈 모 세포의 하위 집합에 찾을 수 있습니다. 우리 cytometry에 의해 omental 및 피하 지방에서 여러 준비를 분석 하 고 일관 되 게 발견 CD34 + CD31 + 셀 CD45 마커 (그림 1B, 최고 패널)을 표현 하지 않습니다. 일반적으로, < 1% 총 셀 인구 CD45 양성 보였다. 이 결과 우리가 가능성이 사실상 조 혈 창시자의 무료 준비를 얻은 결론을 이끌었다. 세포 adipocyte 줄기 세포 표식 CD24 표현 경우를 확인 하려면 우리는 omental와 피하 저장소에서 세포를 분석 하 고 사실상 셀 omental 디포 (그림 1B, 하단 패널)의 5% 미만에서 CD24 마커를 표현 발견 셀 (표시 되지 않음) 피하 디포에 마커를 표현. 결론,이 분리 방법론을 사용 하 여 우리를 얻은 CD34 + CD31 + CD45-CD24-셀 omental와 피하 비만 과목의 플랫폼에서.
CD31 항 체로 활용 된 플라스틱 비즈를 사용 하 여, 셀 표시 CD31 항 체로 활용 된 자석 비즈를 사용 하 여 분리 반대 초기 구절 중 조약돌 내 피 형태를 표시 하는 셀을 얻은 우리는 스핀 들-모양 (그림 2A) 분리 직후 엽 형. CD34 + CD31 + 세포의 내 피 정체성을 입증할 추가, 하기 위해 두 기능 분석을 수행 했습니다: DiI-Ac-LDL의 통풍 관 및 지하실 멤브레인 매트릭스 (라고도 매트릭스 hereon) 형성 시험관튜브. CD34 + CD31 + 셀 DiI-Ac-LDL와 incubated 했다 고 대부분 셀의 통풍 관 (그림 1C)에 대 한 긍정적인 했다. 긍정적인 컨트롤로 사용 하는 상업적으로 사용할 수 있는 인간 지방 조직 microvascular 내 피 1 차 셀 라인 (HAMVEC) ( 재료의 표 및 그림 1C참조). 우리는 또한 CD34 + CD31 + 셀 3D-매트릭스에 자발적인 배 모양의 구조에서 생체 외에서형성 하는 이러한 세포의 기능을 결정 하 여 배양 후 그들의 내 피 기능을 유지 하는 여부를 테스트. 후에 3 구절, CD31 + CD34 + HAMVEC 기본 인간 내 피 세포 선 (그림 1D)에 비해 매트릭스에 양식 관 배 모양의 구조.
2-3 구절에 대 한 셀의 확장 후 우리는 EGM-2 완전 한 미디어와 5 %FBS, rosiglitazone (1µM) 인슐린 (144 mU/mL) 보충 DMEM/F12 미디어로 프로 신생 성장 인자를 포함 하는 세포 전환. EGM-2에서 셀 완료 미디어 극적으로 유지 그들의 adipogenic 차별화 감소. 또한, dexamethasone와 3-isobuthyl-1-methylxanthine 미디어의 속도 변경 하지 않은 그리고 지질 축적의 범위와 indomethacin의 현저 하 게 감소 지질 축적 (데이터 표시 되지 않음). 이러한 예비 실험을 바탕으로, 우리는 adipogenic 유도 rosiglitazone 및 인슐린 사용 하기로 결정 했다. 14 일 후 adipogenic 미디어에서 문화, 셀 고정 되었고, 기름 빨간 O와 스테인드 또는 나 일 빨강 및 핵 DAPI (그림 2B)와 counterstained 했다. 인물, 대표 이미지는 쌍된 피하 (사우스 캐롤라이나) (그림 2B, 최고 패널)의 37-45 k g/m2사이의 BMI와 3 명의 인체 omental (OM) (그림 2B, 하단 패널) 지방 조직에서 분리 하는 세포의 표시 됩니다. 유도에 응답 다릅니다 널리 저장소의 동일한 주제 및 주제 사이의 note 하시기 바랍니다. 그림 2B, 단원제의 (빨간색 화살표) 및 multilocular (흰색 화살표)의 혼합된 인구에 형광 이미지에서 보이는 것과 같이 포함 하는 지질 세포 뿐 아니라 지질 (노란색 화살표)를 축적 하지 않는 셀은 일반적으로 존재 한다. 이 셀의 숫자 사이의 비율 높은 변수 주제와 근원의 창 고 이기도합니다. 지질을 포함 하는의 비율의 정량화 (DAPI 스테인드 핵 기준) 총 세포에서 (기름 빨간 O 양성 기준)으로 셀 보였다 같은 SC와 옴 플랫폼 사이 상당한 차이가 개인, SC 창 고에서 셀 adipogenic 유도 (그림 2C)에 더 응답 하 게 되 고. 과목과 동일한 과목의 저장소 사이의 반응에 있는 성분에 대 한 설명이 명확 하지 않습니다. 그러나, 우리는 그 가능성이 vivo에서 표현 형/환경 및 가변성 때문 지문 격리 프로토콜에 전달 하는 세포 인구의 본질적인 성격 관련 추측 하고있다.
확인 하려면 셀 adipocytes 성숙 차별화를 받았다, 우리 adipogenic 유도 비해 13 일 후 팬 체형 마커 adiponectin 브라운/베이 지 마커 UCP-1 및 CIDEA 세포에서의 유전자 발현을 측정 취소 유도 제어 셀입니다. Adiponectin 식 컨트롤 (그림 2D)에 비해 차별화 된 셀에 10,000-fold까지 증가 되었다. CIDEA 및 UCP1 유전자 발현 (그림 2D) adipogenic 자극에 따라 세포에 감지만 했다. 특히, UCP-1 식 높은 변수, 화이트: 브라운의 다른 비율을 반영 했다 / 베이지색 셀 인구 내의 세포. 하우스키핑 유전자 RPL27의 식 CT 값은 18-20 주기 사이 샘플 사이 현저 하 게 일관 된 고 받았다 adipogenic 분화 세포 사이 큰 차이가 발견 됐다 고 치료 컨트롤입니다. 우리는 또한 미토 콘 드리 아 지역화 (그림 2E)를 제안 하는 punctated 패턴에서 다중 locular 표현 형을 표시 하는 셀에 UCP-1 단백질 식 감지. UCP-1 단백질은 탐지 가능한 지질 축적 하지 않은 셀 또는 다중 셀에 매우 작은 방울 가능성이 되지 않은 완전히 분화 adipocytes (그림 2E).
우리의 관측 CD34 + CD31 + 셀의 adipogenic 잠재적인 창 고 전용 이며 매우 다른 주제 사이 변수 BMI, 나이, 및 HbA1c 잠재적인 상관 관계에 대 한 추구 하 라는 메시지가 표시. 28 샘플 테스트, 사이 우리는 잠재적인 adipogenic 및 연령이 나 BMI; 사이의 모든 중요 한 상관 관계를 찾지 못했습니다. 그러나, 우리 옴 창 고 (그림 3A)에서 셀에 HbA1c와 지질 축적 사이 중요 한 부정적인 상관 관계를 발견 했다. 이 찾는 만성 hyperglycemic 환경과 잠재적인 링크 나타내며 미래 조사 가치가 있습니다. 이 또한 CD34 + CD31 + 셀 가능성이 수행 adipogenic 유도에 대응 하는 그들의 능력의 비보에 서명을 제안 합니다. 우리는 또한 이러한 세포 Akt 인 산화는 생체 외에서 인슐린 자극 다음의 가변 레벨 표시 표시 (그림 3B, 상단). 그러나,이 가변성에에서 기름 빨간 O 얼룩이 일치 샘플 (그림 3B, 아래)의 사진에 의해 그림과 같이 adipogenic 감 별 법을 자신의 능력으로 잘 연결 되지 않습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57804/57804fig1.jpg"> 그림 1: 분리와 CD34 + CD31 + 인간 지방 조직에서 세포의 특성. (A)이 순서도 다이어그램 격리와 차별화의 주요 단계를 보여 줍니다. CD34 자석 구슬를 사용 하 여 긍정적인 선택 후 > 두 번째 선택 단계 전에 갓 고립 된 세포의 95%는 CD34 +. (B) 이 대표적인 cytometry 보여준다 앞으로 살아있는 세포 인구; 문이 분산된 플롯 FITC (BluFl2) 채널; 흠 없는 샘플 그리고 위에 대표 omental 샘플의 CD45 얼룩. 아래와 같이 위에, 하지만 omental 샘플에서 CD24 (Alexafluor 647-표시) 셀에 대 한 동일한 시퀀스를 보여줍니다. (C)이 대표 현미경 CD34 + CD31 + 세포 생체 외에서 부 화 (상단 패널)의 4 h 다음 DiI-Ac-LDL의 통풍 관의 (빨간색)를 보여줍니다. 비슷한 글귀는 인간의 지방 조직 microvascular 내 피 세포 1 차 셀 라인 (HAMVEC) (하단 패널)에서 발견 되었다. DAPI 핵 파란색 표시 됩니다. (D)이 대표적인 현미경은 생체 외에서 튜브의 형성 CD34 + CD31 + 3D-매트릭스에 시드 셀을 표시 합니다. CD34 + CD31 + 셀 (통로 3) FITC calcein와 얼룩 다음 24-잘 접시에 시드 되었고 완전 한 내 피 세포 미디어에서 4 h에 대 한 인 큐베이 팅. 세포는 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 몇 군데 있었다. HAMVEC, 같은 밀도에서 시드 비교를 위해 사용 되었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57804/57804fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57804/57804fig2.jpg"> 그림 2: Adipogenic 유도 및 CD34 + CD31 + 셀의 마커. (A)이이 대표 현미경 표시 형태 론 적 차이 CD34 + CD31 + 셀 CD31 + 자석 구슬 대 CD31 + 플라스틱 구슬 긍정적인 선택을 사용 하 여 격리 합니다. 세포 격리 후 통로 1에 몇 군데 있었다. 사용 하는 배율 100 X입니다. (B) 이러한 패널은 기름 빨간 O 스테인드 CD34 + CD31 + 쌍된 피하 (SC) 및 3 다른 주제의 omental 내장 (OM) 샘플에서 세포의 대표적인 현미경. 셀 EGM-2 완전 한 미디어에 2-3 구절에 대 한 교양 했다 다음 5 %DMEM / F12 미디어 전환 FBS 및 14 일, 3 일 마다 교체 미디어 치료 인슐린 (144 mU/mL)와 rosiglitazone (1 µ M). 사용 하는 배율 100 X입니다. 대표 형광 이미지 adipo 빨간 지질 작은 물방울 (녹색)와 DAPI 핵 (파란색) 얼룩 보여줍니다. 단원제의 지질 (빨간색 화살표), multilocular 지질 작은 물방울 (흰색 화살표), 또는 아무 지질 축적 (노란색 화살표)를 표시 하는 셀을 포함 하는 셀의 혼합을 note 하시기 바랍니다. 사용 확대는 눈금 막대 X 200 = 50 µ m. (C)이이 패널 표시 adipogenic의 정량화 가능성으로 기름 빨간 O (오로) 긍정적인 세포 총 DAPI 스테인드 핵으로 정규화를 표현. CD34 + CD31 + 동일한 주제의 옴 및 SC 저장소에서 셀 표시 adipogenic에 상당한 차이 잠재적인 이점된 스튜던트 t-검정에 의해 (n = 7). (D) 성숙한 체형의 유전자 발현 마커 (adiponectin, UCP-1, 및 CIDEA) RT-PCR adipogenic 유도의 14 일 후 셀에 컨트롤 셀에 의해 측정 되었다. 데이터 배-adiponectin 유전자 발현에 대 한 변경 내용으로 표시 됩니다. CIDEA과 UCP-1의 식 컨트롤 샘플에서 감지 되지 않았습니다. 값은 내부 관리 유전자로 RPL27로 표준화 하는 ΔCt을 나타냅니다. 분석에 포함 된 모든 샘플에 대 한 18-20 주기 사이 했다 RLP27 CT 값 (n = 3-5 과목). 데이터는 ± sd. 의미 표현 짝된 스튜던트 t-검정은 데이터의 통계 분석을 위해 사용 되었다. p < 0.05 null 가설 거부. (E)이이 패널 CD34 + CD31 UCP-1의 단백질 표정에서는 + 인슐린과 rosiglitazone 유도의 13 일 후 세포. Immunocytochemistry 인간 polyclonal UCP-1 항 체를 사용 하 여 다중 locular adipocytes UCP-1의 선택적 식을 보였다. 탐지는 rhodamine 활용 된 이차 항 체 (빨간색)와 DAPI 핵 (블루)에 대 한 얼룩을 사용 하 여 달성 되었다. 삽입에 큰 확대는 세포 핵 (N)을 둘러싼 다양 한 크기의 여러 지질 방울 (LD) 뿐만 아니라 UCP-1 (빨간색 화살표)을 해당 punctated 빨간 신호를 보여준다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57804/57804fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57804/57804fig3.jpg"> 그림 3: Adipogenic 차별화, HbA1c 및 생체 외에서 인슐린 신호 사이 상관 관계가. (A) Spearman (비패라메트릭)와 옴 및 SC 셀에 대 한 피어슨 (파라메트릭) 상관 계수 각각 사용 HbA1c와 지질 축적 사이의 상관 관계를 결정 하기 위해 (n = 20). P 에 대 한 null 가설 거부 < 0.05. (B) 상단에, 서 부 럽 보여줍니다 phosphorylated Akt (녹색)와 총 Akt (레드) 식 CD34 + CD31 + 세포에 생체 외에서 adipogenic 유도 전에 30 분 동안 5 nM 인슐린 자극 (n = 8). 하단에는 기름 빨간 O 얼룩 14 일 adipogenic 유도 따라 동일한 셀의 표시 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57804/57804fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

isolation-expansion-adipogenic-induction-cd34-cd31-endothelial-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.7K 조회수.  Eastern Virginia Medical School. 지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

비디오: Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

연구

면역학 및 감염병학

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

선정 Plasmodium falciparum</em인간 두뇌 내피 세포 Cytoadhesion위한> 기생충

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Zoledronate를 사용하는 사람 말초혈의 확장 γδ T 세포

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

지방 조직 면역 세포의 분리

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

인간의 산모 - 태아 인터페이스에서 백혈구의 분리

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

아데노 바이러스에 감염된 정상적인 인간의 세포에서 바이러스 복제 구획 풍부한 하위 핵 분수의 분리

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of puberty - more than ten years after the establishment of systemic immune tolerance. Spermatogenic cells express a number of proteins that may be seen as non-self by the immune system. The testis must then be able to establish tolerance to these neo-antigens on the one hand but still be able to protect itself from infections and tumor development on the other hand. Therefore the testis is one of a few immune privileged sites in the body that tolerate foreign antigens without evoking a detrimental inflammatory immune response. Sertoli cells play a key role for the maintenance of this immune privileged environment of the testis and also prolong survival of cotransplanted cells in a foreign environment. Therefore primary Sertoli cells are an important tool for studying the immune privilege of the testis that cannot be easily replaced by established cell lines or other cellular models. Here we present a detailed and comprehensive protocol for the isolation of Sertoli cells - and peritubular cells if desired - from rat testes within a single day.

Primary Sertoli cells are required for studying testis-immune privilege, signal transduction during inflammation or infection, and utilization of their immunoprotective properties. Here we describe an enzyme-based protocol for the isolation of highly purified primary Sertoli cells and peritubular cells from rat testes.

쥐 고환의 세르 톨리 (Sertoli) 세포의 분리 및 세뇨관 세포

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

인간과 마우스 심근 표본에서 대식세포 하위 세트 및 기질 세포의 분리

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...