저자는 인정하고자하는 등 기술 된 프로토콜 및부터 ASC의 그 분리의 발전에 기여하는 추가 연구 인력 감사 : 박사 H. 피터 로렌스, MD, 박사 히로시 Muzuno, MD, 박사 제리 황, MD를 박사 아담 카츠, MD, 박사 윌리엄 푸트 렐, MD, 박사 룽 장, DDS, 박사, 박사 라리사로드 리 게스, MD, 박사 제니 알폰소, 박사, 박사 존 프레이저, 박사. 발표 결과는 NIAMS와 NIDCR 연구소를 포함하여 건강의 국립 연구소에서 연구 보조금에 의해 부분적으로 투자되었다.

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이 논문의 저자는 캘리포니아 대학의 리젠트과 Cytori 치료학 허가가 소유 한 특허의 공동 발명자이다.

부터 ASC의 절연을위한 지방 조직은 여러 가지 형태가 있습니다 : 주사기 추출 또는 흡입 보조 lipoplasty (즉, 지방 흡입) 중 하나를 통해 얻은 작은 조각으로 절제 또는 lipoplasty을 통해 얻은 조직의 단단한 조각에서. 충돌하는 연구는 16, 17를 제시 한 것처럼 더 SVF 세포 (이에부터 ASC)가 절제된 또는 흡입 지방 샘플에서 얻을 수 있는지 여부는 불분명하다. 그것은 지방 조직의 형태 중 하나는 한 운전자가 자신의 분리 기술에 실력으로 SVF 세포부터 ASC의 분리에 적합한보다 더 많은 것을 할 수있다. 그러나, 지방 흡입이 점에서 절제를 통해 이점을 보유하고 있는가 덜 침습적이며, 훨씬 적은 수술 치료가 필요합니다. 지방 흡입술의 유형과 같은 기술을 포함하여, 지난 십년 동안 증가하고 있지만, 초음파를 이용한 전력 보조 레이저를 이용한 지방 흡입 (18)은, 가장 일반적인 부어 오르는 지방 흡입 유지하는 지방 구획 (19)을 열망하기 전에 멸균 식염수, 마취제와 혈관 수 축제의 많은 양의 홍수입니다. 기술의 선택은 외과에서 외과 의사에 따라 다를 수 있습니다. 추출 수단은 연구원에 중요 보이지만 그러나, 기술은 ASC 번호 및 생존에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 예를 들어, 증가 지방 흡입 진공 압력에 부정적인 SVF 세포 수율 (20)에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, ASC 증식의 감소는 초음파를 이용한 지방 흡입 17에 측정되었다. 저장 온도는 SVF 생존과 최종 ASC 수율에 영향을 미칠 수 그러나 얻은 대기음 신속하게 처리해야한다. 마츠모토 등. 연구에 의하면이 대기음이보다 긴 24 시간 21 상온에서 저장되어있는 경우 ASC 수율이 감소하는 것으로 나타났습니다. 필요한 경우, 4 ° C에서 24 시간 저장은 해로운 효과없이 사용할 수있다이 저장 시간이 그 시점 이상으로 증가되는 경우 ASC 인구의 생물학적 특성에 관련된하지만, 다시, 세포 생존 능력이 감소 할 수 있습니다. lipoaspirate 가공의 용이성은 직접 전체적인 부피와 관련된다. 주사 추출을 통해 얻어진 작아 볼륨은, 가공이 비교적 용이하다. 그러나 지방 흡입을 통해 얻은 큰 볼륨 흡인은 실제 도전을 제시 할 수 있습니다. 대기음 볼륨이 크면 예를 들어, 세척 할 수 있도록 흡입 용기로부터 지방을 전사 같은 간단한 문제를 제시 할 수있다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 이러한 문제 중 일부를 완화하기위한 것입니다. 전반적으로,이 문서에서 설명하는 효소의 방법을 사용하여 lipoaspirates에서 ASC 인구의 분리는 지난 10 년 동안 크게 변경되지 않았습니다. lipoaspirates에서부터 ASC의 격리 자신의 설명에 우수 PubMed를 통해 사용할 수있는 다수의 프로토콜이 있습니다. 엠그 중 ost는 약간의 수정과 매우 유사한 프로토콜을 설명합니다. 기본적으로, lipoaspirate는 오염 물질의 세척, ASC 인구를 포함, SVF와 SVF를 해제하는 효소 분해, 원심 분리를 통해 수집된다. 대부분의 큰 볼륨 lipoaspirates는 진공 용기의 일부 유형에 도착 -의 구성은 외과에서 외과 의사에 따라 다를 수 있습니다. 제대로 바이오 안전성 후드에 배치하기 전에 청소를하지 않을 경우 컨테이너 자체가 오염의 원인이 될 수 있기 때문에이 프로토콜은, 세척하기 전에 큰 멸균 비이커에 대기음의 제거를 권장합니다. 성숙한 지방 세포의 용해, 중간 지방 층과 식염수 및 적혈구 오염의 하부층의 결과 베스트, 유층 일단 전사 및 중력 침강, 흡 인물은 세 개의 층으로 분리된다. 우리가 그 결과 세포 배양 (게시되지 않은 관찰)에 독성이있을 수 있습니다 것으로 나타났습니다과 오일 층이 제거되어야한다. 또한이 프로토COL은 생리 식염수와 적혈구의 infranatant 이전부터 ASC가 배양되면 적혈구 오염의 잠재적 인 수를 감소하기 위해 처음 세탁을 제거 할 것을 권장합니다. 그러나 프란시스 등.의 연구는이 infranatant도부터 ASC (22)의 원천이 될 수 있다는 것을 제안했다. 10 ㎖ 혈청 피펫의 사용이 infranatant의 제거가 상대적으로 쉽습니다. 남는 것은 다음 쉽게 멸균 PBS를 사용하여 세정하거나, 필요한 경우, 멸균 PBS 23-25 ​​오염의 가능성을 줄이기 위하여 항생제 및 항진균제로 보충 될 수 지방층이다. 세탁 후, 지방 조직은 효소 콜라게나 형식 IA의 살균 용액을 사용하여 소화한다. 이러한 동영상에 도시 밀리 포어 부로서 여과 장치의 사용은 무균 세척하고 지방 조직이 37 ℃에서 후속 수조 소화를 위해 첨가 될 수있는 밀폐 용기에 콜라게나 제를 필터링하는 편리한 수단을 결합한 사용 콜라게나 제의 유형은 콜라 형 IA 25, 24, 1 더욱 확산 될 수 겉으로으로 그룹에 그룹에서 변화하고있다. 그러나, 상업적으로 콜라게나 제의 11 개 이상의 서로 다른 종류의 제공, 특​​정 조직에 대한 소화 친화 각이있다. 지방 조직의 분해를 들어, 시그마 알드리치와 같은 회사는 콜라게나 유형 I 및 II를 추천하고 두 가지 유형이 아니라 오늘날의 문학 1, 24 ~ 27으로 표시됩니다. 원래 기사에서는 ZUK 등은. 0.075 % 1의 농도로 소 매체에서 콜라게나 유형 IA를 사용합니다. 그러나, 콜라게나 형식 IA의 대부분의 상용 소스는 이제 혐기성 박테리아 클로 스트 리듐 histolyticum 또는 E.에서 얻을 수 있습니다 대장균 유전자 C.로 수정 유전자를 histolyticum. 많은 기업들이 원유에서 황산 암모늄 침전으로 제조 된 것과 콜라게나 형식 IA의 수많은 준비를 제안한다.이 조브 문서에서 설명하는 프로토콜은 원유 유형뿐만 아니라 콜라게나 활동을 포함 IA 콜라게나 제의 준비뿐만 아니라 비 특정 단백질 분해 효소, clostripain 및 트립신 효소 활동을 사용합니다. 이러한 추가 효소가 소화 효율 28에 중요하지만, 거기에 원유 콜라게나 유형 IA 28, 29과 관련된 많은 가변성을 많이보고들이다 효율적인 소화 23을 얻기 위해 0.2 %까지 콜라게나 자신의 농도를 증가시킨다. 조질 콜라게나 분류 IA를 사용하는 그룹은 효소의 성능을 개선하고 지방 매트릭스 내 세포의 안정성을 증가시키기 위해 소 혈청 알부민 (0.1 ~ 1.0 %의 BSA)과의 보완을 추천한다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 소화 효율에 불리한 효과를 보완하지 않고 콜라게나 제를 사용 그러나, 이것은 필요하지 않을 수 있습니다. 이상의 정의 된 콜라게나 샘플을 사용하고자하는 사람들을 위해osition는 단백질 분해 효소의 정확한 조화와 함께 고순도 콜라게나 제를 포함하는 상용 소스를 사용할 수 있습니다. 이 제제는 클로스 트리 디움 콜라게나 유형 I 및 II 높은 활동과 같은 디스 파제와 서모으로 알려진 중성 프로테아제의 활동,와 조합을 정화. 콜라와 서모를 사용하여 효율적인 지방 소화 자카 등. (27)에 의해보고되었다. 이 작품과 일치, Pilgaard 등. (30)는 콜라와 서모 여러 혼합을 사용하여 뛰어난 소화 효율을보고합니다. 그러나, 그들은 콜라게나 제와 디스 파제의 준비를 사용하여 더 나은 소화 효율을 관찰 않습니다. 지방 조직에서 세포의 분리를위한 소화 시간이 연구에서 연구 결과에 따라 달라질 수 있습니다. 발표 된 많은 프로토콜은 1 ~ 2 시간 27, 30의 소화 시간을 권장합니다. 그러나, 과도한 분해 시간은 궁극적 가능한 AS의 개수에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인식하는 것이 중요하다CS 자신의 줄기 세포 표현형. Pilgaard와 동료는 37 ° C에서 2 시간의 소화는 소화, 과거 45 분을 소화으로, 매 15 분까지 2 시간의 최대 값을 관찰 할 것을 추천. 자카 등으로, 조직 분리 및 ASC 기능 (30) 사이의 최적의 균형을 제공하는 것을 확인할 지방 조직은보다 균일 한 모양 (27)을 취하면 정지된다. 우리는이 의견에 동의합니다. 그러나, 0.075-0.1 % 많아야 콜라게나 분류 IA 제제는 30-45 분에 lipoaspirates 대량의 소화 능력이 이들 배 세포의 충분한 수를 해방하기에 적절 있다는 것이 우리의 경험이다. 따라서,이 프로토콜은 30 분의 소화 시간을 권장합니다. 더 많은 시간이 필요한 경우 lipoaspirate의 일관성을 모니터링해야하고 lipoaspirate은 &quot;크림&quot;또는 &quot;짙은&quot;모양 (도 1)를 가정하면 소화 멈췄다. 일 회전자 소화 발표 SVF의 분리가 단순히 원심 분리를 사용하여 수행, 완료됩니다. 그러나, 흡인 압력처럼, 원심 분리의 실제 효과는 SVF 생존과 문화에 사용할 수부터 ASC의 수에 영향을 미칠 수 있습니다. 쿠 리타와 동료 (31)의 연구에 3,000 XG를 초과하는 속도는 ASC를 손상시킬 수있는 것으로 나타났습니다. 그러나 속도는 SVF의 적절한 펠렛을 보장 할만큼 중요 할 수 있어야합니다. 일반적으로,이 하나를 포함하여 대부분의 프로토콜은 1,200-1,500 × g으로의 원심 분리 속도를 권장합니다. 케어는 관계가 특정 원심 분리기 회 전자에 의존 한대로, 원심력 (G 측정) 및 (분당 회전 수로 측정) 원심 분리 속도 사이의 관계를 이해하기 위해 연구자가주의해야한다. 그러나, 원칙적으로, 예컨대 1200 XG 저급 원심력 종종 원심 분리 속도에 상당하고 안전하게 상호 교환 적으로 사용될 수있다. 다음 회전, 여러 디오일 및 &quot;무성&quot;백색 지방 세포, 중간 콜라게나 층과 세포 펠렛의 상부층 : stinct 층을 원심 분리 튜브 (도 1)에서 관찰된다. 부터 ASC를 포함하는, 적혈구의 상부 층과 하부 백색 SVF 펠릿 : 펠릿 자체는 두 개의 별개의 층을 가질 수있다. 오일이 세포 배양에 독성이있을 수 있으며, 지방 세포가 다시 원시적 인 세포 유형 32 탈분화 할 수있는 것으로 표시되었습니다으로이 프로토콜은, 석유와 지방 세포의주의 열망을 권장합니다. 그러나 이러한 지방 세포는 필요한 경우이 시점에서 수확 할 수있다. 때문에 이러한 오염 물질이 프로토콜은 적절한 제거를 보장하기 위해 별도의 세척 단계를 권장합니다. 이 단계는 연구자가 여과 이후의 편의를 위해 여러 SVF 알약을 결합 할 수 있습니다. 여과에 의한 섬유 성 물질의 큰 조각 소화 다음 세포 응집체의 존재를 필요가있을 가능성이 높다. 이러한 자료는 쉽게 제거된다70 또는 100 μm의 메쉬 필터를 통해 간단한 중력 기반 여과를 통해. 여액의 분취 원한다면 유핵 세포의 수와 ASC 부착 및 확장 도금 남은 여액을 계산하기 위해 취해질 수있다. 가능한 한 많은 적혈구를 제거하는 근면 한 시도에도 불구하고, 더 ASC 준비 RBC 오염없이 완전히되지 않습니다. 우리의 원래 기사에서는, 우리는 160 밀리미터 NH 4 망할 CIA의 저장성 용액에 펠릿의 재 부유를 통해 이러한 적혈구의 제거를 제안했다. 이후 격리 기사의 대부분은이 단계를 포함 손질 멸균 물을 사용하는 경우주의해야하지만 SVF 세포가 노출되는 시간을 최소화하기 위해, NH 4 CL-기반 솔루션 또는 멸균 22 ~ 24, 27, 33의 사용을 권장 저장성 용액 27. 적혈구는 비 부착 세포 집단이며 쉽게의 하룻밤 배양 다음 제거 될 수있다 그러나,이 단계는 필요하지 않을 수도ASC 인구. 기껏 일화 동안 또한, 이러한 적혈구는 결과 자기편 세포 (ZUK, 게시되지 않은 관찰)의 초기 확장을 개선하기 위해 나타납니다. 이와 같이,이 프로토콜은 RBC 용해 단계를 제거하고 초기 ASC 배양은 배양 배지의 변경없이 제 3 ~ 4 일이 적혈구의 존재 하에서 확장하도록 허용 할 것을 제안한다. 이 관찰에 대한 이유는 혈액 세포를 오염시키는 주변 분비 신호의 일부 유형에 의한 수 있거나 단순히 인해 RBC 용해 공정의 배제와보다 나은 생존 능력 일 수있다. 이 후, 온화 멸균 1X PBS로 플레이트를 세척하여 배양 배지를 흡인 할 수 있고, 적혈구의 대부분이 제거. 시간이 지남에 따라, 남아있는 적혈구는 결국 죽게되고 문화에서 제거 될 수있다. 자카와 Boquest에 의한 연구는 재 부유 SVF 펠렛 25-50 %의 조직 문화에 플라스틱 23, 27를 준수 것으로 추정했다. 그 결과 &quot;통로 0&quot;ASC 세제곱ltures 기원에서 내피로 제안부터 ASC 더 불규칙한 모양의 세포로 생각 작고 둥근 세포로 구성된 이기종입니다. 우리 등 많은 연구 그룹에 의해 그러한 SMCS, 조혈 세포 및 ASC 배양 한 섬유 아세포 등의 세포 유형을 오염의 부재를 확인하는 동안, 부가적인 세포 유형의 존재를 배제 할 수 없다. . 사실, Tallone는 등 통로 0 문화를 특징으로하고 뚜렷한 인구 관찰 : 1) 작고 둥근 빠르게 갱신 세포를, 2) ASC 것으로 생각 스핀들 모양의 섬유 아세포의 세포는, 3) 천천히 대형 세포를 복제하는 것은 더욱 제한 가능성 (즉, 사전에 지방 세포) 및 통로 (34)와 함께 손실됩니다 4) 입방 내피 세포. 후속 연구는 라운드 빠르게 경신 세포 집단이 높은 multipotentiality을 가지고 있다는 것을 보여 전형적인 줄기 세포 마커 (35, 36)을 표현 하였다. 또한, 그들은 인해 &quot;상체&quot;를 형성 할 수있다자신의 빠른 증식과 자주 스핀들 모양의 섬유 아 세포에 의해 둘러싸여있다. 따라서, 그것은 위의 제안 스핀들 모양의 ASC 인구가 이들 세포에서 발생한 수있다. 이러한 통로 0 ASC 문화의 초기 확장에 따라, 그것은 결과 문화가 더 섬유 아세포, 균일 한 성분을 가정으로, 시간이 지남에 따라 계속 배양은 ASC를위한 선택이라고 생각합니다. 그러나, 오염 세포의 잔재가 완전히 따라서 ASC 인구는 여전히 이질적인 고려되어야한다, 배제 할 수 없습니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 저렴하고 간단하며 일반적으로 조직 문화 시설에없는 장비의 조각을 필요로하지 않지만, 이러한 시설을 필요로하는 단점을 가지고있다. 많은 연구가 동물 모델을 통해부터 ASC의 번역 응용 프로그램을 조사하고 ASC를 사용하여 임상 연구가 나타나기 시작했다 (검토를 위해 4 참조 </s까지&gt;). 그러나, 그들의 유틸리티 ASC를 얻기 위해 OR로부터 lipoaspirate를 제거 할 필요성에 의해 제한된다. 이에 대한 응답으로, 할 수있는 폐쇄 형 시스템의 무균 수술실에서 직접 지방 조직에서부터 ASC를 분리 개발에 대한 요구가 있었다. 이러한 시스템은 수동 조작자로부터 최소 입력으로, 속도 및 일관성의 장점을 제공한다. 동반자 기사에서 우리는 자동화 된 시스템을 사용하는 방법을 설명하고 수동 분리 기술의 그것의 유틸리티를 비교 할 계획입니다.

2001에서, 지방 조직에서 다 능성 줄기 세포의 추정 인구는 저널 조직 공학 1에 기재 하였다. 이 세포는 성형 수술을 통해 얻은 처리 lipoaspirate 조직에서 자신의 유도에 의한 이름 가공 Lipoaspirate 또는 PLA 세포를 부여했다. 이 문서에서 설명하는 분리 방법은 지방 조직 2의 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리에 대한 기존의 효소 전략을 기반으로했다. SVF는 조직 배양 기판 (2, 3)에 밀착 아직 적혈구 세포, 섬유 아세포, 내피 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포와 전 지방 세포의 최소 처리 인구로서 정의되었다. 시간이 지남에 따라이 SVF의 배양은 이러한 오염 된 세포 집단의 대부분을 제거하고 부착 성, 섬유 아세포의 집단 발생하는 것이 제안된다. 이러한 섬유 아 세포는 미리 것으로 지난 40 년 동안 문헌에서 확인 된지방 세포. 그러나, 우리의 연구 그룹은이 세포가 중배엽 다 능성을 보유하고 PLA 세포로 부착 SVF 인구 이름 것​​을 보여 주었다. 많은 다른 연구 그룹에 의해 후속 연구 (리뷰가 4 참조) 내배엽과 외배엽의 잠재력을 모두 제안하고,이 잠재력을 추가했습니다. 그 이후로,이 세포에 대한 많은 추가적인 조건이 문헌에 등장했다. 컨센서스의 일부 유형을 제공하기 위하여, 용어 지방 - 유래 줄기 세포 또는부터 ASC는 2 차 연례 IFATS 회의에서 채택되었다. 따라서, 용어 ASC는이 문서에서 사용됩니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 표준 실험실 장비를 필요로하고 포스 완충 식염수, 표준 조직 문화 미디어 시약 및 콜라게나 간단한 시약을 사용하는 비교적 간단한 절차입니다. 이것은 지방 조직 부피와 후속 C의 개시 량에 따라부터 ASC 다수 생성 할ulture 시간. 그러나, 지방 조직 등의 대량의 처리는이 프로토콜을 사용하는 정도로 완화 될 수있는 물리적 인 문제를 제시 할 수있다. 또한,이 프로토콜함으로써 승인 된 조직 문화 시설의 사용을 필요로 무균 조직 배양 시설과 승인 된 바이오 안전성 후드를 요구한다. 그들은 좋은 제조 연습 임상 사용의 분리 및 재료의 확장을위한 설계 (GMP) 승인 시설에서 격리하지 않은 경우,이 요구 사항은 임상 응용 프로그램에서 ASC 인구의 유용성을 감소시킬 수있다. 다른 방법으로 운영 극장에서 닫힌 시스템에서부터 ASC를 분리 할 수 있습니다 자동화 시스템은이 중요한 문제를 피할 것이다 이후 체외 확장에 대한 필요없이부터 ASC의 즉시 사용할 수 있습니다. 지금까지 인간의 조직에서 세포의 분리를 위해 상업적으로 이용 가능하다 여섯 자동화 시스템이 있습니다. 이러한 시스템은 가능하게 격리 할 수​​있다즉시 수확을 다음과 지방 조직의 양이 많은부터 ASC의 상당수. 이러한부터 ASC는 지금 수술실을 떠나지 환자없이 재생하는 다양한 목적을 위해 환자에 재 도입 될 수있다. 부터 ASC를 수동으로 분리를 설명하는이 프로토콜뿐만 아니라, Celution 시스템을 사용부터 ASC의 자동 분리를위한 프로토콜은 또한 동반자 문서에 나와있다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				DMEM (Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>
				Mediatech Cellgro</td>
			<td>
				10-013-CV</td>
			<td>
				with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>
				Mediatech Cellgro</td>
			<td>
				30-002-CI</td>
			<td>
				10,000 IU/ml penicillin/10,000 &mu;g/ml streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Amphotericin B</td>
			<td>
				Mediatech Cellgro</td>
			<td>
				30-003-CF</td>
			<td>
				250 &mu;g/ml amphotericin B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				10X PBS (Phospho-buffered Saline)</td>
			<td>
				Mediatech Cellgro</td>
			<td>
				25-053-CI</td>
			<td>
				without calcium, without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Trypsin/EDTA</td>
			<td>
				Mediatech Cellgro</td>
			<td>
				20-031-CV</td>
			<td>
				0.25 % trypsin/2.21mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum)</td>
			<td>
				Sigma</td>
			<td>
				C2674</td>
			<td>
				crude preparation; &lt;125 collagen digestion units/mg solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated</td>
			<td>
				Gemini Bioproducts</td>
			<td>
				100106</td>
			<td>
				USDA source, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				10 ml serological pipettes</td>
			<td>
				Genesee Scientific</td>
			<td>
				12-104</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				25 ml serological pipettes</td>
			<td>
				Genesee Scientific</td>
			<td>
				12-106</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				50 ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>
				Genesee Scientific</td>
			<td>
				21-106</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				100 mm tissue culture dishes</td>
			<td>
				Genesee Scientific</td>
			<td>
				25-202</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				150 mm tissue culture dishes</td>
			<td>
				Genesee Scientific</td>
			<td>
				25-203</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				500 ml Stericup Filter Units</td>
			<td>
				Millipore</td>
			<td>
				SCGPU05RE</td>
			<td>
				PES membrane, 0.22 &mu;m pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Cell strainers</td>
			<td>
				FisherBrand</td>
			<td>
				22-363-549</td>
			<td>
				100 &mu;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				dexamethasone - water soluble</td>
			<td>
				Sigma</td>
			<td>
				D-2915</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				L-ascorbic-acid 2 phosphate</td>
			<td>
				Sigma</td>
			<td>
				A-8960</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				&beta;-glycerophosphate disodium salt</td>
			<td>
				Sigma</td>
			<td>
				G-9422</td>
			<td>
				also known as glycerophosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				insulin</td>
			<td>
				Sigma</td>
			<td>
				I-6634</td>
			<td>
				made from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				indomethacin</td>
			<td>
				Sigma</td>
			<td>
				I-7378</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				apo-transferrin</td>
			<td>
				Sigma</td>
			<td>
				T-4382</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				TGF&beta;1</td>
			<td>
				R&amp;D Systems</td>
			<td>
				240-B-002</td>
			<td>
				recombinant human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Oil Red O</td>
			<td>
				Sigma</td>
			<td>
				O-0625</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Alcian Blue</td>
			<td>
				Sigma</td>
			<td>
				A-5268</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Silver nitrate</td>
			<td>
				Sigma</td>
			<td>
				S-0319</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Hydrochloric acid</td>
			<td>
				Fisher Scientific</td>
			<td>
				A144</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Paraformaldehyde</td>
			<td>
				Fisher Scientific</td>
			<td>
				30525-89-4</td>
			<td>
				supplied as a 16 % stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				Equipment Needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Class II A/B Biosafety hood</td>
			<td>
				Thermo Scientific</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
			<td>
				ensure hood has vacuum lines for aspiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Benchtop centrifuge</td>
			<td>
				Hermle Labnet</td>
			<td>
				Z383</td>
			<td>
				Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Water bath</td>
			<td>
				Fisher Scientific Isotemp</td>
			<td>
				S52602Q</td>
			<td>
				5-10L capacity, capable of 37 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				Automated Pipette Aids</td>
			<td>
				Drummond Pipette Aid XL</td>
			<td>
				4-000-105</td>
			<td>
				&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
				CO2 Incubator</td>
			<td>
				Thermo Scientific</td>
			<td>
				Forma 310</td>
			<td>
				direct heat or water jacketed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

	&nbsp;

manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates

2001 년에, 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스의 연구자들은 초기 가공 Lipoaspirate 세포 또는 PLA 세포를 지칭 liposuctioned 지방 조직에서 성체 줄기 세포의 새로운 인구의 격리를 설명했다. 그 후,이 줄기 세포는 지방 - 유래 줄기 세포 또는부터 ASC로 개명 된 줄기 세포 연구 및 재생 의학 분야에서 가장 인기있는 성체 줄기 세포 집단 중의 하나가되기 위하여 갔다. 기사의 수천은 지금 뼈 재생, 말초 신경 수리 및 심장 혈관 엔지니어링을 포함하여 재생 동물 모델의 다양한부터 ASC를 사용하는 방법을 설명합니다. 최근 기사는 병원에서부터 ASC를위한 용도의 무수한을 설명하기 시작했다. 이 문서에 나와있는 프로토콜을 수동 및 효소 화장품 절차에서 얻은 lipoaspirates 많은 양에서부터 ASC를 분리하기위한 기본 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 쉽게 확대 또는 축소 accommod 아래로 할 수있다lipoaspirate의 볼륨을 먹고 복부 성형술 및 기타 유사한 절차를 통해 얻은 지방 조직에서부터 ASC를 분리하기 위해 적용 할 수 있습니다.

프로토콜의 개요는 위의 큰 볼륨 lipoaspirate 샘플에서 SVF의 분리에 대한 설명서, 효소 방법에 대해 설명합니다. 이 SVF 내에서 ASC 등 다양한 세포 집단이 있습니다. 많은 연구는 표준 조직 배양 조건이 SVF를 배양하는 ASC 형식으로 주로 구성 될 가능성이 접착 섬유 아세포 인구 선택 것이라고 제안한다. 이과 일치, 우리는 배양 SVF 펠릿의 주요 오염 세포 유형, 즉 적혈구, 평활근 세포와 내피 계통 (1)의 세포의 본질적 될 것을, 유동 세포 계측법 및 면역 형광 사용하여 보여 주었다. 그 결과 ASC 인구는 (그림 2) 상대적으로 외관 동질 및 섬유 아세포와 같은 세포로 구성되어 있습니다. 이 자기편부터 ASC 표준 조직 배양 조건에서 배양에서 잘 성장하고 수많은 분자 및 세포 B에 적합하다 시간 1을 두 배로 적당한 인구를 전시생체 내 시험 관내 및 재생 연구에 iology 연구. 그러나 고립 된 SVF의 이질적인 성격에 비추어, ASC 인구의 확인이 필요합니다. 수많은 연구는 체외 생체 ~ 9의 두 가지 셀을 식별하는 잠재적 인 수단으로 교양부터 ASC의 CD 항원 프로파일을 특성화하기 위해 유량 계측법 이용했습니다. Table 1은이 연구의 많은에서 결과를 요약. 이 CD 항원의 일부 표현이 논란이 남아 있지만, 일반적 배양부터 ASC는 CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d의 발현을 측정, CD54, CD90과 긍정적 CD140a 것을 동의합니다. CD34 같은 구체적인 조혈 마커의 발현이 시간에 해결되지 않지만 예컨대 CD31 및 CD45와 같은 수많은 조혈 CD 항원의 부재는, 중배엽부터 ASC의 원점과 일치한다. 최근 ASC 항원 프로파일, 유동 세포 계측법에 의해 결정되는 특정 subpop을 위해 선택하는 데 사용되었습니다같은 법규 강화 차별화 용량으로부터 ASC를 생산하는 희망의 10-12. 중배엽, 외배엽과 내배엽 계통으로 분화에 정의 된 배양 조건의 결과를 사용하여 ASC 인구의 체외 유도 유효성 검사의 가장 인기있는 수단으로 (그림 2) (검토를 위해 4 참조). 체외 트라이 배아 층 전위가 골 형성에 회생 모델 시스템, 분화의 광범위한부터 ASC의 사용을 초래하였으나, 지방 형성 및 연골 세포는 ASC를 식별하고 그것의 다 능성을 확인하는 것이 일반적으로 충분하다. 우리 손에, 오일 레드 O 5를 사용하여 얼룩 밝은 지질 액포를 포함하는 세포에서부터 ASC 결과의 지방 형성 차별화. 골 형성 분화 알칼리 포스파타제 양성 세포의 결과와 인산 칼슘 폰 Kossa 스테인 5를 사용하여 얼룩 세포 미네랄 축적.고밀도 micromass 조건에서 연골 세포로 분화 (알 시안 블루 염색을 이용하여 검출) 황산 프로테오글리칸을 포함하고 콜라겐 타입 5를 표현 펠릿을 생산하고 있습니다. 골격근 및 평활근 분화 모두 골격 근육 마이 오신과 MyoD1 평활근 액틴 5, 13, 14에 염색부터 ASC로 볼 수 있습니다. 외배엽 계통으로의 분화를 유도부터 ASC 및 노이 앤, 신경 세포 전사 인자 5의 등 다양한 신경 세포 마커의 발현에 의한 신경 세포와 같은 형태의 가정을 제안한다. 마지막으로, 세포의 설립 조건 (15) 결과에 따라 간 / 내배엽 계통쪽으로부터 ASC를 유도하는 식의 알파 태아 단백, 간 간세포의 잘 알려진 마커. 함께 지난 10 년 동안 출판 된 수많은 다른 사람들과 이러한 마커는 강하게 ASC 쉽게 관리 할 수​​있는 다 능성 줄기 세포 인구와 제안체외에서 전파와 세 개의 배아 생식 계통의 세포를 향해 유도. 생체 내에서의 재생 가능성 (검토를 위해 4 참조)에 결합, ASC는 재생 연구하는 과학자 또는 임상의 도구에 강력한 보탬이 될 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50585/50585fig1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50585/50585fig1highres.jpg" fo:content-width="6in" /> 그림 1. lipoaspirate 샘플에서 인간부터 ASC의 수동, 효소 격리. 격리를위한 A. 준비 : 이전에 격리에 다음과 같은 구성 요소가 준비되어야한다 : 1) () 칼슘 또는 마그네슘없이 PBS를 1 배 고압 증기 멸균을 통해 살균, 2) 1X PBS에서 제조 및 살균 0.075-0.1 % 콜라게나 제 타입 IA의 솔루션 0.22 μm의 필터 장치를 이용하여 여과를 통해, AS의 3) ASC 인구의 후속 문화에 대한 제어 보통 (CM). B. 격리CS는 : lipoaspirates의 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리를위한 단계별 가이드가 표시됩니다. 단계 멸균 1X PBS와 lipoaspirate의 세척을 포함, 콜라게나 유형 IA, 원심 분리하여 SVF의 수집 및 SVF 여과를 사용하여 소화. SVF의 연속 배양은 ASC 인구를 포함하는 접착 섬유 아세포의 인구가 발생합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50585/50585fig1highres.jpg">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50585/50585fig2.jpg" /> 그림 2. 부착 ASC 인구의 멀티 혈통 분화 가능성. 배양 SVF 세포 부착, 섬유 모세포부터 ASC의 상대적으로 동질적인 집단에서 발생합니다. 지방 형성, 골 세포, 연골 세포, 골격 근육 조직과 부드러운 근육 조직 계통의 세포에 정의 된 조건의 결과에 따라 ASC 인구의 유도.또한,부터 ASC는 노이 앤, 신경 세포의 마커 및 알파 태아 단백 (AFP) 내배엽 / 간 세포 계보의 설립 마커를 표현, 외배엽 계통의 세포로 분화 할 수있다. 일부 조직학 및 면역 형광 이미지는 이전에 발행 된 결과 1,5,6,7,8,9에서 가져옵니다. 함께 조직 학적, immunohistologic 형광 얼룩 차별화 계보가 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50585/50585fig2.jpg">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2"> 발현 양상 </td></tr><tr><td> 긍정적 인 표현 </td><td> 부정적인 표현 </td></tr><tr><td></td><td> CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d의 발현을 측정, CD49e, CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-1 </td><td> CD11a, CD11b를,의 CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62e, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146, HLA-DR, SMA, ABCG2 </td></tr><tr><td> 부터 ASC의 제안 표현형 (2 개 이상의 연구 간의 공통) </td><td> CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d의 발현을 측정, CD54, CD90, CD140a, HLA-ABC, STRO-1 </td><td> CD11a, CD11b를,의 CD11c, CD14, CD31, CD45, CD106, CD144 </td></tr><tr><td> 부터 ASC 논란 마커 (여러 연구를 통해 차등 결과) </td><td colspan="2"> CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR </td></tr><tr><td> 기질 CELL 마커 </td><td colspan="2"> CD29, CD44, CD73, CD90, CD166 </td></tr><tr><td> 조혈 마커 </td><td colspan="2"> CD31, CD34, CD45, ABCG2 </td></tr><tr><td colspan="3"> 굵게 표시된 2 또는 더 많은 연구 사이에 공통점 마커 SMA는 = 평활근 액틴 HLA = 인간 백혈구 항원 ABCG2 = 다중 약물 수송 단백질 G2 </td></tr></tbody></table> 표 1. 인간부터 ASC의 세포 표면 발현 프로파일.

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Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

2001 년, UCLA의 연구자들은 성체 줄기 세포의 인구의 분리는 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 나부터 ASC라고 기술. 이 문서는 콜라게나 제를 사용 설명서, 소화 효소의 프로토콜을 사용 lipoaspirates에서부터 ASC의 분리를 설명.

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

41.1K 조회수.  Cytori Therapeutics Inc.  2001 년, UCLA의 연구자들은 성체 줄기 세포의 인구의 분리는 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 나부터 ASC라고 기술. 이 문서는 콜라게나 제를 사용 설명서, 소화 효소의 프로토콜을 사용 lipoaspirates에서부터 ASC의 분리를 설명. 

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Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

연구

생물학

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

인간 췌장암의 Xenografts에서 줄기 세포의 분리

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...