프로토콜의 중요성은 완료에 필요한 짧은 시간에 편리하다는 데 있습니다. 이를 통해 높은 처리량, 높은 농도 및 스토킹 및 고착성 트리코메의 높은 수준의 격리가 가능합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 직설성입니다.
이 기술을 사용하는 동안 식물 공급원의 트리코메 밀도를 고려하고 처음으로 프로토콜을 수행하는 동안 현미경을 통해 각 단계에서 분리 정도를 검사해야 합니다. 이 기술을 시연하는 것은 Volcani Center의 대마초 전문가 인 Nurit Shalev가 될 것입니다. 5리터 플라스틱 용기에 망치와 단단하고 평평한 물체를 사용하여 드라이아이스 블록을 작고 미세한 조각으로 분쇄하는 것으로 시작합니다.
큰 여과기를 사용하여 분쇄되지 않은 드라이 아이스에서 미세한 드라이 아이스 플레이크를 다른 5 리터 플라스틱 용기에 체로 칩니다. 약 200입방센티미터의 드라이아이스 플레이크를 직립형 1리터 유리 비커에 붓습니다. 분쇄 된 드라이 아이스의 첫 번째 층에 최대 10 그램의 냉동 대마초 sativa 꽃차례를 넣고 200 입방 센티미터의 미세하게 분쇄 된 드라이 아이스 층으로 덮으십시오.
그런 다음 1 리터 유리 비커의 개구부를 1 밀리미터 스크린 도어 모기장의 2-3 층으로 덮고 고무 밴드로 고정하십시오. 다음으로, 액체 질소를 큰 둥근 바닥 스테인리스 스틸 용기에 붓습니다. 밀가루 체 또는 체 여과기에 350마이크로미터 메쉬를 삽입하여 아래에서 밀가루 체 메쉬를 덮습니다.
액체 질소로 채워진 큰 둥근 바닥 스테인리스 스틸 용기 위에 이 밀가루 체를 놓습니다. 체로 쳐진 덩어리의 손실을 최소화하려면 용기의 너비가 밀가루 체의 너비를 초과하는지 확인하십시오. 1 리터 유리를 흔들어 식물 재료에서 trichomes를 분리하십시오.
2-3 분마다 비커를 따로 보관하여 분쇄 된 드라이 아이스와 밀가루 체에 축적 된 식물 재료를 체로 치십시오. 밀가루 체를 수평으로 체로 쳐서 아래에 놓인 둥근 바닥 스테인리스 스틸 용기의 액체 질소로 식물 재료가 쉽게 통과할 수 있도록 합니다. 다음으로, 액체 질소를 스테인리스 스틸 용기에 넣고 분쇄 된 드라이 아이스를 1 리터 유리 비커에 첨가합니다.
밀가루 체의 식물 재료가 고갈되면 유리 비커에 사용한 식물 재료를 추가로 10g의 신선한 식물 재료로 다시 채우고 용기에 충분한 양의 농축 트리코메를 모을 때까지 체질 과정을 반복합니다. 충분한 트리코메의 수집을 확인하기 위해 현미경 관찰 전에 액체 질소에 잠긴 스테인리스 스틸 용기 바닥에 흰색 분말 같은 물질이 존재하는지 확인합니다. 깨끗하고 작은 둥근 바닥 스테인리스 스틸 용기에 소량의 액체 질소를 추가합니다.
이어서, 150 마이크로미터 메쉬 사이즈를 갖는 40 x 40 센티미터 마이크로시브를 2회 접어 20 x 20 센티미터의 폴드를 얻고, 이를 원뿔 모양으로 열었다. 원뿔의 열린 부분이 똑바로 세워지고 뾰족한 부분이 부분적으로 액체 질소에 잠기도록 하나 또는 두 개의 빨래집게로 메쉬 콘을 둥근 바닥 스테인리스 스틸 용기의 가장자리에 고정합니다. 완료되면 이전에 얻은 백색 분말 유사 물질이 포함된 액체 질소를 미세체 원뿔에 부드럽게 붓습니다.
넓은 브러시를 사용하여 첫 번째 용기에 남아있는 식물 재료를 모아 150 마이크로 미터 메쉬 콘으로 옮깁니다. 그런 다음 용기 뚜껑에서 빨래집게를 조심스럽게 떼어내고 마이크로시브 콘을 열어 열린 마이크로시브 중앙에 트리초메를 찾습니다. 마이크로 시브의 네 모서리를 모두 잡고 trichomes가 들어있는 중간 부분을 액체 질소에 담그십시오.
미세체를 액체 질소에 1분 동안 부드럽게 담그고 흔듭니다. 멸균 바늘을 사용하여 압력이 가해지는 것을 방지하기 위해 50 밀리리터 시험관의 캡에 작은 구멍을 뚫습니다. 체로 쳐지지 않은 식물 파편, 드라이 아이스 및 미세 체 중앙에 싸인 더 큰 trichomes를 50 밀리리터 시험관에 넣고 나중에 사용할 수 있도록 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.
액체 질소에 잠긴 체로 쳐진 trichomes를 미세 체를 통해 순차적으로 옮기고, 주입 크기를 105에서 80에서 65로 줄인 다음 50 마이크로 미터로 줄입니다. 각 전송 후 마이크로 체에 남아있는 다양한 크기의 trichomes를 별도로 수집하고 라벨을 붙입니다. 멸균 바늘을 사용하여 튜브 캡에 작은 구멍을 뚫습니다.
액체 질소에 담그고 50 마이크로 미터 마이크로 체에 싸서 원하는 trichomes를 미리 냉각 된 스푼을 사용하여 깨끗한 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 미리 냉각 된 주걱을 사용하여 분말과 같은 트리 초메를 라벨이 붙은 사전 냉각 된 1.5 밀리리터 튜브로 신속하게 옮기고 추가 연구를 위해 튜브를 섭씨 영하 80도에 즉시 보관하십시오. 분리 과정의 초기 단계에서, 잎 조직 조각은 완전히 오염되지 않은 분리 된 trichomes로 구성된 최종 분리 생성물과 달리 분리 된 부분에서 우세했다.
분리된 세분화된 capitate 스토킹 및 고착성 trichomes의 품질이 최종 분리 단계에서 관찰되었습니다. 이 방법을 사용하여 분리된 트리코메의 순도는 기존 프로토콜과 비슷했습니다. 섬세한 스토킹 trichome 헤드 구조가 유지되었고, 완전한 trichome 헤드 구조가 누락되고 디스크 세포 만 존재하는 전통적인 방법과 달리 분리 된 스토킹 trichome의 전체 헤드가 보였습니다.
분리된 트리초메의 RNA 추출 및 RNA 완전성의 추정은 9.4 내지 10의 높은 RNA 완전성 수 또는 RIN 값을 나타내었고, 겔 크로마토그래피는 높은 RNA 완전성을 나타내었다. 150 내지 50 마이크로 미세체 분리의 T 백과 같은 주입 동작을 조심스럽게 수행한다. 이 방법은 대마초의 트리코메와 다른 식물 종의 트리코메의 전사체 및 아마도 프로테오믹 구성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
이 절차에 따라 대사 및 전사체 특성 분석을 수행할 수 있습니다. 이러한 추가 방법은 분리된 트리코메에서 유전자의 발현 수준과 대사 프로필을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 다양한 대마초 품종의 선 trichomes의 전사체 특성화를 가능하게 했습니다.
