Protokolün önemi, tamamlanması için gereken kısa sürede kolaylık sağlamasında yatmaktadır. Bu, yüksek verim, yüksek konsantrasyon ve saplı ve sapsız trikomların yüksek derecede izolasyonunu sağlar. Bu tekniğin temel avantajı basitliğidir.
Bu teknik sırasında, bitki kaynağının trikom yoğunluğu göz önünde bulundurulmalı ve protokolü ilk kez gerçekleştirirken mikroskop ile her adımda izolasyon derecesi incelenmelidir. Bu tekniği gösteren, Volcani Merkezi'nden esrar uzmanı Nurit Shalev olacak. Kuru bir buz bloğunu beş litrelik plastik bir kapta bir çekiç ve sert, düz bir nesne kullanarak küçük, ince pullar halinde ezerek başlayın.
Büyük bir süzgeç kullanın ve ince kuru buz pullarını ezilmemiş kuru buzdan beş litrelik başka bir plastik kaba eleyin. Kuru buz pullarının yaklaşık 200 santimetreküpünü dik bir litrelik cam beher içine dökün. Ezilmiş kuru buzun ilk katmanına 10 grama kadar dondurulmuş esrar sativa salkımını ekleyin ve 200 santimetreküp ince ezilmiş kuru buz tabakası ile örtün.
Ardından, bir litrelik cam kabın açıklığını, bir milimetrelik bir ekran kapısı cibinliğinin iki ila üç katmanı ile örtün ve lastik bantlarla sabitleyin. Ardından, sıvı azotu büyük bir yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kaba dökün. Un elek ağını aşağıdan örtmek için bir un elek veya elek süzgecine 350 mikrometrelik bir ağ yerleştirin.
Bu un eleyiciyi sıvı azotla doldurulmuş büyük yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın üzerine yerleştirin. Elenmiş kütlenin kaybını en aza indirmek için, kabın genişliğinin un eleğininkini aştığından emin olun. Bir litrelik camı un eleğine doğru aşağı bakacak şekilde sallayarak trikomları bitki materyalinden ayırın.
Beheri her iki ila üç dakikada bir bir kenara koyun, un eleği üzerinde biriken ezilmiş kuru buzun ve bitki malzemesinin elenmesine izin verin. Bitki malzemesinin sıvı azota geçişini kolaylaştırmak için un eleğini yatay olarak eleyin, aşağıya yerleştirilen yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kapta. Daha sonra, paslanmaz çelik kaba sıvı azot ve seviyeleri düştüğünde bir litrelik cam beherin içine ezilmiş kuru buz ekleyin.
Un eleği üzerindeki bitki materyali tükendiğinde, cam beherdeki kullanılmış bitki malzemesini ilave 10 gram taze bitki materyali ile doldurun ve kapta yeterli miktarda zenginleştirilmiş trikom toplanana kadar eleme işlemini tekrarlayın. Yeterli trikomların toplanmasını doğrulamak için mikroskop gözleminden önce sıvı azota batırılmış paslanmaz çelik kabın dibinde beyaz toz benzeri bir maddenin mevcut olduğunu doğrulayın. Temiz, küçük, yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik bir kaba az miktarda sıvı azot ekleyin.
Ardından, 20 x 20 santimetrelik bir katlama elde etmek için 150 mikrometre ağ boyutuna sahip 40 x 40 santimetrelik bir mikroeleği iki kez katlayın ve koni benzeri bir şekilde açın. Ağ konisini yuvarlak tabanlı paslanmaz çelik kabın kenarına bir veya iki mandalla sabitleyin, böylece koninin açılan kısmı dik olur ve sivri kısmı kısmen sıvı azota batırılır. Tamamlandığında, daha önce elde edilen beyaz toz benzeri maddeyi içeren sıvı azotu yavaşça mikroelek konisine dökün.
Geniş bir fırça kullanarak, kalan bitki materyallerini ilk kaptan toplayın ve 150 mikrometrelik ağ konisine aktarın. Daha sonra, mandalı kabın kapağından dikkatlice ayırın ve açılan mikroeleğin ortasındaki trikomları bulmak için mikroelek konisini açın. Mikroeleğin dört köşesini de bir arada tutun ve trikomları içeren orta kısmı sıvı azota batırın.
Mikro eleği sıvı azota yavaşça daldırın ve bir dakika boyunca çalkalayın. Steril bir iğne kullanarak, basınç oluşumunu önlemek için 50 mililitrelik bir test tüpünün kapağında küçük delikler açın. Elenmemiş bitki artıklarını, kuru buzu ve mikroeleğin ortasına sarılmış daha büyük trikomları 50 mililitrelik bir test tüpüne alın ve ileride kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Sıvı azota batırılmış elenmiş trikomları sırayla mikroeleklerden geçirin, dökme boyutları 105 ila 80 ila 65 ve daha sonra 50 mikrometreye düşürülür. Her transferden sonra, mikroelek üzerinde kalan farklı büyüklükteki trikomları ayrı ayrı toplayın ve etiketleyin. Steril bir iğne kullanarak tüpün kapağında küçük delikler açın.
Sıvı azota batırılmış ve 50 mikrometre mikroeleğe sarılmış istenen trikomları önceden soğutulmuş bir kaşık kullanarak temiz bir plakaya aktarın. Daha sonra, toz benzeri trikomları, önceden soğutulmuş bir spatula kullanarak etiketli önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir tüpe hızlı bir şekilde aktarın ve daha ileri çalışmalar için tüpleri hemen eksi 80 santigrat derecede saklayın. İzolasyon işleminin ilk aşamasında, tamamen kirlenmemiş izole trikomlardan oluşan nihai izolasyon ürününün aksine, izole edilmiş kısımda yaprak dokusu parçaları baskındı.
İzole granüler kapitat saplı ve sapsız trikomların kalitesi son izolasyon adımında gözlendi. Bu yöntem kullanılarak izole edilen trikomların saflığı, geleneksel bir protokolle karşılaştırılabilirdi. Hassas saplı trikom kafa yapısı korundu ve izole saplı trikomun tüm kafaları, tüm trikom kafa yapısının eksik olduğu ve sadece disk hücrelerinin bulunduğu geleneksel yöntemin aksine görülebiliyordu.
İzole trikomların RNA ekstraksiyonu ve RNA bütünlüğünün tahmini, 9.4 ila 10 arasında yüksek RNA bütünlüğü sayısı veya RIN değerleri gösterdi ve jel kromatografisi yüksek RNA bütünlüğünü gösterdi. 150 ila 50 mikro mikrolize izolasyonun T torbası benzeri infüzyon hareketini dikkatlice gerçekleştirin. Bu yöntem, diğer bitki türlerinin esrar ve trikomlarından trikomların transkriptomik ve muhtemelen proteomik yapısı hakkında fikir verebilir.
Bu işlemi takiben metabolik ve transkriptomik karakterizasyonlar yapılabilir. Bu ek yöntemler, izole trikomlardaki genlerin ekspresyon seviyelerini ve metabolik profillerini anlamaya yardımcı olabilir. Bu teknik, farklı kenevir çeşitlerinden glandüler trikomların transkriptomik karakterizasyonunu sağlamıştır.
