이 프로토콜은 모든 연령대의 게르빌 달팽이관에서 시냅스 무결성을 평가할 수있게합니다. 이것은 청력 문제, 특히 노화로 인한 근본적인 연구에 중요합니다. 이 프로토콜은 비교적 빠르며 달팽이관을 따라 여러 위치에서 정량적 데이터를 생성합니다.
또한, 자가형광 소광제를 사용함으로써 노화 조직의 특정 문제를 해결한다. 시냅스의 퇴행은 달팽이관에서 기능 상실의 가장 초기 징후입니다. 이를 정량화하는 것은 시냅스 병증을위한 비 침습적 진단 도구를 개발하기위한 연구에서 중요한 도구입니다.
달팽이관 해부는 연습이 필요한 가장 중요한 부분이므로 실험적이지 않은 달팽이관으로 시작하는 것이 좋습니다. 불레를 제거하는 것으로 시작하십시오. 가위로 뼈를 자르거나 포셉으로 뼈를 부수고 집게로 제거하여 달팽이관에 도달하십시오.
malleus, incus 및 반원형 운하를 제거하십시오. 달팽이관의 꼭대기를 덮고있는 뼈를 조심스럽게 제거하고 포셉으로 달팽이관 뼈를 긁어 정점과 기저 회전에 작은 구멍을 만들거나 조심스럽게 두 위치에 구멍을 뚫습니다. 즉시 bullae를 적어도 50 밀리리터의 차가운 고정제로 옮깁니다.
달팽이관을 반으로 자르려면 달팽이관의 코일 길이보다 긴 면도날 조각을 블레이드 홀더에 넣으십시오. 그런 다음 달팽이관을 스테레오 현미경으로 페트리 접시에 넣으십시오. 면도날 또는 미세한 가위로 과도한 조직을 잘라냅니다.
달팽이관을 미세한 포셉으로 제자리에 고정시키고 모디올러스를 따라 반으로 자릅니다. 이를 70%에탄올과 혼합하여 자가형광 소광제의 5% 용액을 제조하였다. 이 용액에 달팽이를 넣고 진탕기 상에서 실온에서 일분 동안 인큐베이션한 다음, 다섯 분 동안 PBS 한 밀리리터로 세 번 세척하였다.
달팽이관의 해부를 위해 두 개의 미세 포셉, 초미세 포셉, 바나, 스프링 가위, 블레이드 홀더, 면도날을 수집하고 폴리스티롤 페트리 접시와 그 뚜껑을 PBS로 채 웁니다. 면도날에서 조각을 부수어 두 ~ 네 밀리미터의 절단면을 얻습니다. 조직 준비를위한 섹션에 표시된 것처럼 달팽이관을 반으로 자릅니다.
인공와우 반쪽을 포셉으로 조심스럽게 고정하여 절단 가장자리가 위쪽을 향하게하십시오. 정점을 덮고있는 헬리코트 리아 위의 달팽이관의 뼈를 자르기 위해 미세한 봄 가위를 사용하십시오. 그런 다음 가위를 사용하여 모디올러스와 청각 신경 및 스칼라 전정을 절단하여 정점 회전을 분리하십시오.
위의 달팽이관 뼈의 양쪽에 두 개의 절단을하거나, 추가 평가를 위해 줄무늬 혈관이 필요하지 않은 경우 중간 회전의 선조골 혈관을 통해 직접 절단하십시오. 면도날을 사용하여 달팽이관 조각을 분리하십시오. 또는 코르티 기관과 줄무늬 혈관 사이를 자릅니다.
나선형 인대에 연결된 선조골 혈관을 떠나 포셉을 사용하여 석회화 된 뼈를 제거하십시오. 다음으로, 달팽이관 조각을 PBS로 채워진 페트리 접시 뚜껑으로 옮긴다. 기둥과 모디올라 측면의 과도한 조직을 제거하여 나중에 전체 마운트가 가능한 한 평평하게 슬라이드에 놓이도록하십시오.
큰 달팽이관 조각, 특히 기저 회전에서 유래 한 조각은 두 조각으로 절단해야합니다. 초미세 포셉으로 지각 막을 조심스럽게 제거하십시오. 달팽이관 조각을 슬라이드 위에 올려 놓고 장착 매체 한 방울에 넣고 코르티 오르간이 위로 향하도록 합니다.
달팽이관 조각을 시상면으로 옮기고 내부 모발 세포에 가까운 나선형 사지의 질내 삽입을 찾으십시오. 나선형 림푸스의이 질은 중간 및 기저 달팽이관 조각에서보다 명확하게 볼 수 있습니다. 전체 달팽이관과 전체 선조체 혈관을 이러한 단계를 반복하여 현미경 슬라이드 상에 옮깁니다.
덮개는 슬라이드를 미끄러 뜨리고 밀봉을 위해 가장자리 주위에 검은 매니큐어를 추가합니다. 어둠 속에서 말리고 섭씨 네 도에 보관하십시오. BioVoxxel 플러그인으로로드 된 ImageJ 소프트웨어에서 deconvolved 스택의 사본을 엽니 다.
이미지, 색상, 채널 분할을 차례로 클릭하여 채널을 분할합니다. 이미지, 색상 등을 클릭한 다음 채널 병합을 클릭하여 서로 다른 색상을 할당하여 병합합니다. 이미지를 클릭하여 이미지를 RGB 스택으로 변환 한 다음 색상으로 이동하여 RGB로 스택을 클릭하십시오.
이미지, 조정 및 밝기/대비를 클릭하여 밝기와 대비를 조정합니다. 자동 또는 슬라이더를 사용하여 시냅스 전후 구조와 내부 모발 세포 레이블이 배경과 구별되는지 확인합니다. 스택 내의 원하는 위치를 클릭하여 텍스트 도구로 다섯 개의 내부 모발 셀에 레이블을 지정합니다.
그런 다음 분석, 도구로 이동하여 ROI 관리자를 선택합니다. 체크 박스 레이블을 선택하여 점으로 숫자에 레이블을 지정합니다. 관심 있는 내부 모발 세포를 확대합니다.
점 도구를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 다중 점 모드를 선택합니다. Z 차원을 스크롤하고 시냅스 후 글루타메이트 패치와 병치된 사전 시냅스 리본으로 식별되는 기능 리본 시냅스를 계산합니다. 관심있는 모든 구조를 선택한 후 ROI 관리자 추가를 클릭 한 다음 임의의 이름을 클릭하고 이름 바꾸기를 선택하십시오.
손 도구를 사용하여 이미지를 조정하여 다음 내부 헤어 셀을 완전히 표시합니다. 다중 점 도구에서 점 도구로 변경하여 이전에 저장된 데이터에 더 많은 누점이 추가되지 않도록 합니다. 다음 내부 헤어 셀 내에서 관심있는 구조를 클릭하고 멀티 포인트 도구로 변경하십시오.
모든 내부 모발 세포가 평가될 때까지 ROI Manager에서 기능성 리본 시냅스를 계속 추가합니다. ROI 관리자에서 데이터 세트를 클릭한 다음 측정을 클릭합니다. 측정된 데이터 요소를 나열하는 새 창이 나타날 때까지 기다렸다가 파일 및 다른 이름으로 저장을 클릭하여 이 목록을 스프레드시트로 저장합니다.
ROI 관리자에서 모두 표시를 활성화하여 이미지를 저장합니다. Flatten을 클릭하여 포인트 레이블을 스택에 영구적으로 추가하고 동의를 클릭하여 변경 사항을 저장하여 닫으십시오. 10 개월 된 젊은 게르빌의 달팽이관에서 Z 스택 돌출부는 흰색 점선으로 윤곽이 그려진 미오신 7A 표지 된 내부 모발 세포가 배경과 뚜렷한 대조를 이룬 것으로 나타났습니다.
시냅스 전 리본은 녹색으로 표시된 항-CtBP2 2개로 표지되었고, 시냅스 후 글루타메이트 패치는 적색으로 표시된 항-GluA2로 표지되었다. 38 개월 된 오래된 게르빌에서 달팽이관은 자기 형광 소광기로 처리되었으며 시냅스 전후 구조를 명확하게 볼 수있는 뚜렷한 내부 모발 세포를 보여주었습니다. 면역 표지의 안정성을 시험하기 위해, 어린 게르빌에서 달팽이관의 동일한 조각을 석 달 및 29 1/2 개월 후에 이미징했다.
감소된 신호 대 잡음비에도 불구하고, 기능적 시냅스는 뚜렷하고 정량화될 수 있었다. 절단이 실패하더라도 나머지 조직 조각을 장착하여 나중에 전체 달팽이관 길이를 가장 정확하게 추정하십시오. 이 프로토콜의 데이터는 전기 생리학 또는 정신 물리학 적 청력 검사와 개별적으로 상관 관계가 있고 그 전에 특히 유용합니다.
