Dieses Protokoll ermöglicht die Bewertung der synaptischen Integrität in der Cochlea der Rennmaus jeden Alters. Dies ist wichtig für die Grundlagenforschung zu Hörproblemen, insbesondere aufgrund des Alterns. Das Protokoll ist relativ schnell und liefert quantitative Daten von mehreren Stellen entlang der Cochlea.
Darüber hinaus adressiert es ein spezifisches Problem der Gewebealterung durch die Verwendung eines Autofluoreszenz-Quenchers. Die Degeneration von Synapsen ist das früheste Anzeichen für einen Funktionsverlust in der Cochlea. Die Quantifizierung ist ein wichtiges Instrument in der Forschung zur Entwicklung nicht-invasiver Diagnosewerkzeuge für die Synaptopathie.
Die Cochlea-Dissektion ist der wichtigste Teil, der geübt werden muss, daher ist es besser, mit nicht-experimentellen Cochli zu beginnen. Beginnen Sie mit dem Entfernen der Bullae. Schneiden Sie den Knochen mit einer Schere ab oder knacken Sie den Knochen mit einer Pinzette und entfernen Sie ihn mit einer Pinzette, um die Cochlea zu erreichen.
Entfernen Sie die Kanäle Malleus, Incus und Halbkreis. Entfernen Sie vorsichtig den Knochen, der die Spitze der Cochlea bedeckt, und kratzen Sie den Cochlea-Knochen mit einer Pinzette, um kleine Löcher an der Spitze und in der basalen Drehung zu machen, oder stechen Sie vorsichtig Löcher an beiden Stellen. Übertragen Sie die Bullen sofort in mindestens 50 Milliliter kaltes Fixiermittel.
Um das Cochli in zwei Hälften zu schneiden, positionieren Sie ein Stück Rasierklinge, das länger als die gewickelte Länge der Cochlea ist, in einen Klingenhalter. Dann legen Sie die Cochlea in eine Petrischale unter ein Stereomikroskop. Überschüssiges Gewebe mit einer Rasierklinge oder mit einer feinen Schere wegschneiden.
Halten Sie die Cochlea mit einer feinen Pinzette an Ort und Stelle und schneiden Sie sie entlang des Modiolus in zwei Hälften. Bereiten Sie eine 5%ige Lösung des Autofluoreszenzquenchers vor, indem Sie sie mit 70%igem Ethanol mischen. Legen Sie das Cochli in diese Lösung und inkubieren Sie es für eine Minute bei Raumtemperatur auf einem Shaker, gefolgt von dreimal mit einem Milliliter PBS für fünf Minuten.
Für die Sezierung der Cochlea sammeln Sie zwei feine Pinzetten, superfeine Pinzetten, Vannas, Federschere, einen Klingenhalter, eine Rasierklinge und füllen Sie die Polystyrol-Petrischale und ihren Deckel mit PBS. Brechen Sie Stücke von der Rasierklinge, um eine Schnittfläche von zwei bis vier Millimetern zu erhalten. Schneiden Sie die Cochlea in zwei Hälften, wie im Abschnitt zur Gewebepräparation gezeigt.
Befestigen Sie die Cochlea-Hälfte vorsichtig mit der Pinzette, so dass die Schnittkante nach oben zeigt. Verwenden Sie eine feine Federschere, um den Knochen der Cochlea über dem Helicotrema, das die Spitze bedeckt, abzuschneiden. Verwenden Sie dann eine Schere, um die apikale Drehung zu isolieren, indem Sie den Modiolus und den Hörnerv sowie die Scala vestibuli durchschneiden.
Machen Sie zwei Schnitte auf jeder Seite des Cochlea-Knochens oben, oder, wenn die Stria vascularis nicht für die weitere Beurteilung benötigt wird, direkt durch die Stria vascularis der mittleren Runde. Verwenden Sie die Rasierklinge, um die Cochlea-Stücke zu trennen. Alternativ zwischen dem Corti-Organ und dem Stria vascularis schneiden.
Lassen Sie die Stria vascularis mit dem Spiralband verbunden und entfernen Sie den entkalkten Knochen mit einer Pinzette. Als nächstes geben Sie die Cochlea-Stücke in einen mit PBS gefüllten Petrischalendeckel. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe an den Säulen- und Modiolarseiten, so dass die gesamten Halterungen später so flach wie möglich auf dem Objektträger liegen.
Große Cochleastücke, insbesondere solche, die aus der basalen Windung stammen, sollten in zwei Stücke geschnitten werden. Entfernen Sie vorsichtig die tektoriale Membran mit einer superfeinen Pinzette. Legen Sie die Cochlea-Stücke auf einen Objektträger in einen Tropfen Montagemedium, um sicherzustellen, dass das Corti-Organ nach oben zeigt.
Verschieben Sie das Cochlea-Stück in die Sagittalebene und suchen Sie nach einer Invagination des spiralförmigen Limbus in unmittelbarer Nähe zu den inneren Haarzellen. Diese Invagination des spiralförmigen Limbus ist in den mittleren und basalen Cochlea-Stücken deutlicher zu sehen. Übertragen Sie die gesamte Cochlea und die gesamte Stria vascularis auf den Objektträger, indem Sie diese Schritte wiederholen.
Deckel schieben Sie den Schlitten und fügen Sie schwarzen Nagellack an den Rändern zum Abdichten hinzu. Im Dunkeln trocknen und bei vier Grad Celsius lagern. Öffnen Sie eine Kopie der dekonvolvierten Stacks in der ImageJ-Software, die mit dem BioVoxxel-Plugin geladen ist.
Teilen Sie die Kanäle auf, indem Sie auf Bild, dann auf Farbe und dann auf Kanäle aufteilen klicken. Führen Sie sie zusammen, indem Sie auf Bild, dann auf Farbe und dann auf Kanäle zusammenführen klicken, um verschiedene Farben zuzuweisen. Konvertieren Sie das Bild in einen RGB-Stapel, indem Sie auf Bild klicken, dann zu Farbe gehen und auf Stapeln in RGB klicken.
Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an, indem Sie auf Bild, Anpassen und dann auf Helligkeit/Kontrast klicken. Verwenden Sie entweder Auto oder Slider, um sicherzustellen, dass sich die prä- und postsynaptischen Strukturen und die Markierungen der inneren Haarzellen vom Hintergrund unterscheiden. Beschriften Sie fünf innere Haarzellen mit dem Textwerkzeug, indem Sie auf die gewünschte Stelle innerhalb des Stapels klicken.
Wechseln Sie als Nächstes zu Analysieren, dann zu Tools, und wählen Sie ROI Manager aus. Aktivieren Sie die Beschriftungen des Kontrollkästchens, um die Punkte mit einer Nummer zu kennzeichnen. Zoomen Sie auf die innere Haarzelle von Interesse.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktwerkzeug, um den Mehrpunktmodus zu wählen. Scrollen Sie durch die Z-Dimension und zählen Sie die funktionellen Bandsynapsen, die durch ein präsynaptisches Band in Gegenüberstellung zu einem postsynaptischen Glutamatpflaster identifiziert werden. Nachdem Sie alle gewünschten Strukturen ausgewählt haben, klicken Sie auf ROI-Manager hinzufügen, klicken Sie dann auf den beliebigen Namen und wählen Sie Umbenennen.
Passen Sie mit dem Handwerkzeug das Bild so an, dass die nächste innere Haarzelle vollständig angezeigt wird. Wechseln Sie von Mehrpunktwerkzeug zu Punktwerkzeug, um zu vermeiden, dass den zuvor gespeicherten Daten mehr Puncta hinzugefügt wird. Klicken Sie auf eine interessante Struktur in der nächsten inneren Haarzelle und wechseln Sie zum Multi-Point-Tool.
Fahren Sie mit dem Hinzufügen der funktionellen Bandsynapse im ROI-Manager fort, bis alle inneren Haarzellen ausgewertet sind. Klicken Sie im ROI Manager auf einen Datensatz und dann auf Measure. Warten Sie, bis ein neues Fenster erscheint, das die gemessenen Datenpunkte auflistet, und klicken Sie auf Datei und Speichern unter, um diese Liste als Tabellenkalkulation zu speichern.
Speichern Sie das Bild, indem Sie im ROI-Manager Alle anzeigen aktivieren. Klicken Sie auf Reduzieren, um die Punktbeschriftungen dauerhaft zum Stapel hinzuzufügen, und klicken Sie auf Zustimmen, um die Änderungen zu speichern. Z-Stack-Projektionen aus der Cochlea einer jungen Rennmaus im Alter von 10 Monaten zeigen, dass die Myosin 7A-markierten inneren Haarzellen, die hier durch weiß gestrichelte Linien umrissen wurden, in scharfem Kontrast zum Hintergrund standen.
Die präsynaptischen Bänder wurden mit Anti-CtBP2 markiert, zwei in Grün dargestellt, während die postsynaptischen Glutamat-Patches mit Anti-GluA2 in Rot markiert waren. Die Cochlea einer alten Rennmaus im Alter von 38 Monaten wurde mit dem Autofluoreszenz-Quencher behandelt und zeigte ausgeprägte innere Haarzellen mit deutlich sichtbaren prä- und postsynaptischen Strukturen. Um die Stabilität der Immunmarkierung zu testen, wurde das gleiche Stück Cochlea von der jungen Rennmaus nach drei Monaten und 29 1/2 Monaten abgebildet.
Trotz des reduzierten Signal-Rausch-Verhältnisses waren die funktionellen Synapsen unterschiedlich und quantifizierbar. Selbst wenn ein Schnitt fehlschlägt, montieren Sie das restliche Stück Gewebe, um später die volle Cochlea-Länge am genauesten zu schätzen. Die Daten aus diesem Protokoll sind besonders wertvoll, wenn elektrophysiologische oder psychophysische Hörtests vorangestellt sind und dann individuell mit ihnen korreliert werden.
