このプロトコルは、すべての年齢のスナネズミの蝸牛におけるシナプス完全性の評価を可能にする。これは、特に加齢による聴覚障害の基礎研究にとって重要です。このプロトコルは比較的高速で、蝸牛に沿ったいくつかの場所から定量データを生成します。
さらに、自己蛍光消光剤を用いて組織の老化という特定の問題に対処する。シナプスの変性は、蝸牛における機能喪失の最も初期の徴候である。それを定量することは、シナプタパシーのための非侵襲的診断ツールの開発に向けた研究において重要なツールである。
蝸牛解剖は練習が必要な最も重要な部分なので、非実験的な蝸牛から始める方が良いです。まず、水疱を取り除くことから始めます。はさみで骨を切るか、鉗子で骨を割って鉗子で取り除き、蝸牛に届きます。
マレウス、インカス、半円形の運河を削除します。蝸牛の頂点を覆っている骨を慎重に取り除き、鉗子で蝸牛骨を傷つけて、頂点と基底ターンに小さな穴を開けるか、両方の場所に慎重に穴をあけます。直ちに水疱を少なくとも50ミリリットルの冷たい固定剤に移す。
蝸牛を半分に切るには、蝸牛のコイル状の長さよりも長いカミソリの刃を刃のホルダーに入れます。次いで、実体顕微鏡下で蝸牛をシャーレに入れる。カミソリの刃や細かいはさみで余分な組織を切り取ります。
蝸牛を細かい鉗子で所定の位置に保持し、モディオラスに沿って半分に切ります。70%エタノールと混合して自家蛍光消光剤の5%溶液を調製する。この溶液にコクリを入れ、シェーカー上で室温で1分間インキュベートした後、1ミリリットルのPBSで3回5分間洗浄した。
蝸牛の解剖のために、2つの細かい鉗子、超微細鉗子、バンナ、スプリングハサミ、ブレードホルダー、カミソリの刃を集め、ポリスチロールペトリ皿とその蓋にPBSを充填する。カミソリの刃から破片を折って、2〜4ミリメートルの切断面を得る。組織調製のためのセクションに示すように蝸牛を半分に切る。
蝸牛の半分を鉗子で慎重に固定し、切断エッジが上を向くようにします。細かい春のはさみを使って、頂点を覆うヘリコトレマの上の蝸牛の骨を切り取ります。次に、はさみを使用して、モディオラスと聴覚神経とスカラ前庭を切り裂くことによって頂端を分離します。
上記の蝸牛骨の両側に2つの切り込みを入れるか、または線条体血管炎がさらなる評価に必要でない場合は、中間回転の線条体血管炎を直接通過させる。カミソリの刃を使って蝸牛の部分を分離します。あるいは、コルティの器官と線条体血管の間に切開する。
線条体血管を螺旋靭帯に接続したままにし、鉗子を使用して脱灰した骨を除去する。次に、蝸牛片をPBSで満たされたペトリ皿の蓋に移す。柱とモディオラーの側面の余分な組織を取り除き、マウント全体が後でできるだけ平らにスライドの上に置かれるようにします。
大きな蝸牛片、特に基底ターンに由来するものは、2つの部分に切断されるべきである。超微細鉗子でテクトリアル膜を慎重に取り除きます。蝸牛片をスライドの上に置き、マウント媒体の滴に入れ、コルティの器官が上を向くようにします。
蝸牛片を矢状面にシフトし、内側の有毛細胞のすぐ近くに螺旋状の縁肢の侵入を探します。この螺旋状の辺縁部の侵入は、中央および基底蝸牛片においてより明確に見ることができる。これらのステップを繰り返して、蝸牛全体と線条体血管全体を顕微鏡スライド上に移します。
カバーはスライドを滑り込ませ、シーリングのために端の周りに黒いマニキュアを加えます。暗闇の中で乾燥させ、摂氏4度で保管してください。BioVoxxelプラグインがロードされたImageJソフトウェアで、デコンボリューションされたスタックのコピーを開きます。
チャンネルを分割するには、「画像」、「カラー」、「チャンネルの分割」の順にクリックします。画像、カラー、チャンネルのマージをクリックして、異なる色を割り当てて、それらをマージします。[画像]をクリックして画像をRGBスタックに変換し、[色]に移動して[RGBにスタック]をクリックします。
明るさとコントラストを調整するには、[画像]、[調整]、[明るさ/コントラスト]の順にクリックします。自動またはスライダーを使用して、シナプス前後の構造と内側の有毛細胞ラベルが背景と区別されるようにします。テキストツールで5つの内側の有毛細胞にラベルを付け、スタック内の目的の位置をクリックします。
次に、[分析]、[ツール]の順に選択し、[ROI マネージャー] を選択します。チェックボックスのラベルにチェックを入れて、ポイントに数字のラベルを付けます。目的の内側の有毛細胞を拡大します。
ポイントツールを右クリックしてマルチポイントモードを選択します。Z次元をスクロールし、シナプス後グルタミン酸パッチに並置されたシナプス前リボンによって識別される機能的なリボンシナプスを数える。目的の構造をすべて選択したら、[ROIマネージャの追加]をクリックし、任意の名前をクリックして[名前の変更]を選択します。
ハンドツールで、次の内側の有毛細胞を完全に表示するように画像を調整します。マルチポイントツールからポイントツールに変更して、以前に保存したデータに句読点を追加しないようにします。次の内側の有毛細胞内の目的の構造をクリックし、マルチポイントツールに変更します。
すべての内側有毛細胞が評価されるまで、ROI Managerで機能的なリボンシナプスを追加し続けます。ROI マネージャーでデータセットをクリックし、[測定] をクリックします。測定されたデータポイントを一覧表示する新しいウィンドウが表示されるのを待ち、[ファイル]と[名前を付けて保存]をクリックして、このリストをスプレッドシートとして保存します。
ROI マネージャーで [すべて表示] を有効にして、画像を保存します。[平坦化]をクリックしてポイントラベルをスタックに永続的に追加し、[同意する]をクリックして変更を保存して閉じます。生後10ヶ月の若いスナネズミの蝸牛からのZスタック突起は、ここで白い破線で輪郭を描かれたミオシン7A標識内有毛細胞が背景と鋭く対照的であったことを示している。
シナプス前リボンは緑色で示した2つの抗CtBP2で標識され、一方シナプス後グルタミン酸パッチは赤色で示された抗GluA2で標識された。生後38ヶ月の老齢スナネズミ由来の蝸牛を自己蛍光消光剤で処理し、シナプス前後構造がはっきりと見える明確な内部有毛細胞を示した。免疫標識の安定性を試験するために、若いスナネズミ由来の同じ蝸牛片を、3ヶ月後および29 1/2ヶ月後に画像化した。
信号対雑音比が低下したにもかかわらず、機能的なシナプスは明瞭で定量化可能であった。切断が失敗した場合でも、残りの組織片を取り付けて、後で蝸牛の全長を最も正確に推定します。このプロトコルからのデータは、電気生理学的または心理物理学的聴力検査に先行し、その後個別に相関している場合、特に貴重です。
