우리의 프로토콜은 다른 기후 지역에서 얻은 토양 샘플을 사용하여 토양의 효모와 곰팡이 다양성을 조사합니다. 이것은 환경 효모 다양성에 대한 통찰력을 제공하고 병원성 종을 추적하는 데 도움이됩니다. 이 프로토콜은 토양에서 효모와 곰팡이를 수확하는 비용 효율적이고 신속한 방법을 제공합니다.
토양 샘플은 칠일 이내에 분리 물을 얻기 위해 완전히 처리 될 수 있습니다. 배양 튜브를 라벨링하고 배지를 하루 미리 준비하는 것과 같은 잘 조직 된 실험 설정은 실험 중에 압도 당하는 느낌을 피하는 열쇠입니다. 멸균 13 밀리리터 배양 튜브 세트를 준비하는 것으로 시작하십시오.
토양 샘플 ID로 라벨을 붙인 다음 혈청 학적 피펫을 사용하여 클로람페니콜과 베노밀로 보충 된 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스트로스 국물 다섯 밀리리터를 각 튜브에 첨가하십시오. 레벨 두 유기체를위한 생물 안전 캐비닛 내부에서는 멸균 된 목재 평면 팁 어플리케이터를 사용하여 약 0.1 그램의 토양을 적절한 배양 튜브로 옮깁니다. 튜브를 첫 번째 정지에 단단히 고정시켜 인큐베이션 중에 공기 교환을 허용하면서 유출을 방지합니다.
다음으로, 배양 튜브를 효모 성장을 최대화하는데 최적으로 간주되는 온도에서 24시간 동안 롤러 드럼에서 인큐베이션한다. 그런 다음 클로람페니콜 및 베노밀이 보충된 효모 추출물 펩톤-덱스트로스 한천 플레이트를 상청액을 고체 배지로 옮기기 전에 토양 샘플 ID로 라벨링한다. 롤러 드럼에서 배양 튜브를 제거합니다.
그런 다음 두 단계의 생물을위한 생물 안전 캐비닛 내부에서 튜브를 간단히 와류하여 바닥에 정착했을 수있는 토양 입자와 세포를 다시 현탁액으로 그립니다. 다음으로, 100 마이크로리터의 상청액을 마이크로피펫을 사용하여 플레이트 상에 옮긴다. 멸균 재사용 가능한 셀 스프레더를 사용하여 액체를 한천 표면 위로 철저하고 고르게 퍼뜨립니다.
이틀에서 사흘의 충분한 배양 시간을 허용한 후, 플레이트에서 두 단계의 생물에 대한 생물안전 캐비닛 내부의 효모 성장이 있는지 검사한다. 박테리아 및 곰팡이 식민지와 쉽게 구별 할 수있는 크림 같은 둥글고 매트 같은 효모를 찾으십시오. 멸균 된 나무 일반 팁 어플리케이터 스틱을 사용하여 각 접시에서 하나의 효모 같은 식민지를 선택하십시오.
각각의 선택된 콜로니를 클로람페니콜 및 베노밀로 보충된 신선한 효모 추출물 펩톤-덱스트로 한천 플레이트 상으로 옮기고 단일 콜로니를 위한 줄무늬를 만든다. 세 개의 개별 줄무늬를 수행하고 모든 줄무늬에 대해 새 어플리케이터 스틱을 사용하십시오. 다음으로, 플레이트 상에서 개발된 신선한 세포를 사용하여 콜로니 중합효소 연쇄 반응을 수행한다.
내부 전사된 스페이서 ITS1 및 ITS4 프라이머를 사용하여 진균 바 코딩 유전자를 증폭시킨다. 효모 균주의 수득된 내부 전사된 스페이서 서열을 비교하여, 국립 생명공학 정보 센터 GenBank 및 UNITE와 같은 공공 데이터베이스에 기탁된 두 개의 서열을 비교하여 종 동일성을 확립한다. Sabouraud 덱스트로스 국물 1 밀리리터가 들어있는 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 토양을 넣고 섭씨 50도에서 이틀에서 나흘 동안 배양하십시오.
토양 접종 국물에서 맥아 추출물 한천 플레이트로 균사체를 옮기려면 먼저 균사체 성장이 보이는 토양 접종물을 확인하고 Sabouraud 덱스트로스 국물을 공기 경계에 추가하십시오. 그런 다음 멸균 된 나무 일반 팁 어플리케이터 스틱을 사용하여 균사체를 맥아 추출물 한천 플레이트의 중앙으로 옮기고 이러한 맥아 추출물 한천 플레이트 세트 37 °C를 3 일 동안 배양하십시오. Aspergillus fumigatus 형태 학적 특성을 가진 균사체의 선택을 위해, 특징적인 녹색 흔들림과 같은 성장을 가진 곰팡이 식민지를 확인하십시오.
레벨 두 유기체에 대한 생물 안전 캐비닛 내부, 살균 된 나무 비행기 팁 어플리케이터 스틱 또는 접종 루프를 사용하여 표면을 한 번 긁어 내고 단일 콜로니를 위해 한천에 스트레칭하여 맥아 추출물 한천 플레이트의 중앙으로 옮겨 코니디아 또는 균사체를 수확하십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 이틀 동안 배양하십시오. 멸균 도포스틱 또는 접종 루프를 사용하여, 생성된 단일 콜로니를 맥아 추출물 한천 상에 계대배양하여 콜로니를 한 번 스트레킹한다.
수확 된 포자를 플레이트의 중앙에 퍼뜨립니다. 멸균 30% 글리세롤 용액을 준비하여 배양 보관을 위해 아스퍼질러스 후미가투스 포자 또는 균사체를 수확한다. 한천 플레이트를 섭씨 37도에서 이틀 동안 인큐베이션한 후, 피펫을 사용하여 30% 글리세롤 용액 한 밀리리터를 흡인하고 이를 아스퍼질러스 후미가투스 콜로니 상에 분산시킨다.
Aspergillus fumigatus 균주의 표현형 확인을 위해 균사 및 포자 스톡의 10 마이크로 리터를 흡인하여 990 마이크로 리터의 물을 첨가하십시오. 이 희석된 포자 현탁액을 소용돌이치고, 현탁액 10 마이크로리터를 표준 현미경 슬라이드 상에 분배한다. 그런 다음 400X 배율에서 화합물 현미경을 사용하여 현탁액을 보고 conidiophores를 찾습니다.
관찰된 conidiophore 형태학을 Aspergillus fumigatus conidiophore 형태학과 비교한다. 아홉 개의 마이크로 위성 유전자좌 각각에 대한 정확한 단편 크기를 결정하려면 단편 분석이 가능한 소프트웨어를 사용하십시오. 모세관 전기영동으로부터 얻은 원시 데이터를 검색하고, 단편화된 분석 소프트웨어를 사용하여 가장 큰 피크를 기준으로 단편 크기를 점수화한다.
다음으로, 단편 크기를 각각의 반복 숫자로 변환하여 참조 균주 Af293의 반복 번호의 단편 크기를 사용하여 아홉 개의 낮은 숫자로 변환한다. 3개국 53개 지역에서 채취한 3개, 826개의 토양 샘플로부터, 1, 473개의 효모 균주를 분리하였다. 각 국가의 최고 배양 온도는 평균 연간 온도를 기준으로 결정되었습니다.
각 국가의 희귀 분석에서 섀넌 다양성 지수는 토양 효모 다양성의 척도로 사용되었습니다. 결과 희박 곡선은 포화 점근선에 접근하여 추가 샘플링이 더 많은 효모 다양성을 산출하지 못했을 가능성이 있음을 나타냅니다. 플레이트 위의 균사체 성장은 Aspergillus fumigatus의 전형적인 녹색 흔들림 형태를 형성했습니다.
다른 내열성 곰팡이 종은 동일한 토양 샘플 내에 존재할 수 있으며 동일한 플레이트 또는 그 자체로 Aspergillus fumigatus를 재배 할 수 있습니다. 아스퍼질러스 후미가투스 코니디오포어 구조를보고 가벼운 현미경을 사용하여 확인한 결과, conidiophores는 스틱 형태학에 공을 가지고 있으며 conidiophores는 uniseriate이며, conidia 사슬에 부착 된 phialides는 구형 소포에 직접 부착됩니다. 크로마토그램 생성 비스세리에이트는 아스퍼질러스 푸미가투스 디뉴클레오타이드, 트리뉴클레오타이드, 및 테트라뉴클레오타이드 짧은 탠덤 반복 유전자좌의 단편 길이를 시각화하는 세 개의 채널을 밝혀냈다.
고품질 최소 스패닝 네트워크는 R 스크립트 plot_poppr_msn 또는 imsn을 사용하여 생성할 수 있습니다. 원리 성분에 대한 차별적 분석은 균주 간의 유전 적 관계를 시각화하는 또 다른 방법입니다. 베노밀과 클로람페니콜을 성장 배지에 첨가하면 곰팡이와 박테리아 성장을 각각 방지하고 효모 선택을 선호합니다.
클로람페니콜은 또한 배지에서 발효를 감소시켜 인큐베이팅 튜브의 가스 축적을 낮춥니다. 토양 샘플에 대한 메타 게놈을 수행하면 문화적 다양성에 대한 추가 정보가 제공됩니다. A.fumigatus 균주의 감수성 테스트는 내성 유전자형의 존재를 확인합니다.
이 프로토콜은 거의 수정하지 않고 다른 효모 및 곰팡이 시스템에 적용 할 수 있습니다. 그것은 문화적 토양 효모 다양성과 그 예측 인자에 대한 조사를 전 세계적으로 촉진했습니다.
